LAP Test Kit. NOTE: Precipitate formation or color variation from straw to pink in the Color Developer is common and does not affect test performance.

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1 NOTE: Precipitate formation or color variation from straw to pink in the Color Developer is common and does not affect test performance. LAP Test Kit (English) INTENDED USE Remel LAP Test Kit is a rapid assay recommended for use in qualitative procedures for the detection of leucine aminopeptidase activity in streptococci and related genera. SUMMARY AND EXPLANATION In 1984, Colman and Ball reported that, unlike streptococci, Aerococcus species did not produce leucine aminopeptidase (LAP). 1 Fertally and Facklam confirmed this finding in 1987 while investigating methods of streptococci identification. 2 They found Aerococcus strains to be consistently negative for leucine aminopeptidase, while strains of Enterococcus and Streptococcus would give positive reactions. LAP, in conjunction with PYR and other conventional tests, is an important parameter in the identification of Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, and related genera. 3,4,5 PRINCIPLE Filter paper disks are impregnated with leucine-β-naphthylamide which serves as a substrate for the detection of leucine aminopeptidase. Following hydrolysis of the substrate by the enzyme, the resulting β-naphthylamine produces a red color upon the addition of ρ-dimethylaminocinnamaldehyde (Color Developer). REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED 1. LAP Disks (1 vial of 50) Reactive Ingredient: L-leucine-β-naphthylamide hydrochloride 2. Color Developer (1 bottle, 4.5 ml) Reactive Ingredient: 0.01% ρ-dimethylaminocinnamaldehyde 3. Applicator Sticks (1 vial of 50) PRECAUTIONS This product is For In Vitro Diagnostic Use and should be used by properly trained individuals. Precautions should be taken against the dangers of microbiological hazards by properly sterilizing specimens, containers, and media after use. Directions should be read and followed carefully. Caution! The Color Developer is toxic and may cause harm to the environment. Harmful by inhalation, contact with skin or eyes, or if swallowed. May impair fertility or cause harm to unborn child. Refer to the Material Safety Data Sheet for detailed information on reagent chemicals. STORAGE This product is ready for use and no further preparation is necessary. The product should be stored in the dark in its original container at 2-8 C until used. Do not freeze or overheat. Allow product to come to room temperature before use. Do not incubate prior to use. PRODUCT DETERIORATION This product should not be used if (1) the color of the disks has changed from white, (2) the expiration date has passed, or (3) there are other signs of deterioration. Protect disks from moisture by removing only those disks necessary for testing from the vial. Promptly replace the cap and return the vial to 2-8 C. SPECIMEN COLLECTION, STORAGE, AND TRANSPORT Specimens should be collected and handled following recommended guidelines. 5 The LAP test should be performed on pure or isolated cultures of catalase-negative, gram-positive cocci which are hours old. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED (1) Loop sterilization device, (2) Inoculating loop, swab, collection containers, (3) Incubators, alternative environmental systems, (4) Supplemental media, (5) Quality control organisms, (6) Forceps, (7) Demineralized water. Optional Materials: (1) Microscope slide, (2) Micropipette or microbiological loop (10 µl). PROCEDURE 1. Using forceps, place the disk on a clean microscope slide or in the lid of an agar plate free from excess moisture. 2. Moisten the disk slightly with 5-10 µl of demineralized water using an adjustable micropipette or a 10-µl inoculating loop. DO NOT OVERSATURATE. Alternatively, the disk may be placed on the agar surface of the plated medium for rehydration. 3. Pick up a visible paste from an hour culture using a sterile loop or wooden applicator stick. 4. Rub the inoculum gently into a small area of the disk. 5. Incubate at room temperature for 5 minutes. 6. Add one (1) drop of Color Developer to the disk. 7. Allow up to one minute for a color change. INTERPRETATION OF THE TEST Positive Test - Pink to red color development within one minute of applying Color Developer Negative Test - No color change or a slight yellow color development within one minute of applying Color Developer EXPECTED VALUES 4,5,6 Aerococcus urinae (+) Helcococcus ( ) Aerococcus viridans ( ) Lactococcus (+) Enterococcus (+) Leuconostoc ( ) Gemella haemolysans ( ) Pediococcus (+) Gemella morbillorum (+) Streptococcus (+) Globicatella ( ) QUALITY CONTROL All lot numbers of the LAP Test Kit have been tested using the following quality control organisms and have been found to be acceptable. Testing of control organisms should be performed in accordance with established laboratory quality control procedures. If aberrant quality control results are noted, patient results should not be reported. CONTROL INCUBATION RESULTS Enterococcus faecalis Aerobic, 5 min. Positive ATCC 25 C Aerococcus viridans ATCC Aerobic, 5 25 C Negative

