MÉMOIRE DU DIPLÔME D ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MÉDICALE

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1 UNIVERSITÉ DE NANTES UFR SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES ANNÉE 2015 N 14 MÉMOIRE DU DIPLÔME D ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MÉDICALE Soutenu devant le jury interrégional Le 8 avril 2015 Par Elise THOMAS Conformément aux dispositions du Décret n du 3 février THÈSE POUR LE DIPLÔME D ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE Mise au point d une RT-PCR en temps réel pour la quantification de l ARN du virus de l hépatite delta Président : Mme le Pr. Berthe-Marie IMBERT, PU-PH, Chef de service du laboratoire de Virologie - UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Nantes Membres du jury : Mme le Dr. Marianne COSTE-BUREL, Directrice de Thèse, PH, laboratoire de Virologie et direction du pôle de Biologie Nantes Mr le Pr. François RAFFI, PU-PH, Chef de service des Maladies Infectieuses et Tropicales - UFR de Médecine Nantes Mme le Dr. Marina ILLIAQUER, AHU, laboratoire de Virologie - UFR de Médecine Nantes

2 REMERCIEMENTS Je tiens à remercier Madame le Professeur Berthe-Marie Imbert, Pour avoir accepté de présider ce jury, Pour vos captivants cours de virologie à la faculté, Veuillez trouver ici l expression de ma reconnaissance. Madame le Docteur Marianne Coste-Burel, Pour m avoir confié ce travail et permis de le mener à bien, Pour votre accompagnement et votre disponibilité malgré votre emploi du temps, Veuillez trouver ici le témoignage de ma profonde gratitude. Monsieur le Professeur François Raffi, Pour l honneur que vous me faites de juger ce travail, Pour m avoir permis de passer un semestre enrichissant dans votre service, Veuillez trouver ici l assurance de mes sincères remerciements. Madame le Docteur Marina Illiaquer, Pour ta compétence et ta sympathie, Pour ta participation indispensable à cette étude, Je te témoigne ma très vive reconnaissance. L équipe du laboratoire de Virologie, Pour votre savoir-faire, votre bonne humeur et votre gentillesse ; Pour votre contribution à cette thèse, un grand merci à Audrey Rodallec et Bernard Besse.

3 REMERCIEMENTS A mes parents, Sylvain, Alban, Sophie, Pour votre précieux soutien en toutes circonstances. A la petite Daphné, Pour les leçons de phonétique. A mes amies sablaises Claire-Marie et Amandine, Toujours dans le vent! Aux moutons de choc du troupeau, Pour ces belles années d études. A Sophie et Maïlys, Vous êtes ma tasse de thé! A Matthieu, Merci de m encourager et de me bichonner.

4 TABLE DES MATIERES A) LISTE DES ABREVIATIONS... 7 B) LISTE DES FIGURES... 8 C) LISTE DES TABLEAUX D) INTRODUCTION E) REVUE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE VIRUS DE L HEPATITE DELTA E-1) Découverte et classification E-2) Propriétés structurales ) Enveloppe du VHD ) Capside du VHD ) Génome du VHD E-3) Cycle de multiplication ) Types d ARN retrouvés ) Déroulement du cycle de multiplication Attachement Adressage vers le noyau Réplication virale nucléaire par le mécanisme du double cercle roulant Transcription en ARNm «Édition» à partir de l ARN antigénomique Traduction dans le cytoplasme et modifications post-traductionnelles Assemblage dans le noyau ) Interactions entre la multiplication du VHD, du VHB et du VHC E-4) Modes de transmission E-5) Pouvoir pathogène ) Co-infection VHB et VHD Hépatite aiguë Hépatite chronique ) Surinfection par le VHD chez un sujet porteur chronique du VHB Hépatite aiguë Hépatite chronique E-6) Données épidémiologiques E-7) Variabilité et génotypes du VHD ) Description

