Rapport annuel d'activité, année Laboratoire National de Référence. Mycoplasmoses aviaires

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1 Rapport annuel d'activité, année 214 Laboratoire National de Référence Mycoplasmoses aviaires Nom du responsable du LNR Bouchardon Anne Nom de l'unité où l'activité du LNR est mise en œuvre Unité de Mycoplasmologie - Bactériologie Nom du laboratoire où l'activité du LNR est mise en œuvre Laboratoire de Ploufragan Nombre de laboratoires agréés et/ou reconnus dans le réseau Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de l'existence du mandat de LNR Mycoplasma gallisepticum chez la poule et la dinde, et Mycoplasma meleagridis chez la dinde, sont des maladies qui font l objet de mesures de contrôle (dépistage et suivi des élevages de sélection et de reproduction) nécessitant le support d un LNR. 1

2 Introduction Les faits marquants de l'année L année 214 a été marquée essentiellement, comme les années précédentes, par les problèmes dus à Mycoplasma synoviae dans les élevages : - syndrome des œufs à extrémités de verre chez les poules pondeuses, qui entraine des pertes importantes dans les élevages (œufs cassés, fêlés ou déclassés, nettoyage des lignes de ramassage des œufs et des centres de conditionnement) - synovite infectieuse chez les poulets et les dindes de chair, avec de forts taux de saisie à l abattoir. Une souche de Mycoplasma gallisepticum (espèce rarement retrouvée sur le terrain du fait des programmes de contrôle) et trois souches de Mycoplasma iowae ont été isolées. Cette année a également été marquée par l'obtention de résultats encourageants pour la détection des différentes espèces de mycoplasmes aviaires par la technique Maldi-Tof, dans le cadre d'un stage de deuxième année d'iut effectué en collaboration avec le Laboratoire Labocea de Ploufragan. 1. Méthodes développées ou révisées Nombre de méthodes développées ou révisées proposées à l autorité compétente Donner le nom et une brève description de chacune de ces méthodes Différentes méthodes sont utilisées au sein de l UMB pour isoler, identifier et caractériser les mycoplasmes aviaires : - culture sur milieux spécifiques (liquide ou gélosé) pour isoler les souches de mycoplasmes ; ces cultures sont principalement réalisées à partir d écouvillonnages (trachée, sacs aériens, cloaque, liquide synovial), mais peuvent également être effectuées à partir de tissus (fragments de trachée, vitellus ou albumen des œufs) ; la mise en culture s effectue par dilutions de raison 1 dans des milieux très riches et supplémentés avec des antibiotiques pour limiter les contaminations éventuelles ; les tubes ou les géloses ensemencées sont incubées pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, du fait de la croissance très lente des mycoplasmes par rapport à des bactéries «classiques» ; la culture est également utilisée pour titrer les suspensions mycoplasmiques aliquotées et conservées à une température <-65 C. - observation des colonies de mycoplasmes sous loupe binoculaire pour vérifier leur aspect et la pureté des suspensions. - identification par amplification génique (PCR) : l UMB a développé ou adapté différentes méthodes PCR afin de détecter et d identifier les mycoplasmes aviaires : - PCR spécifique de M. gallisepticum, développée au sein de l UMB, 2