2 LIMITATIONS 1. Color development noted after one minute should be disregarded. 2. False negative reactions may occur if inadequate inoculum is used. 3. It should be emphasized that this test is only part of the overall scheme for identification. Further biochemical and serological testing may be necessary for definitive identification. PERFORMANCE CHARACTERISTICS 7 An evaluation of 114 strains of streptococci and related genera showed 97% correlation with expected values. Genus No. Tested No. Positive % Positive Aerococcus Leuconostoc Gemella Streptococcus Enterococcus* Lactococcus Pediococcus *All E. faecalis and E. faecium, which comprise >95% of the enterococci isolated from clinical specimens, were LAP positive in this evaluation (R. Facklam, unpublished data). BIBLIOGRAPHY 1. Colman, G. and L.C. Ball J. Appl. Bacteriol. 57: Fertally, S. and R. Facklam J. Clin. Microbiol. 25: Ruoff, K.L., D.R. Kuritzkes, J.S. Wolfson, and M.J. Ferraro J. Clin. Microbiol. 26: Facklam, R. and J.A. Elliott Clin. Microbiol. Rev. 8: Facklam, R.R Clin. Microbiol. Newsl. 23: Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken Manual of Clinical Microbiology. 8 th ed., Vol. 1. ASM, Washington, D.C. 7. Data on file Remel Inc., Lenexa, KS. PACKAGING REF , LAP Test Kit Tests/Kit Symbol Legend REF IVD LAB LOT Catalog Number In Vitro Diagnostic Medical Device For Laboratory Use Consult Instructions for Use (IFU) Temperature Limitation (Storage Temp.) Batch Code (Lot Number) Use By (Expiration Date) EC REP European Authorized Representative ATCC is a registered trademark of American Type Culture Collection. IFU , Revised January 18, 2006 Printed in U.S.A Santa Fe Drive, Lenexa, KS 66215, USA General Information: (800) Technical Service: (800) Order Entry: (800) Local/International Phone: (913) International Fax: (913) Website: remel@remel.com

3 Kit de test de LAP (Français) INDICATION Le kit de test de LAP de Remel est un dosage rapide indiqué dans les procédures qualitatives pour la détection de l activité de la leucine aminopeptidase dans les streptocoques et les genres apparentés. RÉSUMÉ ET EXPLICATION En 1964, Colman et Ball ont signalé que, à la différence des streptocoques, les espèces du genre aerococcus ne produisent pas de leucine aminopeptidase (LAP). 1 En 1987, Fertally et Facklam ont confirmé cette conclusion en examinant les méthodes d identification des streptocoques. 2 Ils trouvèrent que les couches d aerococcus étaient systématiquement négatives à la leucine aminopeptidase, tandis que les couches des genres enterococcus et streptococcus produisaient des réactions positives. La LAP, conjointement avec le PYR et d autres test conventionnels, représente un paramètre important dans l identification des genres aerococcus, leuconostoc, pediococcus et d autres genres apparentés. 3,4,5 PRINCIPE Des disques de papier filtre sont imprégnés de leucine-βnaphthylamide qui sert de substrat pour la détection de la leucine aminopeptidase. À la suite de l hydrolyse du substrat par l enzyme, la β-naphthylamine produit une coloration rouge si on ajoute du ρ- diméthylaminocinnamaldéhyde (révélateur de couleur). RÉACTIFS ET MATÉRIEL FOURNIS 1. Disques de LAP (1 flacon de 50) Ingrédient réactif: chlorhydrate de L-leucine-β-naphthylamide 2. Révélateur de couleur (1 bouteille de 4,5 ml) Ingrédient réactif: 0,01 % ρ-diméthylaminocinnamaldéhyde 3. Bâtonnets applicateurs (1 flacon de 50) PRÉCAUTIONS Ce produit exclusivement destiné à un usage diagnostique in vitro ne doit être utilisé que par des personnes dûment formées. Toutes les précautions contre les risques microbiologiques doivent être prises et il est indispensable de bien stériliser les prélèvements, les récipients et les milieux après usage. Toutes les instructions doivent être lues attentivement et scrupuleusement respectées. Attention! Le révélateur de couleur est toxique et peut être nuisible pour l environnement. Nocif en cas d inhalation, d ingestion ou de contact avec la peau ou les yeux. Risque de réduire la fécondité. Dangereux pour l enfant à naître. Se reporter aux fiches signalétiques pour les informations détaillées sur les réactifs chimiques. CONSERVATION Ce produit étant prêt à être utilisé n a pas besoin d autre préparation. Il doit être stocké dans l obscurité, dans son conditionnement d origine et à une température