5 2) Distribution géographique ) Génotype et pouvoir pathogène E-8) Diagnostic virologique ) Diagnostic indirect : sérologie IgG ou Ig totales IgM ) Diagnostic direct : AgHD et ARN Ag HD Détection et quantification de l ARN E-9) Traitement de l hépatite delta chronique ) Objectifs et définitions ) Molécules utilisables ) Traitement par IFNα ) Traitement par IFNα pegylé ) Facteurs prédictifs de réponse au traitement ) Monitoring au cours du traitement ) Algorithme décisionnel et suivi du traitement recommandé F) TRAVAIL PERSONNEL F-1) Matériels ) Population étudiée ) Prélèvements biologiques ) Amorces et sondes spécifiques du VHD utilisées pour la RT-PCR en temps réel ) Contrôle interne ARN ) Mélange réactionnel ) Thermocycleurs F-2) Méthodes ) Extraction des acides nucléiques ) Conditions d amplification initiales ) Construction d un standard ADN Amplification d un échantillon connu positif Purification enzymatique du produit de RT-PCR Ligation et transformation Sélection des bactéries transformées

6 - Multiplication des bactéries transformées Extraction plasmidique Vérification des extraits par une PCR Congélation des bactéries transformées Mesure de la concentration en ADN de l extrait plasmidique Constitution de la gamme plasmidique F-3) Résultats ) Optimisation du mode opératoire Premier essai Raccourcissement de la rétro-transcription et de l activation de la Taq polymérase Introduction de la T4 gène 32 protéine Optimisation de la température d hybridation Cycles de 3 étapes Cycles de 3 étapes avec dénaturation raccourcie Doublement de la quantité de Taq polymérase Chauffage des échantillons avant dépôt Essai de RT-PCR en 2 étapes Synthèse des modifications adoptées ) Contrôle interne ARN ) Evaluation de la sensibilité ) Evaluation de la spécificité ) Etude des performances avec le standard ADN pour validation de la méthode Evaluation de la fidélité Evaluation de l efficacité Evaluation de la linéarité Evaluation de la limite de détection Evaluation de l intervalle de mesure Evaluation de la justesse ) Application à des prélèvements biologiques Comparaison de cinétiques déterminées par le CNR et par notre méthode Suivi de la charge virale delta G) DISCUSSION-CONCLUSION H) REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

7 A) LISTE DES ABREVIATIONS 7

8 B) LISTE DES FIGURES Figure 1 : Particules virales delta en microscopie électronique Figure 2 : Structure générale du VHD Figure 3 : Les différents types d ARN du VHD (5) Figure 4 : ARN antigénomique Figure 5 : Réplication par le mécanisme du double cercle roulant (12) Figure 6 : Réplication du génome du VHD (4) Figure 7 : Edition (4) Figure 8 : Cycle de multiplication du VHD (3) Figure 9 : Séroprévalence du VHD parmi les sujets AgHBs+ dans le monde (4) Figure 10 : Origine des patients nouvellement dépistés en France (source : CNR) Figure 11 : Arbre phylogénétique des génotypes établi par séquençage du génome complet Figure 12 : Localisation de la région R Figure 13 : Génotypes et sous-génotypes du VHD définis par séquençage du génome complet Figure 14 : Distribution des génotypes du VHD dans le monde Figure 15 : Répartition des génotypes du VHD en France (source : données CNR 2011) Figure 16 : Distribution des génotypes du VHD en France selon les régions Figure 17 : Schémas d évolution des marqueurs sériques et des charges virales VHB et VHD (4) Figure 18 : Stratégie diagnostique (source : CNR) Figure 19 : Proposition d algorithme décisionnel pour le traitement de l hépatite delta chronique Figure 20 : Localisation des séquences-cibles Figure 21 : Principe de l extraction des acides nucléiques par le QIAsymphony SP (QIAGEN) Figure 22 : Gel d électrophorèse du produit de RT-PCR Figure 23 : Carte du plasmide utilisé, pcr II-TOPO (Life Technologies) Figure 24 : Résultats d une RT-PCR de la gamme plasmidique, avec droite d étalonnage

