DETERMINATION DE LA TENEUR EN ARSENIC, CADMIUM, PLOMB ET MERCURE DANS LES DENREES ALIMENTAIRES D ORIGINE ANIMALE
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- Alizée Perras
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1 Méthode d analyse en sécurité sanitaire des aliments RÉFÉRENCE : ANSES/LSAliments/LSA-INS Version 05 Janvier 2016 DETERMINATION DE LA TENEUR EN ARSENIC, CADMIUM, PLOMB ET MERCURE DANS LES DENREES ALIMENTAIRES D ORIGINE ANIMALE Minéralisation par micro-ondes en système fermé et mesure par spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (ICP-MS) Laboratoire de Sécurité des Aliments «site de Maisons- Alfort» Laboratoire national de référence éléments traces métalliques dans les denrées alimentaires d origine animale Le présent document est, sous sa forme électronique, mis à la disposition des utilisateurs en tant que méthode d analyse. Ce document est la propriété de l Anses. Toute reproduction, qu elle soit totale ou partielle, n est autorisée qu à la condition expresse que la source soit citée, par exemple en faisant mention de sa référence (incluant sa version et année) et de son titre.
2 Historique de la méthode Une méthode peut être mise à jour afin de prendre en compte des modifications. Les modifications sont repérées dans le texte par un trait dans la marge. Une modification est considérée comme majeure dès lors qu elle concerne des parties clés ou le fond même de la méthode, dont la prise en compte est susceptible d améliorer significativement la portée ou le résultat de la méthode d analyse. Une modification majeure induit en général des adaptations importantes. La méthode ainsi modifiée a fait l objet d une nouvelle validation. Une modification est considérée comme mineure si elle apporte des précisions utiles ou pratiques, reformule les propos pour les rendre plus clairs ou plus précis, rectifie des erreurs bénignes. Les caractéristiques de performance de la méthode ainsi améliorée ne sont pas modifiées; elle n a pas fait l objet d une nouvelle validation. Le tableau ci-dessous récapitule l historique des versions de la présente méthode. Version Nature des modifications Date Principales modifications V 00-28/01/2005 Création V 03 majeure 31/01/2014 Mise à jour des paramètres instrumentaux suite à la recaractérisation de la méthode sur un nouvel appareil (ICP-MS) V 04 mineure 22/12/2015 Harmonisation au nouveau format de méthode ANSES, référencement selon ENNOV (outil électronique de gestion documentaire) et précision prise d essai matrice miel V 05 mineure 22/01/2016 Page de garde, référence de la méthode : application du modèle de l Anses à la méthode «Anses Maisons-Alfort CIME 08 révision 04» 2 / 15
3 Avant-propos La présente méthode a été développée par : Anses - Laboratoire de Sécurité des Aliments de Maisons-Alfort Laboratoire National de Référence Eléments traces métalliques dans les denrées alimentaires d origine animale Adresse : 14 rue Pierre et Marie Curie Maisons-Alfort Cedex Contact : Rachida CHEKRI - rachida.chekri@anses.fr 3 / 15
4 Sommaire Avant-propos Objet et domaine d'application Sigles et définitions Principe de la méthode Appareillage Réactifs Préparation des solutions Décontamination du matériel Échantillons Echantillonnage Conservation des échantillons avant analyse Mode opératoire Préparation des échantillons pour essai Minéralisation par micro-ondes en système fermé Généralités Prise d essai Digestion Exemple de digestion par micro-ondes (système Anton paar) Spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (ICP-MS) Généralités Paramètres instrumentaux Les interférences Procédure d optimisation de l appareil (daily check) Préparation de la gamme d étalonnage et des échantillons Séquence analytique type pour l ICP-MS Résultats Contrôle qualité Calculs et expression des résultats / 15