de 2 à 8 C jusqu à utilisation. Ne pas congeler ou surchauffer. Attendre que les produits soient à température ambiante avant de les utiliser. Ne pas incuber avant l usage. DÉTÉRIORATION DU PRODUIT Ce produit ne doit pas être utilisé (1) si la couleur blanche des disques a changé, (2) la date de péremption est dépassée ou (3) si d autres signes de détérioration sont présents. Pour protéger les disques de l humidité, ne retirer du flacon que ceux qui sont nécessaires pour le test. Reboucher immédiatement le flacon avant de le remettre en place à une température comprise entre 2 et 8 C. REMARQUE: La formation de précipité ou une variation de couleur de paille à rosé dans le révélateur de couleur est normale et n a aucune influence sur la performance du test. COLLECTE, CONSERVATION ET TRANSPORT DE PRÉLÈVEMENTS Les prélèvements doivent être recueillis et manipulés conformément aux directives en usage dans la profession. 5 Le test de LAP doit être exécuté sur des cultures pures ou isolées de coques gram-positives, négatives à la catalase, de 18 à 72 heures. MATÉRIEL REQUIS NON FOURNI (1) Dispositif de stérilisation en boucle, (2) boucle à inoculation, écouvillon, récipients de collecte (3) incubateurs, systèmes environnementaux alternatifs, (4) milieux supplémentaires, (5) organismes de contrôle de qualité, (6) pinces, (7) eau déminéralisée. Matériel facultatif: (1) Lame de microscope, (2) micropipettes ou boucles microbiologiques (10 µl). PROTOCOLE 1. En utilisant des pinces, placer le disque sur une lame de microscope propre ou dans le couvercle d une plaque de gélose sans excédent d humidité. 2. Humecter légèrement le disque avec 5 à 10 µl d eau déminéralisée en utilisant une micropipette réglable ou une boucle à inoculation de 10 µl. NE PAS SURSATURER. Il est également possible de placer le disque sur la surface de gélose de la plaque pour la réhydratation. 3. Prendre une «pâte» visible d une culture de 18 à 72 heures en utilisant une boucle stérile ou un bâtonnet applicateur en bois. 4. Frotter doucement l inoculum contre une petite zone du disque pour le faire pénétrer. 5. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. 6. Ajouter au disque une (1) goutte de révélateur de couleur. 7. Attendre jusqu à une minute que la couleur change. INTERPRÉTATION DU TEST Test Positif - Développement d une couleur rose à rouge après une minute d application du révélateur de couleur Test Négatif - Pas de changement de couleur ou apparition d une légère coloration jaune dans la minute suivant l application du révélateur de couleur VALEURS ATTENDUES Aerococcus urinae (+) Helcococcus ( ) Aerococcus viridans ( ) Lactococcus (+) Enterococcus (+) Leuconostoc ( ) Gemella haemolysans ( ) Pediococcus (+) Gemella morbillorum (+) Streptococcus (+) Globicatella ( )

4 CONTRÔLE DE QUALITÉ Tous les numéros de lots du kit de test de LAP ont été testés avec les organismes de contrôle de qualité suivants et reconnus acceptables. Les tests des organismes de contrôle effectués doivent satisfaire aux critères établis pour les procédures de contrôle de qualité en laboratoire. En cas de résultats de contrôle de qualité aberrants, les données patient ne doivent pas être enregistrées. CONTRÔLE INCUBATION RÉSULTATS Enterococcus faecalis Aérobie, 5 min. Positif ATCC à 25 C Aerococcus viridans ATCC Aérobie, 5 min. à 25 C Négatif LIMITES 1. Un développement de la couleur noté au-delà d une minute doit être ignoré. 2. Des réactions faussement négatives peuvent se produire si on utilise un inoculum inadéquat. 3. Il faut toujours considérer que ce test n est qu une partie d un processus d identification plus large. Des tests biochimiques et sérologiques ultérieurs pourront être nécessaires pour obtenir une identification définitive. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE 7 Une évaluation de 114 souches de streptocoques et genres apparentés a montré une corrélation de 97 % avec les valeurs attendues. Genre Nbre testés Nbre positifs % positif Aerococcus Leuconostoc Gemella Streptococcus Enterococcus* Lactococcus Pediococcus * Toutes les souches d E. faecalis et d E. faecium, qui comprennent >95 % des entérocoques isolés des échantillons cliniques, étaient LAP positives dans cette évaluation (R. Facklam, données non publiées). BIBLIOGRAPHIE 1. Colman, G. et L.C. Ball J. Appl. Bacteriol. 57: Fertally, S. et R. Facklam J. Clin. Microbiol. 25: Ruoff, K.L., D.R. Kuritzkes, J.S. Wolfson et M.J. Ferraro J. Clin. Microbiol. 26: Facklam, R. et J.A. Elliott Clin. Microbiol. Rev. 8: Facklam, R.R Clin. Microbiol. Newsl. 23: Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller et R.H. Yolken Manuel de microbiologie clinique. 8 ème éd., Vol. 1. ASM, Washington, D.C. 7. Données sur fichier Remel Inc., Lenexa, KS. CONDITIONNEMENT REF , Kit de test de LAP kits de test Légendes des symboles REF IVD LAB LOT Numéro de référence Dispositif médical de diagnostic in vitro Pour l usage de laboratoire Lire les instructions avant utilisation (IFU = mode d emploi) Limites de température (stockage) Code de lot (numéro) À utiliser avant le (date de péremption) EC REP Représentant autorisé pour l'ue ATCC est une marque déposée d American Type Culture Collection. IFU , révisé le Imprimé aux États-Unis d Amérique Santa Fe Drive, Lenexa, KS 66215, États-Unis Renseignements : (800) Service technique : (800) Service commercial : (800) (États-Unis) Téléphone (international) : +1 (913) Télécopie (international) : +1 (913) Site Web : remel@remel.com