9 Figure 25 : RT-PCR réalisée dans les conditions de la publication de Kodani Figure 26 : RT-PCR avec des temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis Figure 27 : RT-PCR avec des temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis, avec ou sans T4 gène Figure 28 : Gradient de température d hybridation Figure 29 : C t obtenus dans les tubes soumis au gradient de température d hybridation Figure 30 : RT-PCR aux temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis, en présence de T4 gène, avec température d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes Figure 31 : RT-PCR aux temps de rétro-transcription, d activation de la Taq polymérase et de dénaturation raccourcis, en présence de T4 gène, avec température d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes Figure 32 : Comparaison de 2 concentrations de Taq polymérase Figure 33 : Comparaison de 2 RT-PCR, sans (à gauche) et avec chauffage préalable à 65 C (à droite) 60 Figure 34 : Amplification de l IPC lue dans le canal jaune pour 17 extraits positifs pour le VHD Figure 35 : Evaluation de la spécificité Figure 36 : Charges virales VHD obtenues par notre technique en fonction des charges virales CNR. 66 Figure 37 : Charges virales VHD obtenues par notre technique en fonction des charges virales CNR, pour le premier panel du contrôle international de qualité CNR Figure 38 : Charge virale VHD obtenue par notre technique en fonction de la charge virale du standard OMS Figure 39 : Charge virale VHD obtenue par notre technique en fonction de la valeur cible QCMD Figure 40 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 41 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 42 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 43 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 44 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 45 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 46 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 47 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique

10 Figure 48 : Cinétique d évolution de la charge virale d après le CNR et d après notre technique Figure 49 : Suivi biologique chez le patient Figure 50 : Suivi biologique chez le patient Figure 51 : Suivi biologique chez le patient Figure 52 : Suivi biologique chez le patient Figure 53 : Suivi biologique chez le patient

11 C) LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Principales RT-PCR pour le VHD Tableau 2 : Principales RT-PCR pour le VHD Tableau 3 : Principales RT-PCR pour le VHD Tableau 4 : Principales RT-PCR pour le VHD Tableau 5 : Caractéristiques de la population étudiée Tableau 6 : Séquences, tailles et Tm des amorces et de la sonde spécifiques du VHD Tableau 7 : Séquences, tailles et Tm des amorces et de la sonde spécifiques de l ARN IPC Tableau 8 : Concentrations finales des réactifs dans le mélange réactionnel initial Tableau 9 : Comparaison d une RT-PCR en 1 étape et d une RT-PCR en 2 étapes Tableau 10 : Coefficients de variation intra-essai Tableau 11 : Coefficients de variation inter-essais Tableau 12 : Efficacité de la RT-PCR selon les points de gamme pris en compte Tableau 13 : R 2 selon les points de gamme pris en compte Tableau 14 : Résultats et valeurs cibles du premier panel du contrôle international de qualité CNR. 67 Tableau 15 : Quantification des dilutions du standard OMS par notre laboratoire et le CNR Tableau 16 : Résultats et valeurs cibles du panel QCMD

12 D) INTRODUCTION Le virus de l hépatite delta (VHD), classé dans la famille des Deltaviridae, est le plus petit virus animal connu, et le seul dont le génome est constitué d une molécule d ARN circulaire. Son mode de réplication dans l hépatocyte se rapproche de celui de viroïdes et virusoïdes de végétaux. L enveloppe du VHD est constituée des protéines d enveloppe du virus de l hépatite B (VHB), dont la présence est indispensable à la multiplication du VHD. L infection par ces deux virus peut survenir soit simultanément, avec un risque d hépatite fulminante 100 fois plus élevé qu en cas d infection par le VHB seul, soit à la suite d une surinfection par le VHD d un patient porteur chronique du VHB. Dans 80 % des cas, ces surinfections évoluent vers l hépatite chronique B-delta, la plus sévère des hépatites virales chroniques, et la plus rapidement progressive. Le risque de CHC est accru par rapport à une cirrhose liée au VHB seul, et le taux de mortalité varie entre 2 et 20 %, soit jusqu à 10 fois plus qu en cas de portage du VHB seul. Globalement dans le monde, 5 à 10 % des porteurs chroniques du VHB sont ou ont été infectés par le VHD, les plus fortes prévalences étant observées chez les toxicomanes et les polytransfusés. Cela représente 15 à 20 millions de personnes. Si la séroprévalence du VHD a beaucoup diminué des années 1980 à 2000 dans les pays où le VHB est contrôlé, elle reste élevée dans certaines régions comme l Afrique subsaharienne, le bassin amazonien, l Europe de l Est, l Asie Centrale; et est en augmentation en Europe du Nord et en Europe Centrale. Le traitement de l hépatite chronique delta est difficile. L IFNα pegylé, dont la tolérance est médiocre, est encore à l heure actuelle la seule option thérapeutique. D après les premières études, le taux de réponse virologique prolongée est inférieur à 50 %. La quantification de l ARN du VHD est indispensable pour le suivi du traitement, car elle permet d adapter la durée de la thérapie à son efficacité. Plus de quarante porteurs chroniques B-delta sont actuellement suivis au CHU de Nantes, et leur nombre augmente régulièrement. Jusqu'à présent, leur suivi virologique était assuré par le laboratoire du CNR des hépatites B, C et delta, à Avicenne. L'accroissement des demandes nous a conduit à envisager la mise au point d une technique de RT-PCR qui pourra être réalisée au laboratoire du CHU de Nantes. 12