3 - PCR spécifique de M. synoviae, adaptée à partir d une méthode publiée, - PCR spécifique de M. iowae, développée au sein de l UMB, - PCR spécifique de M. meleagridis, développée au sein de l UMB, - PCR spécifique de la Classe des Mollicutes (genres Mycoplasma, Ureaplasma, Spiroplasma et Acholeplasma), adaptée à partir d une méthode publiée : cette PCR permet, lorsque les autres PCR sont négatives, de détecter la présence d autres espèces de mycoplasmes et elle peut servir de base pour une identification de l espèce par séquençage. - détection d anticorps spécifiques de M. gallisepticum et M. synoviae dans les sérums de poules et de dindes, et de M. meleagridis dans les sérums de dindes par la méthode d agglutination rapide sur lame (ARL). Le laboratoire est accrédité par le COFRAC (n 1-225) pour ces techniques depuis détection d anticorps spécifiques de M. synoviae dans les sérums de poules et de dindes par la méthode ELISA (kit commercial). Nombre de méthodes développées ou révisées qui sont susceptibles d être prêtes pour être proposées à l autorité compétente au cours de l année N+1 1 Donner le nom et une brève description de chacune de ces méthodes Une collaboration a été mise en place avec le Laboratoire Labocea en 213 et 214 pour tester la possibilité d identifier les mycoplasmes aviaires par la technique de spectrométrie de masse Maldi-Tof. Les résultats obtenus au cours de l'année 214 semblent encourageants et la technique pourra sans doute être validée au cours de l année 215 pour les espèces les plus courantes. 2. Matériels biologiques ou chimiques, matériaux de référence et échantillons et souches d'intérêt Décrire ici les collections d'échantillons biologiques ou d'autre nature (environnement, aliment...) conservés par le LNR; indiquer les méthodes de conservation, la température, le nombre de "repositories", le nombre d'échantillons par souche, l'enregistrement associé...). o Nombre de souches/échantillons reçu(e)s et mises en collection dans l année : - Au cours de l année 214, 339 échantillons (écouvillonnages trachéaux, écouvillonnages cloacaux, écouvillonnages d oviductes, écouvillonnages d articulations, organes, œufs, sérums) ont été reçus de différents élevages ou laboratoires, dont 254 échantillons (sérums, œufs ou écouvillonnages trachéaux) provenant d élevages de poules pondeuses atteints du syndrome des œufs à extrémité de verre (recherche de M. synoviae par culture et PCR ou par sérologie). Les suspensions initiales issues de ces échantillons, ou les sérums, ont été 3

4 conservés à une température <-65 C (1 à 2 aliquotes par prélèvement). En fonction des résultats obtenus par culture / PCR, certains échantillons ont été éliminés ou le seront au cours des prochaines années afin de ne conserver que les cultures positives ou les souches isolées à partir de ces prélèvements et quelques échantillons négatifs (pour validation de méthodes de détection). - trois souches ont été reçues pour identification et/ou conservation : il s agissait d une souche isolée d une canard (souche de M. imitans) et d une souche isolée d un faisan (identification de l espèce à effectuer au cours de l année 214) ; les souches ont été mises en conservation à <-65 C dans du milieu contenant 2% de glycérol (2 à 5 aliquotes de 1 ml par souche). - Au total, 41, 5, 3 et 1 cultures respectivement positives vis-à-vis de M. synoviae, M. iowae, M. gallisepticum et M. imitans ont été mises en conservation cette année à <-65 C dans du milieu contenant 2% de glycérol (2 aliquotes par culture). - Dans le cadre de la surveillance du statut des troupeaux de poules et de dindes EOPS du laboratoire de Ploufragan, 179 échantillons de sang (373 sangs de dindes et 136 sangs de poules) ont été reçus au laboratoire. Quelques dizaines de sérums ont été conservés à <-18 C. o Nombre de souches/échantillons maintenus au total : - Souches de référence pour différentes espèces de mycoplasmes aviaires (dont trois souches de référence M. gallisepticum, trois M. iowae, une M. synoviae et une M. meleagridis) ; - Autres souches : M. gallisepticum (3), M. synoviae (162), M. meleagridis (15), M. iowae (45), M. imitans (5), autres souches isolées du terrain et identifiées (M. gallinarum, M. anatis, M. glycophilum) ou à identifier plus précisément (par séquençage par exemple, 52 souches) ; - «Mutants» de M. gallisepticum, M. synoviae et M. iowae obtenus par sélection en milieu contenant des concentrations subinhibitrices d antibiotiques (fluoroquinolones, macrolides) : au minimum 2 «mutants» par espèce et par antibiotique ; Toutes les souches citées ci-dessus sont conservées à <-65 C dans du milieu contenant 2% de glycérol (2 à 5 aliquotes de 1 ml par souche). - Sérums de référence : le LNR fourni des sérums de référence des espèces poule et dinde pour la technique d ARL (sérums négatifs, sérums positifs pour M. gallisepticum, M. synoviae ou M. meleagridis) ; ces sérums sont conservés en pool à <-18 C, puis en aliquotes de 1 ml lyophilisées (pour utilisation et expédition vers les laboratoires d analyse) et conservées à 5 C ± 3 C. Au cours de l année 214, un nouveau stock de sérum de référence positif vis-à-vis de M.meleagridis a été produit sur dindes EOPS. Nombre de souches/échantillons reçu(e)s et mis(es) en collection dans l'année 5 Nombre de souches/échantillons maintenu(e)s au total 12 4