5 LAP Test Kit (Deutsch) INDIKATIONEN Das Remel LAP Test Kit ist eine Schnellprobe für die Verwendung bei der Erkennung von Leucin-Aminopeptidase-Aktivität in Streptokokken und verwandten Genera. ZUSAMMENFASSENDE ERKLÄRUNG Colman und Ball haben 1984 gezeigt, dass die Spezies Aerococcus, anders als Streptokokken, keine Leucin-Aminopeptidase (LAP) produzieren. 1 Fertally und Facklam bestätigten dieses Ergebnis in 1987, während sie Methoden zum Nachweis von Streptokokken untersuchten. 2 Sie haben festgestellt, dass Aerococcus- Stammkulturen konsistent negativ für Leucin-Aminopeptidase sind, während Stammkulturen von Enterococcus und Streptococcus positive Reaktionen produzieren. LAP ist, zusammen mit PYR und anderen konventionellen Tests, ein wichtiger Parameter beim Nachweis von Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus und verwandten Genera. 3,4,5 TESTPRINZIP Nährboden-Filterpapier wurde mit Leucin-β-Naphthylamid imprägniert, das als Substrat für den Nachweis für Leucin-Aminopeptidase dient. Im Anschluss einer Hydrolyse des Substrats durch das Enzym produzierte das daraus resultierende β-naphthylamin bei der Zugabe von ρ-dimethylaminocinnamaldehyd (Farbentwickler) eine rote Farbe. REAGENZIEN UND IM LIEFERUMFANG ENTHALTENE MATERIALIEN 1. LAP Nährböden (1 Flasche à 50) Reaktiver Inhaltstoff: L-Leucin-β-Naphthylamid-Hydrochlorid 2. Farbentwickler (1 Flasche, 4,5 ml) Reaktiver Inhaltstoff: 0.01% ρ-dimethylaminocinnamaldehyd 3. Abstrichtupfer (1 Flasche à 50) VORSICHTSMASSNAHMEN Dieses Produkt ist für die Verwendung in der In-Vitro-Diagnostik bestimmt und sollte nur von entsprechend geschulten Personen verwendet werden. Es sind Vorsichtsmaßnahmen gegen die von mikrobiologischen Materialien ausgehenden Gefahren zu ergreifen, indem Proben, Container und Medien nach Gebrauch ordnungsgemäß sterilisiert werden. Die Gebrauchsanweisung muss sorgfältig gelesen und befolgt werden. Achtung! Der Farbentwickler ist toxisch und kann Umweltschäden verursachen. Gesundheitsschädigend bei Inhalation, bei Kontakt mit Haut oder Augen oder bei Verschlucken. Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder ungeborene Säuglinge schädigen. Für genaue Angaben zur chemischen Zusammensetzung der Reagenzien siehe das Datenblatt für Materialsicherheit. LAGERUNG Das Produkt ist gebrauchsfertig, keine weitere Vorbereitung erforderlich. Dieses Produkt bis zur Verwendung in seiner Originalverpackung im Dunkeln bei 2-8 C aufbewahren. Nicht einfrieren oder überhitzen. Vor Verwendung auf Zimmertemperatur erwärmen lassen. Vor der Verwendung nicht inkubieren. PRODUKTSCHÄDEN Dieses Produkt sollte nicht verwendet werden, falls (1) eine Farbänderung der weißen Nährböden eingetreten ist, (2) das Verfallsdatum abgelaufen ist, sowie (3) bei anderen Anzeichen von Beschädigung. Nährböden müssen vor Feuchtigkeit geschützt werden, daher nur die für den Test erforderlichen Nährböden aus der Flasche entnehmen. Verschluss sofort wieder aufsetzen und Flasche wieder bei 2-8 C lagern. HINWEIS: Die Bildung von Fällungen oder Farbvariation von strohfarben zu rosa im Farbentwickler ist normal und wirkt sich nicht auf die Testergebnisse aus. PROBENENTNAHME, LAGERUNG UND TRANSPORT Die Proben sollten entsprechend der folgenden Richtlinien entnommen und gehandhabt werden. 5 Der LAP-Test sollte mit reinen oder isolierten Testkulturen von Katalase-negativ, grampositiven Kokken, die Stunden alt sind, ausgeführt werden. ERFORDERLICHE MATERIALIEN, DIE NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN SIND (1) Gerät zur Sterilisierung der Inokulationsschlinge, (2) Inokulationsschlinge, Abstrichtupfer, Sammelbehälter, (3) Inkubatoren, alternative Umweltsysteme, (4) zusätzliche Medien, (5) Organismen zur Qualitätskontrolle, (6) Pinzetten, (7) Deionat. Optionale Materialien: (1) Mikroskop-Objektträger, (2) Mikropipette oder mikrobiologische Schlinge (10 µl). VERFAHREN 1. Mit Hilfe der Pinzetten den Nährboden auf einen sauberen Mikroskop-Objektträger oder auf den Deckel einer Agarplatte streichen, der frei von Feuchtigkeit ist. 2. Den Nährboden mit Hilfe einer anpassbaren 5-10 µ Mikropipette oder einer 10-µl Inokulationsschlinge leicht mig demineralsiertem Wasser befeuchten. NICHT ÜBERSÄTTIGEN. Der Nährboden kann zur Rehydration auf die Agarplatte des Mediums platziert werden. 