13 E) REVUE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE VIRUS DE L HEPATITE DELTA 1) Découverte et classification 2) Propriétés structurales 3) Cycle de multiplication 4) Modes de transmission 5) Pouvoir pathogène 6) Données épidémiologiques 7) Variabilité et génotypes du VHD 8) Diagnostic virologique 9) Traitement de l hépatite delta chronique 13

14 E) REVUE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE VIRUS DE L HEPATITE DELTA E-1) Découverte et classification L antigène delta fut découvert en 1977 dans les noyaux d hépatocytes de patients italiens porteurs chroniques du VHB, et sujets à des épisodes d exacerbation aiguë de leur maladie hépatique (1,2). On pensait alors qu il s agissait d un antigène du VHB. Le virus de l hépatite delta obtient son statut de virus distinct en Il est très particulier: c est le plus petit virus animal, et le seul à posséder un ARN circulaire. Il partage des similarités avec les viroïdes et virusoïdes des végétaux, au niveau du génome et du mode de réplication. En 2005, le Comité International de Taxonomie des Virus propose donc de classer le VHD dans une nouvelle famille, celle des Deltaviridae, genre Deltavirus. Le ribozyme du VHD, séquence d ARN capable d auto-clivage, est proche d un ribozyme localisé dans un intron du gène mammifère CPEB3. Le VHD pourrait donc trouver ses origines dans le transcriptome humain (3). E-2) Propriétés structurales Figure 1 : Particules virales delta en microscopie électronique Le VHD est une particule sphérique de 36 à 43 nm de diamètre (figures 1 et 2). Figure 2 : Structure générale du VHD 14

15 1) Enveloppe du VHD L enveloppe du VHD est formée d AgHBs et de phospholipides issus de la cellule-hôte. On retrouve les trois protéines d enveloppe du VHB (S, M et L), dans des proportions plus proches de celles des particules sphériques vides que de celles de la particule de Dane (4). Ainsi, le VHD est un virus défectif satellite du VHB. Les protéines d enveloppe du VHB sont nécessaires à la formation de particules virales, à l attachement aux cellules hépatiques, et donc à la propagation de l infection (2,5). La multiplication du VHD n est possible qu en cas de co-infection de l hépatocyte par le VHB. 2) Capside du VHD La nucléocapside du VHD est sphérique et mesure 19 nm de diamètre. Elle est composée d environ 70 molécules d une protéine très étroitement liée au génome, appelée AgHD. Deux isoformes protéiques existent: small hepatitis delta antigen (S-AgHD) ou p24 (195 acides aminés, 24 kda), et large hepatitis delta antigen (L-AgHD) ou p27 (214 acides aminés, 27 kda). S-AgHD et L-AgHD possèdent des rôles communs. D une part, l AgHD permet l adressage de la nucléocapside du VHD vers le noyau de l hépatocyte; d autre part, il inhibe la réplication du génome du VHB, en réprimant des séquences régulatrices, les enhancer 1 et 2 du VHB. Ainsi, les protéines d enveloppe sont plus disponibles pour l assemblage des nouvelles particules virales delta. Les deux isoformes protéiques ont également des rôles spécifiques : - S-AgHD stimule la réplication du VHD, notamment en activant l ARN polymérase II. - L-AgHD inhibe la réplication du génome du VHB, à la fois en réprimant les enhancer 1 et 2, et en transactivant le gène MxA (habituellement activé par la voie de l interféron), ce qui inhibe l export d ARNm à partir du noyau (6). Par contre, il favorise la production de protéines d enveloppe du VHB, qui sont indispensables à la propagation du VHD. Cette isoforme protéique inhibe également la réplication du génome du VHD, mais est indispensable dans l assemblage des particules virales delta. Enfin, L-AgHD favorise l inflammation et aurait des propriétés oncogènes, par l augmentation de l expression de la protéine clusterin, et en stimulant la voie de signalisation du NF-kB (4,7). 3) Génome du VHD Le génome du VHD est constitué d une molécule d ARN simple brin, circulaire, de polarité négative. Cet ARN empaqueté dans les virions est dit génomique. Il est composé d environ 1700 nucléotides (1672 à 1697 selon le génotype). C est le génome viral le plus court connu infectant le règne animal. Autour de 74 % des nucléotides sont appariés en raison d une proportion importante de bases GC (55 % en moyenne) (4,5). Ainsi, l ARN circulaire ressemble à une molécule double brin dénommée «rod-like structure». 15