5 Avertissements et précautions de sécurité Il convient que l'utilisateur de la présente méthode connaisse bien les pratiques courantes de laboratoire. Il incombe à l'utilisateur d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de s'assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur. Il est essentiel que les manipulations conduites conformément à la présente méthode soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation appropriée. Lors de l utilisation de produits dangereux tels que les acides forts, il est nécessaire de travailler sous une hotte ventilée, de porter une blouse, des lunettes de sécurité et des gants de protection. En cas de contact accidentel, rincer abondamment à l eau courante. Les réactifs qui nécessitent des mesures particulières de sécurité sont précisés dans le texte. 5 / 15
6 1 Objet et domaine d'application Le texte décrit une méthode par spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (ICP-MS) pour la détermination des teneurs en arsenic, cadmium, plomb et mercure dans les produits alimentaires d origine animale après minéralisation par micro-ondes en système fermé. 2 Sigles et définitions Teneurs en arsenic (As), cadmium (Cd), plomb (Pb) et mercure (Hg) dans les produits alimentaires : teneurs en ces analytes, déterminées par le mode opératoire décrit dans le présent texte, exprimées en mg.kg Principe de la méthode 3-1 Digestion de l échantillon en présence d acide nitrique dans un récipient hermétiquement clos placé dans un conteneur sous pression, soumis à une température et à une pression élevée à l aide d un four à micro-ondes en système fermé. 3-2 Préparation de la solution d essai par reprise du minéralisat avec de l eau déionisée. 3-3 Mesure des teneurs arsenic, cadmium, plomb et mercure par spectrométrie de masse couplée à un plasma induit : la solution d essai, obtenue par minéralisation par micro-ondes en système fermé comme décrit ci-dessus, est nébulisée et l aérosol transféré dans un plasma d argon induit par haute fréquence (ICP). La température élevée est utilisée pour désolvater l aérosol, atomiser et ioniser les éléments. Les ions sont extraits du plasma par un jeu de deux cônes et transférés vers un spectromètre de masse où ils sont séparés selon leur rapport masse sur charge puis détectés. 4 Appareillage Avertissement : Des appellations commerciales ou fournisseurs peuvent être mentionnés dans le descriptif des appareils et matériels nécessaires à la mise en œuvre de la présente méthode. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la méthode et ne signifie nullement que l'anses recommande l'emploi exclusif de ces matériels. Des matériels équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats. Matériel courant de laboratoire et notamment : 4.1 Balance analytique de résolution 0,1 mg. 4.2 Fioles jaugées de 50 et 100 ml (en verre borosilicaté), classe A. 4.3 Pipettes automatiques à volumes variables (Biohit ou équivalent). 4.4 Récipients de digestion (Matras) en quartz avec bouchons de sécurité (Anton Paar ou équivalent). 4.5 Flacons en polypropylène avec bouchons étanches d une capacité de 50 ml (Corning ou équivalent). 4.6 Micro-ondes système fermé (Microwave Anton Paar ou équivalent). 4.7 Spectromètre de masse couplé à un plasma induit (7700x AGILENT ou équivalent). 6 / 15
7 5 Réactifs Avertissement : Des appellations commerciales ou fournisseurs peuvent être mentionnés dans le descriptif des produits nécessaires à la mise en œuvre de la présente méthode. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la méthode et ne signifie nullement que l'anses recommande l'emploi exclusif de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats. 5.1 Acide nitrique HNO 3 d une concentration supérieure ou égale à 65 % (Suprapur ou équivalent) 5.2 Solutions étalons individuelles prêtes à l emploi de concentration 1000 mg.l -1 : arsenic, cadmium, plomb et mercure (Courtage Analyses Services, LGC Standard ou équivalent) 5.3 Solution étalon d or prête à l emploi de concentration 1000 mg.l -1 (Courtage Analyses Services, LGC Standard ou équivalent) 5.4 Solutions étalons de standards internes prêtes à l emploi de concentrations 1000 mg.l -1 : scandium (Sc), indium (In), bismuth (Bi), rhénium (Re), yttrium (Y) (Courtage Analyses Services, LGC Standard ou équivalent) Les réactifs listés ci-dessus nécessitent des mesures particulières de sécurités. Les réactifs Plomb et Arsenic sont classés CMR. 6 Préparation des solutions L eau utilisée au cours des différentes manipulations est déionisée (type Milli Q+) 6.1 Acide nitrique à 10 % (v/v) à partir du réactif (5-1). 6.2 Acide nitrique à 6 % (v/v) à partir du réactif (5-1). 6.3 Solution d étalonnage d arsenic, de cadmium, de mercure et de plomb à 1 mg.l -1 dans HNO 3 à 6 % : dans une fiole de 100 ml (4-2), introduire à l aide de pipettes (4-3), 100 µl de la solution étalon d arsenic, de cadmium, de mercure et plomb (5-2), et 6 ml d acide nitrique (5-1) puis compléter avec de l eau déionisée. 6.4 Solution étalon de standards internes de scandium, d indium, de bismuth, de rhénium et d yttrium à 1 mg.l -1 et d or à 10 mg.l -1 dans HNO 3 à 6 % : dans une fiole de 100 ml (4-2), introduire à l aide de pipettes (4-3), 100 µl des solutions étalons de standards internes (5-4) et 1 ml de la solution étalon d or (5-3) et 6 ml d acide nitrique (5-1) puis compléter avec de l eau déionisée 7 Décontamination du matériel La décontamination du matériel se fait selon la procédure ET2M «nettoyage de la vaisselle de laboratoire» 7 / 15
8 8 Échantillons 8.1 Echantillonnage Le laboratoire n est pas responsable de l échantillonnage. L échantillon doit être stocké selon sa nature de façon à éviter toute détérioration ou modification de sa composition (Cf. procédure gestion des produits soumis à essais en ET2M). 8.2 Conservation des échantillons avant analyse La température des réfrigérateurs et des congélateurs n a pas d incidence sur les produits soumis à essais. Celle-ci est néanmoins surveillée par une centrale de mesure pour indication. Le stockage des échantillons se fait dans ce type d enceinte afin de permettre une bonne conservation. 9 Mode opératoire 9.1 Préparation des échantillons pour essai Porter l échantillon à température ambiante, homogénéiser l échantillon et procéder à la prise d essai 9.2 Minéralisation par micro-ondes en système fermé NB : le but de ce paragraphe est de rester général tout en imposant une limite dans la prise d essai et une exigence en température de digestion Généralités La digestion d échantillons de composition non connue exige des précautions car une surpression due à une trop grande prise d essai risque de rompre la membrane de sécurité du récipient de digestion. Dans tous les cas, il convient que la quantité de matrice soit strictement conforme aux recommandations du fabriquant. Ne jamais perdre de vue que la digestion des échantillons riches en carbone (sucres, graisses) peut entraîner des explosions. A toutes les étapes, il faut s assurer que le niveau de contamination soit le plus faible possible (décontamination de la verrerie, bonne pratique de laboratoire) Prise d essai Transférer une quantité d échantillon comprise entre 0,2 g et 0,5 g pour les produits secs et les miels et entre 0,5 g et 1 g pour les produits frais dans le récipient de digestion (4.4). Ajouter 3 ml d acide nitrique (5.1), agiter et fermer le récipient, laisser agir environ 30 min afin de faciliter la digestion puis ajouter 3 ml d eau déionisée et fermer le récipient Essai à blanc Pour vérifier qu il n y a pas eu de contamination, inclure dans chaque série d analyses un essai à blanc : essai réalisé en l absence de matrice avec les mêmes quantités de réactifs et soumis à la digestion en même temps que les échantillons. 8 / 15