5 3. Activités d'analyse 3.1 Analyses officielles de première intention Nombre d'analyses de première intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 5398 Détaillez ici par type d'analyse de première intention Le LNR effectue essentiellement des diagnostics de première intention pour le suivi sanitaire des troupeaux EOPS (poules et dindes) du Laboratoire de Ploufragan : en tout, 491 ARL, une mise en culture et deux réactions de PCR ont été réalisées en 214 pour ces troupeaux. De plus, dans le cadre de la production d'un nouveau sérum de référence, 66 analyses ont été réalisées sur les sérums des animaux inoculés. En tout, 339 prélèvements non liés au suivi des troupeaux EOPS ont été reçus et ont donné lieu à 1241 analyses de première intention (mise en culture et PCR, ARL ou ELISA en fonction des prélèvements) au cours de l année 214 (prélèvements provenant essentiellement de troupeaux de dindes ou de poules pondeuses). Ces derniers chiffres sont en légère diminution par rapport à l'année 213, en partie à cause de l'absence des deux principales personnes en charge du LNR en fin d'année Analyses officielles de confirmation Nombre d'analyses de seconde intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 3 Détaillez ici par type d'analyse de confirmation Au cours de l année 214, trois échantillons (cultures) provenant d un laboratoire d analyse ont été envoyés au LNR pour confirmer la présence de mycoplasmes et pour identifier, le cas échéant, l espèce du mycoplasme isolé. Ces échantillons ont été mis en culture, clonés, et des PCR spécifiques des principales espèces de mycoplasmes aviaires pathogènes ont été effectuées. Des essais d'identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF et par séquençage seront réalisés au cours de l'année 215 car ces souches, reconnues par la PCR spécifique des mycoplasmes, n'ont pas été identifiées avec les différents tests de PCR spécifiques des quatres principales espèces de mycoplasmes aviaires pathogènes. 5

6 Taux de confirmations par type d'analyse (= nombre de résultats confirmés / nombre d'analyses officielles de seconde intention réalisées) 3/ Autres analyses Nombre estimé d'autres analyses (non officielles) réalisées dans l'année en lien avec le mandat de LNR 4. Activités de production et de contrôle de matériaux de référence et de réactifs biologiques Le LNR produit-il et fournit-il des réactifs? Non Le LNR fournit-il des matériaux de référence? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Mycoplasma gallisepticum chez la poule et la dinde, et Mycoplasma meleagridis chez la dinde, provoquent des infections et des maladies qui font l objet de mesures de contrôle (dépistage et suivi obligatoire des élevages de sélection et de reproduction) : DGAL/SDSPA/N2-859 et 86. Le LNR fourni des sérums de référence (positifs et négatifs) pour la méthode ARL, norme NFU Quels sont les types de matériaux de référence (MRE, MRI, contrôles positifs ou négatifs, autre) produits et fournis? Sérums de poules ou de dindes EOPS (contrôles négatifs pour la méthode ARL) Sérums de poules positifs pour M. gallisepticum ou M. synoviae (contrôles positifs pour la méthode ARL) Sérums de dindes positifs pour M. gallisepticum, M. synoviae ou M. meleagridis (contrôles positifs pour la méthode ARL) 6

7 Quel est le format (sérum, souche, produit chimique, autre) de ces matériaux de référence? Sérums sous forme lyophilisée Quel est le nombre de lots produits et fournis par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 1 Quelles sont les quantités produites/fournies par lot? (moyenne sur les 5 dernières années) 5 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années Cette activité est restée stable sur ces cinq dernières années Le LNR réalise-t-il des contrôles de réactifs commerciaux? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Le LNR contrôle les antigènes qu'il utilise pour ses essais ARL. Dans le cadre de l'edqm, un contrôle de vaccin atténué contre M. synoviae (vaccin MS-H) a également été effectué en Quelles sont les modalités de contrôle (initiaux, répétitifs, lot par lot)? Les trois antigènes utilisés dans les ARL font l'objet de contrôles initiaux puis lot par lot. leur spécificité, sensibilité et stabilité dans le temps sont ensuite contrôlées régulièrement aux cours des essais réalisés au sein du LNR. Quel est le nombre de contrôles - ou de lots contrôlés - par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 3 7