16 E-3) Cycle de multiplication Le mode de multiplication du VHD dans l hépatocyte est inédit parmi les virus infectant le règne animal, mais se rapproche de celui de viroïdes et virusoïdes de végétaux. 1) Types d ARN retrouvés Trois types d ARN delta sont présents dans l hépatocyte lors de la multiplication du VHD (figure 3) (3,5,8,9). Figure 3 : Les différents types d ARN du VHD (5) L ARN génomique, empaqueté dans les virions, est composé d environ 1700 nucléotides. De polarité négative, il est circulaire mais ressemble à une molécule double brin. Il comprend un ribozyme d environ 85 nucléotides: ce site catalytique est capable d auto-clivage et d autoligature. L ARN antigénomique est l exact complément de l ARN génomique. Il est produit dans l hépatocyte sans intermédiaire ADN. Le changement de polarité fait apparaître un cadre de lecture ouvert codant pour une unique protéine, l AgHD, ainsi qu un signal de polyadénylation (AAUAAA). L ARN antigénomique est également capable de s assembler en «rod-like structure», et comporte le site ribozyme d environ 85 nucléotides (figure 4). 16

17 Figure 4 : ARN antigénomique Dernier type d ARN delta retrouvé, l ARN messager a une longueur d environ 800 nucléotides. Linéaire, il possède une coiffe méthylguanine en 5 et une queue poly(a) en 3. Sa polarité est celle de l ARN antigénomique; le cadre de lecture ouvert est présent. L ARNm est une molécule instable qui permet la synthèse de l AgHD. 2) Déroulement du cycle de multiplication - Attachement Le VHD se fixe à des récepteurs cellulaires sur les hépatocytes. Le mécanisme précis est mal connu. Il s agirait des mêmes récepteurs que ceux du VHB. - Adressage vers le noyau La nucléocapside est transportée jusqu au noyau grâce à un signal d adressage nucléaire présent sur l AgHD. - Réplication virale nucléaire par le mécanisme du double cercle roulant Cette réplication est indépendante de la présence du VHB. Dans le nucléole, l ARN génomique circulaire est directement transcrit en polymères d ARN antigénomique par l ARN polymérase cellulaire de type II. Cette enzyme agit habituellement comme une ARN polymérase ADN dépendante. L ARN génomique serait traité comme de l ADN double brin grâce à sa «rod-like structure». Plusieurs études ont démontré le rôle de l ARN polymérase cellulaire de type II (10). Une étude suggère également l implication des ARN polymérases cellulaires de type I et III (11). Le site d initiation de la transcription n est pas connu. Ces polymères d ARN antigénomique, de taille double ou triple, voire plus, s auto-clivent au niveau du ribozyme par transestérification. Des monomères linéaires sont ainsi obtenus. Ceux-ci subissent ensuite une ligature par une ARN ligase cellulaire, permettant la formation de monomères circulaires. 17

18 L ARN antigénomique circulaire est fonctionnel grâce à sa «rod-like structure». C est un intermédiaire ARN qui permet l amplification du génome du VHD: il sert de matrice pour la synthèse d ARN génomique dans le nucléoplasme, par l ARN polymérase cellulaire II (et les ARN polymérases cellulaires I et III selon certains auteurs). Les polymères d ARN génomique linéaires obtenus s auto-clivent. Par la suite, les monomères linéaires sont circularisés, ce qui inactive le site ribozyme et renforce la stabilité de l ARN par la formation de la «rod-like structure». L ARN génomique circulaire obtenu sert de matrice pour la synthèse d ARN antigénomique, pour la synthèse d ARNm, ou participe à la formation d une nouvelle particule virale. Ce mode de réplication en double cercle roulant est unique parmi les virus animaux, mais répandu parmi les virus végétaux (figures 5 et 6). Figure 5 : Réplication par le mécanisme du double cercle roulant (12) 18