9 Matériaux de référence ou ajout Pour contrôler la méthode d analyse, inclure dans chaque série d analyses un matériau de référence et/ou un ajout contenant une quantité connue des éléments à doser. Ce matériau de référence ou cet ajout doit être soumis à la digestion dans les mêmes conditions que les échantillons Digestion La programmation du four (par exemple, puissance en fonction de la durée) s effectue suivant les recommandations du fabricant Programme de digestion L état final de digestion des échantillons dépend de la température de digestion. En général, plus celle-ci est élevée, moins il reste de carbone résiduel dans les solutions et meilleure sera la qualité du minéralisat. Pour les systèmes micro-ondes, la durée type de digestion est comprise entre 15 minutes et 30 minutes. Généralement, un programme de four inclut une phase à faible puissance pendant quelques minutes, suivie d une ou plusieurs phases à forte puissance. Une augmentation graduelle entre les phases choisies est recommandée afin d éviter des pics de pression à l intérieur du récipient Régulation La régulation pendant la digestion peut se faire en température ou en pression, sur un ou plusieurs échantillons. Cette régulation dépend du type de système micro-ondes utilisé Refroidissement Pour faire diminuer la pression à l intérieur du récipient de digestion, une phase de refroidissement est inclue à la fin du programme Exemple de digestion par micro-ondes (système Anton paar) Bien homogénéiser l échantillon. Dans les récipients de digestion (4.4), peser de 0,2 g à 1 g d échantillon au mg près (selon produit frais ou sec cf. paragraphe 9.2.2). Ajouter 3 ml d acide nitrique (5.1), laisser agir 30 min minutes environ puis ajouter 3 ml d eau déionisée. Installer les matras sur le rotor, puis appliquer le programme. Le programme utilisé pour cette méthode d analyse est le programme CIME 08 et 11 ci-dessous : Etapes Puissance (W) Rampe (min) Palier (min) *Vitesse de refroidissement * La vitesse de ventilation peut varier de façon croissante de 0 à 3 (unité arbitraire). 9 / 15
10 La solution de digestion doit être claire, sans particules en suspension et son volume pratiquement équivalent à celui précédant la digestion. Une diminution significative du volume indique que le matras n était pas suffisamment hermétique. Dans ce cas, il faut procéder à une nouvelle digestion. NB : le programme utilisé est valable à condition que la digestion s applique à la totalité des récipients de digestion (8 pour le microwave Anton Paar) (4.6). Pour un nombre inférieur d échantillons, les récipients restants peuvent être traités comme blancs. 9.3 Spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (ICP-MS) Généralités A toutes les étapes, le niveau de la contamination doit être vérifié pour s assurer qu il est le plus faible possible Paramètres instrumentaux L analyse est effectuée en mode standard. Les paramètres ci-dessous sont donnés à titre d exemple pour un 7700x AGILENT. Ils peuvent différer selon les ICP-MS. Ils doivent être ajustés à chaque utilisation de l appareil afin d obtenir la meilleure optimisation. Le système ISIS (système d introduction rapide d échantillon) qui permet de réduire le temps d analyse grâce à l introduction rapide de l échantillon (par le biais d une seconde pompe péristaltique) peut être utilisé le cas échéant. Les paramètres d acquisition sont identiques à une analyse sans système ISIS excepté le temps d introduction d échantillon qui est réduit. 10 / 15