8 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années L'activité est restée stable sur ces cinq dernières années. 5. Activités d'expertise scientifique et technique 5.1. Demandes d expertise scientifique et technique du ministère (chargé de l agriculture, santé, etc ) ou d instances communautaires et internationales qui concernent votre domaine de compétence Nombre de rapports d'est rendus dans l'année 5.2. Autres expertises Les membres de l'équipe du LNR peuvent avoir des activités d'expertise (internes: CES, GT ou externe: EFSA...) ou des activités auprès de commissions de normalisation (Afnor...). Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré. Les membres du LNR n ont pas eu d activités d expertise ou de normalisation au cours de l année 214. Anne Bouchardon a été sollicitée par des journaux pour la relecture d articles scientifiques (traitant des mycoplasmes aviaires ou de la résistance des mycoplasmes aux antibiotiques) avant publication. Ces activités, réalisées intuitu personae, ne sont cependant pas considérées comme un travail du LNR proprement dit Dossiers de demande d'agrément Nombre de dossiers de demande d'agrément étudiés dans l'année 5.4. Activités de conseil aux professionnels Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré Les appels et messages sont essentiellement reçus et gérés par la responsable du LNR. Une boîte aux lettres spécifique au LNR est consultable par toutes les personnes impliquées dans le LNR : lnr.mycoaviaires@anses.fr. Cette boîte aux lettres fonctionne et est utilisée 8

9 depuis le deuxième semestre 212. Beaucoup de professionnels continuent néanmoins à contacter directement la responsable du LNR sur sa boîte professionnelle. Le LNR reçoit en moyenne cinq appels ou messages par semaine de la part de laboratoires départementaux ou privés, de vétérinaires, ou de techniciens pour : - des demandes de renseignements sur la méthode ARL, la culture des mycoplasmes (composition des milieux de culture, méthodes d isolement par culture), les prélèvements à privilégier pour permettre l isolement des mycoplasmes, etc. ; - des demandes de renseignements généraux sur les modes de transmission des mycoplasmes aviaires, les moyens de lutte (protection, prévention, antibiothérapie, vaccins disponibles) ; Cette activité de conseil peut être estimée à environ ½ journée par semaine en moyenne. 6. Animation du réseau de laboratoires officiels 6.1. Organisation d'eila Précisez ici le nombre d'eila organisés par le LNR au cours de l année N Nom (s) et nombre(s) d'eila que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N+1 Sans objet Précisez le nombre d'eil (hors EILA - dont EILV en lien avec méthodes en cours de validation telles que précisées dans le paragraphe 1) organisés par le LNR au cours de l année N Détaillez ici le nombre de laboratoires ayant participé pour chaque EIL (hors EILA) Précisez le nombre d'eil (hors EILA) que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N Formation, organisation d'ateliers, accueil de stagiaires Nombre de journées d'échange et de restitution rassemblant les laboratoires agréés du réseau, organisées dans l'année 9

10 Nombre de sessions de formation des personnels des laboratoires agréés aux méthodes utilisées pour les contrôles officiels, organisées dans l'année 6.3. EILA auxquels le LNR a participé dans l'année Détaillez les EILA auxquels le LNR a participé dans l'année, dans le cadre : National; UE ( EILA organisé par le LRUE); International Pour la technique ARL, un EILA européen est organisé par le laboratoire GD B.V. Animal Health (Deventer, Pays-Bas) tous les ans. Le LNR y participe tous les ans, au printemps, afin de valider ses essais réalisés sous logo COFRAC. Les résultats obtenus en 214 par le LNR ont été satisfaisants. 7. Participation aux activités de surveillance 7.1 PS/PC Existe-t-il un ou plusieurs PS/PC élaboré(s) par l'autorité sanitaire dans le champ du LNR? non 7.2 Activités de surveillance hors PS/PC Dispositif(s) hors PS/PC Indiquer si le LNR est intégré à un (ou des) dispositif(s) de surveillance (hors PS/PC)? Non 8. Activités de recherche en lien avec l activité de référence 8.1. Recherches méthodologiques pour la référence Détaillez ici les recherches méthodologiques que vous avez réalisées dans l'année : objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Une collaboration a été mise en place avec Labocea en 213 afin d étudier la possibilité d une identification des espèces de mycoplasmes aviaires et porcins par spectrométrie de 1