3. Mit Hilfe einer sterilen Schlinge oder eines hölzernen Abstrichtupfers einer Stunden alten Kultur etwas sichtbare "Masse" entnehmen. 4. Das Inokulum vorsichtig auf einen kleinen Bereich des Nährbodens reiben. 5. Bei Zimmertemperatur 5 Minuten inkubieren. 6. Je 1 Tropfen Farbentwickler auf den Nährboden geben. 7. Mindestens 1 Minute Farbentwicklung abwarten. INTERPRETATION DES TESTS Positiv-Test - Rosa bis rote Farbentwicklung innerhalb einer Minute nach Zugabe des Farbentwicklers Negativ-Test - Keine Farbänderung oder eine leichte gelbe Farbentwicklung innerhalb einer Minute nach Zugabe des Farbentwicklers ZU ERWARTENDE WERTE 4,5,6 Aerococcus urinae (+) Helcococcus ( ) Aerococcus viridans ( ) Lactococcus (+) Enterococcus (+) Leuconostoc ( ) Gemella haemolysans ( ) Pediococcus (+) Gemella morbillorum (+) Streptococcus (+) Globicatella ( )

6 QUALITÄTSKONTROLLE Alle Chargen-Nummern des LAP Test Kit wurden unter Verwendung der nachfolgend aufgeführten Organismen zur Qualitätskontrolle getestet und als tauglich befunden. Das Testen von Kontrollorganismen sollte nach den üblichen Qualitätskontrollverfahren für Labore durchgeführt werden. Falls anomale Qualitätskontrollresultate festzustellen sind, sollten die Patientenresultate nicht in den Bericht aufgenommen werden. KONTROLLE INKUBATION ERGEBNISSE Enterococcus faecalis ATCC Aerob, 5 25 C Positiv Aerococcus viridans ATCC Aerob, 5 25 C Negativ EINSCHRÄNKUNGEN 1. Eine Farbentwicklung nach einer Minute sollte ignoriert werden. 2. Bei Verwendung eines inadäquaten Inokulums können falsch negative Reaktionen auftreten. 3. Es sollte betont werden, dass dieser Test nur ein Teil des gesamten Nachweisverfahrens ist. Für einen definitiven Nachweis können weitere biochemische und serologische Tests erforderlich sein. LEISTUNGSMERKMALE 7 Eine Auswertung von 114 Streptokokken-Stämmen und verwandten Genera wiesen eine 97% Korrelation mit den erwarteten Werten auf. Genus Anzahl getestet Anzahl positiv % Positiv Aerococcus Leuconostoc Gemella Streptococcus Enterococcus* Lactococcus Pediococcus *Alle E. faecalis und E. faecium, aus denen >95% der aus den klinischen Proben isolierten Enterococci bestehen, waren LAP-positiv in dieser Auswertung (R. Facklam, unveröffentlichte Daten). LITERATURVERWEISE 1. Colman, G. and L.C. Ball J. Appl. Bacteriol. 57: Fertally, S. and R. Facklam J. Clin. Microbiol. 25: Ruoff, K.L., D.R. Kuritzkes, J.S. Wolfson, and M.J. Ferraro J. Clin. Microbiol. 26: Facklam, R. and J.A. Elliott Clin. Microbiol. Rev. 8: Facklam, R.R Clin. Microbiol. Newsl. 23: Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken Manual of Clinical Microbiology. 8 th ed., Vol. 1. ASM, Washington, D.C. 7. Data on file Remel Inc., Lenexa, KS. PACKUNGSINHALT REF , LAP Test Kit Tests/Kit Verwendete Symbole REF IVD LAB LOT Katalog-Nr. Medizinisches Produkt für die In-Vitro-Diagnostik Für Laborgebrauch Gebrauchsanweisung beachten Temperatureinschränkungen (Lagertemp.) Chargenbezeichnung (Chargen-Nr.) Zu verwenden bis (Verfallsdatum) EC REP Autorisierte Vertretung für U-Länder ATCC ist ein eingetragenes Warenzeichen von American Type Culture Collection. IFU , Revidierte Fassung vom Printed in U.S.A Santa Fe Drive, Lenexa, KS 66215, USA Allgemeine Auskünfte: (800) Technische Unterstützung: (800) Bestellungen: (800) Telefon lokal/international: (913) Fax international: (913) Website: remel@remel.com

7 DETERIORAMENTO DEL PRODOTTO Non utilizzare il prodotto se (1) il colore bianco dei dischi è variato, (2) è stata superata la data di scadenza del prodotto o (3) sono presenti altri segni di deterioramento. Proteggere i dischi dall umidità, rimuovendo dalla fiala solo quelli necessari per l esecuzione del test. Rimettere subito il tappo e porre immediatamente la fiala a 2-8 C. LAP Test Kit (Italiano) USO PREVISTO LAP Test Kit di Remel è un saggio rapido consigliato per l uso nelle procedure qualitative per la determinazione dell attività della leucina amminopeptidasi negli streptococchi e nei generi correlati. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO Nel 1984, Colman e Ball hanno riferito che, diversamente dagli streptococchi, la specie Aerococcus non produceva la leucina amminopeptidasi (LAP). 1 Fertally e Facklam hanno confermato questa scoperta nel 1987 durante l indagine sui metodi di identificazione degli streptococchi. 2 Essi hanno trovato ceppi di Aerococcus ripetutamente negativi alla leucina amminopeptidasi, mentre i ceppi di Enterococcus e Streptococcus hanno fornito reazioni positive. LAP, unitamente a PYR e ad altri test convenzionali, rappresenta un parametro importante nell identificazione di Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus e dei generi correlati. 