11 Conditions opératoires Nébuliseur : Type concentrique Micromist, débit à 0,4 ml.min -1 Chambre de nébulisation à double enceinte refroidie Générateur : Puissance incidente : 1500 W Puissance réfléchie : < 5W Débit de gaz : Plasma : 15 L.min -1 Vide : Expansion : 2,0 mbar Nébuliseur (carrier gaz) : 1 L.min -1 Nébuliseur pompe (0,1 rps) Analyseur : 2,10-4 mbar Auxiliaire : 0,9 L.min -1 Cônes : Cône skimmer : nickel 1,0 mm orifice Cône échantillonneur : nickel 0,4 mm orifice Paramètres d acquisition de la méthode d analyse Temps de prélèvement de l échantillon : 30 sec Vitesse de prélèvement de l échantillon: 0,5 rps Temps de stabilisation : 20 sec Temps de pré-analyse : 20 sec Temps de rinçage de l aiguille de prélèvement entre chaque échantillon ou étalon (Port : HNO 3 6%): 30 sec Vitesse de rinçage de l aiguille de prélèvement entre chaque échantillon ou étalon (Port : HNO 3 6%) : 0,1 rps Temps de rinçage dans HNO 3 10 % : 50 sec Temps de rinçage dans HNO 3 6 % : 40 sec Vitesse de rinçage dans HNO 3 10 % et 6 % : 0,5 rps Temps d acquisition : 73,5 sec Temps d analyse (acquisition + rinçages) 4 min Paramètres d acquisition de la méthode d analyse avec utilisation du système ISIS Temps de chargement de la boucle (150 cm pour un temps d acquisition de 74 sec environ) : 12 sec Vitesse de chargement de la boucle : 1,0 rps Temps de rinçage de l aiguille de prélèvement (port) : 18 sec / Vitesse de rinçage de la seringue : 0,5 rps Temps de rinçage après acquisition (port) : 12 sec / Vitesse de rinçage après acquisition : 1,0 rps Temps d analyse (acquisition + rinçage) 3 min 11 / 15
12 9.3.3 Les interférences Les interférences isotopiques Le tableau ci-dessous présente les interférences isotopiques sur les différents isotopes de l arsenic, du cadmium, du plomb et du mercure : Analyte m/z Abondance relative Isotopes interférents As Cd ,22 0,88 12,39 12,75 24,07 12,26 28,86 7,58 Pd (27,33) Pd (26,71) Pd (11,81) Sn (0,96) In (4,28) Sn (0,66) Sn (14,30) Hg Pb ,146 10,02 16,84 23,13 13,22 29,80 6,85 1,48 23,6 22,6 52,3 Pt (25,3) Pt (7,21) Pb (1,48) Hg (6,85) Les interférences isotopiques désignent le chevauchement de deux pics correspondant à deux isotopes de même masse atomique. Pour diminuer ces interférences on dispose de plusieurs moyens selon les cas : - Si l isotope libre d interférence est assez sensible, on l utilisera comme analyte. - Si l analyte répond mieux que son isotope interférent (en tenant compte des concentrations et des sensibilités), la quantité d analyte pourra être déterminée sans correction préalable. - Si l analyte à la même réponse que l interférent, une correction est nécessaire (elle est le plus souvent intégrée au logiciel) : IA = Im/z [I2 x (a1/a2)] Où IA est l intensité du pic de l analyte Im/z est l intensité mesurée I2 l intensité d un second isotope libre de l isotope interférent a1 abondance de l isotope interférent a2 abondance du second isotope libre de l interférent. - Si le second isotope de l ion interférent n est pas libre, il faut faire une seconde correction. - Si l analyte répond moins bien que son interférent, on ne pourra pas le détecter. 12 / 15
13 Exemple de correction : 114 Cd I( 114 Cd) = I( 114 mass) 0,027* 118 Sn Avec : 0,027 = Abondance 114 Sn / Abondance 118 Sn Les interférences dues aux ions moléculaires Des espèces atomiques prédominantes présentes dans le plasma, provenant du plasma même (Ar, H, O, N, C), des acides ou des solvants employés peuvent former des ions moléculaires par recombinaison à la sortie de l interface. Le tableau ci-dessous présente les interférences dues aux ions moléculaires sur l arsenic, le cadmium, le plomb et le mercure : Analyte M/z Interférence As Cd Hg Pb Ar 35 Cl, 40 Ca 35 Cl MoO +, MoOH + MoO +, MoOH + WO +, RuRu +, HgH + Pour minimiser ces interférences, il est recommandé d utiliser de l acide nitrique qui n apporte pas d espèces interférentes supplémentaires (contrairement à l acide sulfurique). La formation de ces espèces dépend de la puissance du plasma, du débit de la nébulisation et de la matrice. Exemple de correction: 40 Ar 35 Cl PbH + PbH + I( 75 As) = I( 75 mass) 3,127* [I( 77 mass) + 2,733*I( 82 mass) 2,757 * I ( 83 mass)] Avec 3,127 = Abondance 40 Ar 35 Cl / Abondance 40 Ar 37 Cl 2,733 = (Abondance 40 Ar 35 Cl / Abondance 40 Ar 37 Cl) * (Abondance 