11 masse (Maldi-Tof) : culture et préparation des souches de mycoplasmes au sein du LNR, analyse des souches avec le biotyper (Maldi-Tof de Brücker) disponible au Labocea. Différents spectres de référence ont été créés et testés avec des souches des mêmes espèces. Les premiers résultats obtenus en fin d année 213, essentiellement sur des souches porcines de mycoplasmes, étaient encourageants. L étude s'est poursuivie en 214, avec la validation de différents spectres de référence de plusieurs espèces de mycoplasmes aviaires, notamment pour les principales espèces pathogènes (M. gallisepticum, M. synoviae, M. iowae et M. meleagridis. Cette recherche méthodologique va se poursuivre pour des espèces moins fréquemment isolées ou isolées d espèces animales mineures (gibiers, canards ), pour lesquelles une étape de séquençage est nécessaire pour le moment afin de les identifier, car aucun test PCR n'est disponible. Le facteur limitant pour la validation des spectres de référence de ces espèces moins fréquemment rencontrées reste le nombre de souches disponibles au sein de la souchothèque du LNR et de Labocea. Cette technique s'est avérée également très utile pour mettre en évidence des mélanges d'espèces mycoplasmiques dans certaines préparations, mélanges qui n'étaient que très rarement détectés auparavant par culture ou tests moléculaires Recherches associées pour la référence Détaillez ici les recherches associées auxquelles vous avez participé dans l'année (participations à des études cliniques, études d'incidences, modèles d'infections expérimentales, études toxicologiques, essais vaccinaux...): objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Au cours des années précédentes, en collaboration avec des professionnels de la filière (vétérinaires et éleveurs), des prélèvements ont été réalisées dans différents élevages de poules pondeuses positives pour M. synoviae présentant le syndrome des œufs à extrémité de verre. Des analyses (mise en culture, PCR, ARL, ELISA) ont été effectuées à partir des prélèvements réalisés par les vétérinaires et/ou techniciens d élevage. Une discordance a été mise en évidence entre les résultats obtenus par ARL et ceux obtenus par ELISA, PCR ou culture : seulement 3 à 13% des sérums ont été détectés positifs vis-à-vis de M. synoviae par la technique ARL alors que 88 à 1% des poules étaient positives par ELISA, PCR ou culture. Des essais complémentaires, en utilisant différentes techniques sérologiques de détection des anticorps dirigés contre M. synoviae ont été utilisées au cours de l année 213 : l ELISA, la technique ARL classique (dilution au 1/5 et décomplémentation des seuls sérums qui s avèrent positifs lorsque non dilués), et une technique ARL modifiée (dilution au 1/5 et décomplémentation systématique de tous les sérums). La comparaison des résultats obtenus avec ces trois techniques a mis en évidence des différences très significatives entre la technique ARL classique et la technique ARL modifiée ou l ELISA. Les différences observées entre les techniques ARL classique et modifiée suggèrent un effet prozone, caractérisé par un excès d anticorps, qui empêche l observation d une réaction d agglutination normale. Ces résultats ont été confirmés au cours de l'année 214, sur de nouveaux prélèvements effectués dans des élevages de poules pondeuses. 11

12 Ces différents travaux montrent l importance de la nature des prélèvements et des techniques de diagnostic utilisées pour dépister l infection par M. synoviae chez les poules pondeuses. Des laboratoires vétérinaires de diagnostic seront contactés en 215 pour prolonger ces travaux et vérifier si ces résultats préliminaires justifient d envisager une modification de la technique normalisée de dépistage sérologique. Le rapporteur de la norme NFU47-12 (technique ARL) a été contacté et des discussions ont été engagées. 9. Relations avec le CNR Existence d'un CNR Non 1. Autres mandats Le LNR détient-il d'autres mandats de référence dans le même domaine de compétences Non 12