3,4,5 PRINCIPIO I dischi di carta filtro sono impregnati di leucina-β-naftilammide, che serve come substrato per la determinazione dell amminopeptidasi della leucina. Successivamente all idrolisi del substrato da parte dell enzima, la β-naftilammina ottenuta produce un colore rosso dopo l aggiunta di ρ-dimetilamminocinnamaldeide (sviluppatore del colore). REAGENTI E MATERIALI FORNITI 1. Dischi LAP (1 fiala da 50) Ingrediente reattivo: Idrocloruro di L-leucina-β-naftilammide 2. Sviluppatore del colore (1 flacone, 4,5 ml) Ingrediente reattivo: 0.01% ρ-dimetilamminocinnamaldeide 0,01% 3. Bastoncini applicatori (1 fiala da 50) PRECAUZIONI Il prodotto è indicato esclusivamente per Uso diagnostico in vitro e deve essere utilizzato solo da personale competente ed esperto. Si raccomanda di prendere le dovute precauzioni contro eventuali rischi microbiologici sterilizzando opportunamente dopo l'uso campioni, contenitori e strumenti. Leggere con attenzione le istruzioni contenute in questo documento e seguirle scrupolosamente. Attenzione! Lo sviluppatore del colore è tossico e può provocare danni ambientali. È nocivo per inalazione, contatto con la pelle o con gli occhi e per ingestione. Può ridurre la fertilità e danneggiare i bambini non ancora nati. Consultare la Scheda di Sicurezza del prodotto per informazioni dettagliate sui reagenti chimici. CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE Questo prodotto è pronto per l uso e non necessita di alcuna preparazione. È necessario conservare il prodotto in un luogo buio nel proprio contenitore originale a 2-8 C fino al momento dell uso. Non congelare o surriscaldare. Il prodotto deve essere portato a temperatura ambiente prima dell'uso. Non incubare prima dell uso. NOTA: La formazione di precipitato o la variazione del colore da paglierino a rosa nello sviluppatore del colore è comune e non influisce sulle prestazioni del test. RACCOLTA DEI CAMPIONI, CONSERVAZIONE E TRASPORTO Prelevare e trattare i campioni seguendo le linee guida raccomandate. 5 È necessario eseguire il LAP test su colture pure o isolate di cocci gram-positivi, catalasi-negativi, che abbiano un età di ore. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO (1) Dispositivo di sterilizzazione per anse, (2) ansa per inoculo, tampone, contenitori per la raccolta, (3) incubatori o sistemi ambientali alternativi, (4) terreni di coltura supplementari, (5) microrganismi per il controllo qualità, (6) pinze, (7) acqua demineralizzata. Materiali opzionali: (1) Vetrino per microscopio, (2) micropipetta o ansa microbiologica (10 µl). PROCEDIMENTO 1. Con le pinze, posizionare il disco su un vetrino pulito per microscopio o sul coperchio di una piastra di agar priva di umidità in eccesso. 2. Inumidire leggermente il disco con 5-10 µl di acqua demineralizzata usando una micropipetta regolabile o un ansa per inoculo da 10 µl. NON SOVRASATURARE. In alternativa, è possibile posizionare il disco sulla superficie dell agar del terreno in piastra per la reidratazione. 3. Raccogliere una pasta visibile da una coltura di ore con un ansa sterile o un bastoncino applicatore di legno. 4. Strisciare delicatamente l inoculo in una piccola zona del disco. 5. Incubarle a temperatura ambiente per 5 minuti. 6. Aggiungere una (1) goccia di sviluppatore di colore al disco. 7. Attendere fino a un minuto per una modifica del colore. INTERPRETAZIONE DEL TEST Test Positivo - Sviluppo di colore da rosa a rosso entro un minuto dall applicazione dello sviluppatore di colore Test Negativo - Nessuna modifica del colore o sviluppo di un colore leggermente giallo entro un minuto dall applicazione dello sviluppatore di colore RISULTATI ATTESI 4,5,6 Aerococcus urinae (+) Helcococcus ( ) Aerococcus viridans ( ) Lactococcus (+) Enterococcus (+) Leuconostoc ( ) Gemella haemolysans ( ) Pediococcus (+) Gemella morbillorum (+) Streptococcus (+) Globicatella ( )

8 CONTROLLO QUALITÀ Ogni lotto di LAP Test Kit è stato sottoposto a controllo qualità con i microrganismi indicati di seguito ed è risultato soddisfacente. I test di controllo qualità devono essere eseguiti conformemente alle procedure di controllo qualità definite dal laboratorio. Se i test di controllo qualità forniscono risultati aberranti, i risultati ottenuti con i campioni in esame non devono essere refertati. CAMPIONE DI CONTROLLO INCUBAZIONE RISULTATI Enterococcus faecalis Aerobica, 5 min. Positiva ATCC 25 C Aerococcus viridans ATCC Aerobica, 5 min. a 25 C Negativa LIMITAZIONI 1. Non si dovrebbe tenere conto dello sviluppo di colore osservato dopo un minuto. 2. È possibile che si verifichino reazioni false negative, se viene usato un inoculo inadeguato. 