77 Se / Abondance 82 Se) et 2,757 = (Abondance 40 Ar 35 Cl / Abondance 40 Ar 37 Cl) * (Abondance 77 Se / Abondance 82 Se) *(Abondance 82 Kr / Abondance 83 Kr) Les interférences non spectrales ou effets matrices Les interférences non spectrales (ou effets de matrice) sont dues à la différence de comportement des analytes en milieu simple (étalon) et en présence d une matrice plus complexe (échantillons). On dilue au maximum les échantillons afin de minimiser ces interférences. Enfin, l ajout d étalons internes permet de compenser les changements de sensibilité liés notamment à la présence en sels dissous. NB : la présence de carbone peut entraîner une surestimation des résultats pour l arsenic et une sousestimation des résultats pour le plomb. 13 / 15
14 9.3.4 Procédure d optimisation de l appareil (daily check) Se référer à la notice d utilisation de l ICP-MS pour l utilisation de l appareil Préparation de la gamme d étalonnage et des échantillons Gamme d étalonnage Dans les flacons en polypropylène avec bouchons étanches d une capacité de 50 ml (4.5), introduire à l aide d une pipette (4.3) : 0, 100, 250, 375, 500 et 1000 µl de la solution d étalonnage d arsenic, cadmium, mercure et de plomb (6.3) ; 100 µl de la solution de standards internes et d or Au (6.4) ; 3 ml d acide nitrique (5.1) ; Compléter avec de l eau déionisée. Les concentrations en acide nitrique ainsi qu en standards internes / Au doivent être semblables dans les échantillons et dans les solutions d étalonnage Les solutions d étalonnage contiennent respectivement 0 ; 2 ; 5 ; 7,5 ; 10 ; 20 µg.l -1 d arsenic, plomb, cadmium et de mercure, et uniformément 2 µg.l -1 de standards internes et 20 µg.l -1 d or Tableau récapitulatif des concentrations des étalons (µ.l -1 ) Standard 0 Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 Sc, In, Bi, Y, Re Au As, Pb, Cd, Hg , Echantillons Après digestion, ouvrir les récipients, puis rincer les couvercles et les parois à l eau déionisée, reprendre dans les flacons en polypropylène (4.5), ajouter 100µL de la solution de standards internes / Au (6.4) et ajuster à 50 ml avec de l eau déionisée. Procéder de même avec le blanc de minéralisation et le matériau de référence ou l ajout Séquence analytique type pour l ICP-MS Se référer à la notice d utilisation de l ICP-MS pour l utilisation de l appareil. Analyser successivement les solutions d'étalonnage ( ), l'essai à blanc, le matériau de référence et/ou ajouts et les solutions pour essai ( ). Un étalon correspondant au troisième point de la gamme d étalonnage (standard 2) est analysé tous les 8 à 10 échantillons environ, selon la longueur de la séquence, afin de suivre la dérive de l appareil. 14 / 15
15 Un rinçage avec de l acide nitrique dilué à 10 % (v/v) (6.1) et de l acide nitrique dilué à 6 % (v/v) (6.2) est réalisé entre chaque mesure. 10 Résultats 10.1 Contrôle qualité Les différents contrôles qualité internes mis en place sont des outils qui permettent d assurer la fiabilité des résultats d une analyse suivant des critères prédéfinis. Ils consistent en une vérification des résultats par l analyse de matériau(x) de référence et/ou d ajouts, d étalons de contrôle, d essais à blanc conduits en parallèle lors de chaque série d analyse 10.2 Calculs et expression des résultats Le calcul des courbes d étalonnage se fait en mode linéaire. Les teneurs (T) en divers éléments dans l échantillon, exprimées en mg.kg -1 sont égales à : ( ) Ce = concentration de la solution pour essai, en µg.l -1. Cb = concentration de la solution de l essai à blanc, en µg.l -1. V = volume de reprise, en L m = masse de la prise d essai, en g. f = facteur de dilution éventuel. t = facteur d humidité éventuel ou facteur de correction matière sèche/matière fraîche éventuel. 15 / 15
4. Conditionnement et conservation de l échantillon
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