19 Figure 6 : Réplication du génome du VHD (4) - Transcription en ARNm L ARN polymérase cellulaire de type II transcrit l ARN génomique circulaire en ARNm complémentaire dans le nucléoplasme. Celui-ci subit des modifications posttranscriptionnelles: il est polyadénylé en 3 et équipé d une coiffe méthylguanine en 5. Jusqu à copies d ARN génomique s accumulent dans un hépatocyte infecté, ainsi qu environ 10 fois moins d ARN antigénomique, et environ 500 fois moins d ARNm. Les mécanismes de régulation sont inconnus. - «Édition» à partir de l ARN antigénomique Il existe une hétérogénéité du codon 196 de l ARNm. Elle est liée à l intervention d une ADAR-1 cellulaire sur certains ARN antigénomiques. La désamination d une adénosine produit une inosine, qui est appariée à une cytosine lors de la réplication en ARN génomique. L ARNm synthétisé à partir de cet ARN génomique modifié ne comprend non pas un codon stop UAG, mais un codon sens UGG. Ainsi, le cadre de lecture est allongé. La protéine obtenue comprend 19 acides aminés supplémentaires à l extrémité C-terminale (figure 7). Les ADAR agissent habituellement sur les acides nucléiques disposés en double brin. Cette modification enzymatique a un rôle central dans le cycle de multiplication du VHD: elle contrôle les niveaux d expression des deux isoformes protéiques, et donc l équilibre entre la réplication du génome et l assemblage des particules virales. Lorsqu une molécule d ARN génomique mutée à ce niveau est assemblée avec les protéines de capside et d enveloppe, le virion obtenu n est pas viable, car il ne peut générer que L- AgHD. 19

20 Figure 7 : Edition (4) - Traduction dans le cytoplasme et modifications post-traductionnelles Comme les ARNm cellulaires, l ARNm viral traverse les pores nucléaires, et est traduit en protéines au niveau des ribosomes du réticulum endoplasmique granuleux. Des modifications post-traductionnelles sont indispensables pour la translocation de l AgHD dans le noyau et pour son interaction avec les enzymes cellulaires: phosphorylations, méthylation, acétylation. L-AgHD subit également une isoprénylation, c est-à-dire l ajout d un lipide, l isoprénoide farnesyl (poly-isoprène à 15 carbones), via une liaison thioéther, sur une cystéine proche de la position C-terminale. Cette augmentation de la lipophilie est indispensable pour l affinité avec l AgHBs. Les deux isoformes protéiques obtenues sont ensuite adressées vers le noyau, pour être assemblées dans les nouvelles particules virales, et pour remplir leurs fonctions. - Assemblage dans le noyau Une molécule d ARN génomique et environ 70 molécules d AgHD sont assemblées dans le noyau. Un peptide signal à l extrémité C-terminale de L-AgHD permet le transfert de ces complexes vers l appareil de Golgi, où ils sont associés à des protéines d enveloppe du VHB produites en excès (figure 8). 20

21 Figure 8 : Cycle de multiplication du VHD (3) 3) Interactions entre la multiplication du VHD, du VHB et du VHC Comme dit précédemment, l AgHD inhibe la réplication du génome du VHB. Ainsi, dans l hépatite delta chronique, la charge virale du VHB est en général faible (13). Par contre, L- AgHD favorise la production de protéines d enveloppe du VHB. La charge virale plasmatique du VHD et le taux d AgHbS seraient alors corrélés positivement, mais certains articles suggèrent le contraire (13,14). Le VHD inhibe également la réplication du VHC dans le cas de triple infection VHC, VHB et VHD (15). E-4) Modes de transmission Les modes de transmission du VHD sont les mêmes que ceux du VHB, excepté le mode materno-fœtal qui est moins efficace pour une raison inconnue. La transmission est donc principalement parentérale, notamment iatrogène, et sexuelle (16 18). Des cas de transmission intrafamiliale ont été décrits (19,20). Les plus fortes prévalences sont observées chez les toxicomanes et les polytransfusés. La prévention contre le VHD repose sur la vaccination contre l hépatite B. E-5) Pouvoir pathogène L infection par le virus de l hépatite delta peut se produire selon deux modes différents. Soit l infection par le VHB et le VHD est simultanée, soit une surinfection par le VHD a lieu chez un patient porteur chronique du VHB. Les implications cliniques de ces deux situations sont différentes (3,4). 21