3. È necessario evidenziare che questo test fa parte solo dello schema complessivo per l'identificazione. È possibile che sia necessario un ulteriore test biochimico e sierologico per l identificazione definitiva. CARATTERISTICHE DEL METODO 7 Una valutazione di 114 ceppi di streptococco e dei generi correlati ha mostrato una correlazione del 97% con i risultati attesi. Genere N. sottoposti a test N. positivi % positiva Aerococcus Leuconostoc Gemella Streptococcus Enterococcus* Lactococcus Pediococcus *Tutti gli E. faecalis ed E. faecium, che compongono >95% degli enterococchi isolati da campioni clinici, erano positivi al LAP in questa valutazione (R. Facklam, dati non pubblicati). BIBLIOGRAFIA 1. Colman, G. and L.C. Ball J. Appl. Bacteriol. 57: Fertally, S. and R. Facklam J. Clin. Microbiol. 25: Ruoff, K.L., D.R. Kuritzkes, J.S. Wolfson, and M.J. Ferraro J. Clin. Microbiol. 26: Facklam, R. and J.A. Elliott Clin. Microbiol. Rev. 8: Facklam, R.R Clin. Microbiol. Newsl. 23: Murray, P.R., E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken Manual of Clinical Microbiology. 8 th ed., Vol. 1. ASM, Washington, D.C. 7. Data on file Remel Inc., Lenexa, KS. CONFEZIONE REF , LAP Test Kit... Kit per 50 test Legenda dei simboli REF IVD LAB LOT Codice numero Dispositivo per uso diagnostico in vitro Per uso del laboratorio Consultare le istruzioni per l'uso (IFU) Limitazioni per temperatura (Temp. di conservazione) Codice batch (Numero Lotto) Da utilizzare entro (data di scadenza) EC REP Rappresentante autorizzato per l'europa ATCC è un marchio registrato di American Type Culture Collection. IFU , Data ultima revisione: Stampato in U.S.A Santa Fe Drive, Lenexa, KS 66215, USA Informazioni generali: (800) Assistenza tecnica: (800) Ufficio vendite: (800) Tel. locali/internazionali: (913) Fax internazionale: (913) Sito web: remel@remel.com

9 Kit de pruebas LAP (Español) USO PREVISTO El kit de pruebas LAP de Remel es un ensayo rápido recomendado para uso en procedimientos cualitativos para la detección de la actividad de leucina aminopeptidasa en estreptococos y otros géneros relacionados. RESUMEN Y EXPLICACIÓN En 1984, Colman y Ball observaron que, a diferencia de los estreptococos, las especies de Aerococcus no producían leucina aminopeptidasa (LAP) 1. Fertally y Facklam confirmaron este descubrimiento en 1987 al investigar métodos para la identificación de estreptococos 2. Descubrieron que las cepas de Aerococcus daban constantemente negativo para leucina aminopeptidasa, mientras que las cepas de Enterococcus y Streptococcus daban reacciones positivas. LAP, junto con PYR y otras pruebas convencionales, es un parámetro importante en la identificación de Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, y géneros relacionados 3,4,5. PRINCIPIO Los discos de papel de filtro se impregnan con leucina-β-naftilamida que sirve como sustrato para la detección de leucina aminopeptidasa. Una vez que la enzima hidroliza el sustrato, la β- naftilamina resultante produce un color rojo al añadírsele ρ-dimetilaminocinamaldehído (reactivo de desarrollo de color). REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS 1. Discos LAP (1 vial de 50) Ingrediente del reactivo: Hidrocloruro de L-leucina-β-naftilamida 2. Reactivo de desarrollo de color (1 frasco de 4,5 ml) Ingrediente del reactivo: 0,01% ρ-dimetilaminocinamaldehído 3. Varillas aplicadoras (1 vial de 50) PRECAUCIONES Este producto es para uso diagnóstico in vitro y debe ser utilizado por personal con la formación adecuada. Se tomarán precauciones frente a los riesgos microbiológicos esterilizando correctamente las muestras, envases y medios después de su uso. Se deben leer y seguir atentamente las instrucciones. Precaución! El reactivo de desarrollo de color es tóxico y puede provocar daños al medio ambiente. Peligroso por inhalación, por contacto con la piel o los ojos, o por ingestión. Puede alterar la fertilidad o provocar daños al feto. Encontrará información más detallada en la Hoja de datos de seguridad sobre productos químicos. ALMACENAMIENTO Este producto se presenta listo para su uso y no requiere más preparación. Se debe almacenar en su envase original, en la oscuridad, a 2-8 C hasta el momento de su uso. No congelar ni sobrecalentar. Dejar estabilizar el producto a temperatura ambiente antes de su uso. No incubar antes de su uso. DETERIORO DEL PRODUCTO Este producto no se debe usar si (1) el color de los discos ha cambiado y ya no es blanco, (2) se ha sobrepasado la fecha de caducidad, o (3) hay otros signos de deterioro. Proteger los discos de la humedad extrayendo del vial sólo los discos necesarios para la prueba. Volver a poner rápidamente el tapón y guardar el vial a 2-8 C. NOTA: Es frecuente que se forme un precipitado en el reactivo de desarrollo de color, o que su color cambie de pajizo a rosa, lo que no afectará al resultado de la prueba. OBTENCIÓN, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS Las muestras se deben obtener y manipular siguiendo las normas recomendadas 5. La prueba LAP debe realizarse en cultivos puros o aislados de cocos gram-positivos y catalasa-negativos que tengan de 18 a 72 horas. MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS (1) Asa para esterilización, (2) asa de inoculación, torunda y envases para recogidas, (3) incubadoras, sistemas ambientales alternativos, (4) medio suplementario, (5) microorganismos para el control de calidad, (6) pinzas y (7) agua desmineralizada. Materiales opcionales: (1) Portaobjetos, (2) micropipetas o asa microbiológica (10 µl). PROCEDIMIENTO 1. Con las pinzas, poner el disco en un portaobjetos limpio o en la tapa de una placa de agar que no tenga una humedad excesiva. 2. Humedecer ligeramente el disco con 5-10 µl de agua desmineralizada usando una micropipeta ajustable o un asa de inoculación de 10 µl. NO SOBRESATURAR. Como alternativa, el disco se puede colocar en la superficie de agar del medio usado en la placa para rehidratación. 3. Coger la pasta visible de un cultivo de horas usando un asa estéril o una varilla aplicadora de madera. 4. Frotar suavemente el inóculo en una pequeña zona del disco. 5. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. 6. Añadir 1 gota de reactivo de desarrollo de color al disco. 7. Dejar hasta un minuto para el cambio de color. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Prueba Positiva - Desarrollo de un color de rosa a rojo un minuto después de aplicar el reactivo de desarrollo de color Prueba Negativa - Sin cambio de color o desarrollo de un color crema o amarillo un minuto después de aplicar el reactivo de desarrollo de color VALORES ESPERADOS 4,5,6 Aerococcus urinae (+) Helcococcus ( ) Aerococcus viridans ( ) Lactococcus (+) Enterococcus (+) Leuconostoc ( ) Gemella haemolysans ( ) Pediococcus (+) Gemella morbillorum (+) Streptococcus (+) Globicatella ( )

10 CONTROL DE CALIDAD Todos los números de lote de la prueba LAP se han estudiado usando los siguientes microorganismos de control de calidad y los resultados son aceptables. El estudio de los microorganismos de control se debe realizar de acuerdo con los procedimientos de control de calidad establecidos en el laboratorio. Si se observan resultados anómalos en el control de calidad, no se informará de los resultados de ese paciente. CONTROL INCUBACIÓN RESULTADOS Enterococcus faecalis Aerobiosis, 5 Positivo ATCC minutos a 25 C Aerococcus viridans ATCC Aerobiosis, 5 minutos a 25 C Negativo LIMITACIONES 1. El desarrollo del color tras un minuto carece de importancia. 2. El uso de un inóculo inadecuado puede provocar reacciones falsas negativas. 3. Es importante tener en cuenta que esta prueba es sólo una parte del proceso general de identificación. Para la identificación definitiva puede ser necesaria una identificación bioquímica y serológica más detallada. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO 7 Una evaluación de 114 cepas de estreptococos y sus géneros relacionados, dio como resultado una correlación del 97% con los valores esperados. Género Nº de pruebas Positivos % de positivos Aerococcus Leuconostoc Gemella Streptococcus Enterococcus* Lactococcus Pediococcus *En esta evaluación, todos los E. faecalis y E. faecium, que componen >95% de los enterococos aislados de las muestras clínicas, dieron positivo en la prueba LAP (R. Facklam, datos no publicados). BIBLIOGRAFÍA 1. Colman, G. and L.C. Ball J. Appl. Bacteriol. 57: Fertally, S. and R. Facklam J. Clin. Microbiol. 25: Ruoff, K.L., D.R. Kuritzkes, J.S. Wolfson, and M.J. Ferraro J. Clin. Microbiol. 26: Facklam, R. and J.A. Elliott Clin. Microbiol. Rev. 8: Facklam, R.R Clin. Microbiol. Newsl. 23: Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken Manual of Clinical Microbiology. 8 th ed., Vol. 1. ASM, Washington, D.C. 7. Información en archivo Remel Inc., Lenexa, KS, EE.UU. PRESENTACIÓN REF , Kit de pruebas LAP...50 pruebas/kit Símbolos REF IVD LAB LOT Número de catálogo Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Para el uso del laboratorio Consultar las instrucciones de uso Límite de temperatura (Temp. de almacenamiento) Código de lote (Número de lote) Fecha de caducidad EC REP Representante autorizado en Europa ATCC es una marca registrada de American Type Culture Collection. IFU , Revisado el Impreso en los EE.UU Santa Fe Drive, Lenexa, KS 66215, EE.UU. Información general: (800) Servicio técnico: (800) Pedidos: (800) Teléfono local/internacional: (913) Fax internacional: (913) Dirección en Internet: Correo electrónico: remel@remel.com