22 1) Co-infection VHB et VHD - Hépatite aiguë Une primo-infection simultanée par les deux virus est asymptomatique dans 80 à 90 % des cas. Lorsqu elle est symptomatique (10 à 20 % des cas), la période d incubation est de 3 à 7 semaines. On observe ensuite une phase pré-ictérique qui dure 3 à 7 jours, avec des signes non spécifiques (fatigue, anorexie, nausées). La phase ictérique dure entre 2 et 6 semaines. L ictère est associé à une asthénie, une fièvre, parfois un prurit. Au niveau biologique, deux pics d élévation des transaminases séparés de 2 à 5 semaines sont parfois présents. Environ 7 % de ces hépatites aiguës sont fulminantes, avec encéphalopathie, conduisant au décès dans 80 % des cas en l absence de transplantation hépatique en urgence. Le risque d hépatite fulminante est 100 fois plus élevé en cas de co-infection VHB et VHD qu en cas d infection par le VHB seul. - Hépatite chronique La co-infection VHB et VHD est résolutive dans 60 à 90 % des cas. Le passage à la chronicité n est donc pas plus fréquent qu en cas d infection par le VHB seul. 2) Surinfection par le VHD chez un sujet porteur chronique du VHB - Hépatite aiguë La surinfection est symptomatique dans 50 à 70 % des cas, avec un ictère. Dix % des cas évoluent vers une hépatite fulminante. - Hépatite chronique La virémie VHB fournit l environnement nécessaire pour une pleine expression de la virulence du VHD. Ainsi, 80 % des cas de surinfection évoluent vers l hépatite chronique delta. C est la plus sévère des hépatites virales chroniques, et la plus rapidement progressive. Selon certains auteurs, cela est lié à une réponse CD4+ plus importante (15). Soixante-dix % des cas évoluent en cirrhose ; dans 15 % des cas, cette évolution a lieu dans les 2 ans après le contage. Le risque de CHC est accru par rapport à une cirrhose liée au VHB seul: environ 25 % des cas d hépatite chronique delta évoluent en CHC (21). Le taux de mortalité varie entre 2 et 20 %, soit jusqu à 10 fois plus qu en cas de portage uniquement du VHB (22). Dans l hépatite chronique delta, la réplication du VHB est en général de faible niveau, même chez les patients positifs pour l AgHBe (13,15). Le mécanisme des lésions hépatiques n est pas élucidé à ce jour. La réponse immunitaire de l hôte semble jouer un rôle important. Le passage fréquent à la chronicité pourrait s expliquer en partie par la capacité du VHD d inactiver certaines voies de signalisation cellulaire stimulées par l interféron α (3,4,23). 22

23 E-6) Données épidémiologiques Globalement dans le monde, 5 à 10 % des porteurs chroniques du VHB sont ou ont été infectés par le VHD. Cela représente 15 à 20 millions de personnes (15,24). La séroprévalence du VHD suit généralement celle du VHB, mais il y a des exceptions: ainsi, l infection par le VHD est rare au Vietnam et en Indonésie. La fiabilité de ces estimations est limitée par l absence de dépistage systématique du VHD chez les porteurs chroniques du VHB dans toutes les zones géographiques. La séroprévalence du VHD a beaucoup diminué des années 1980 à 2000 dans les pays où le VHB est contrôlé, grâce à de meilleures conditions socio-économiques, au contrôle des dons de sang, à la vaccination contre l hépatite B, et à la prévention contre les infections sexuellement transmissibles. Cependant, elle reste élevée dans certaines régions comme l Afrique subsaharienne, le bassin amazonien, l Europe de l Est, l Asie Centrale (figure 9). La séroprévalence est même en augmentation en Europe du Nord et en Europe Centrale depuis la fin des années 1990, notamment du fait de l immigration depuis l Europe de l Est, la Turquie, l Afrique. Le VHD reste donc un problème de santé publique (4). Figure 9 : Séroprévalence du VHD parmi les sujets AgHBs+ dans le monde (4) Légende : Very low : <10% des sujets AgHBs+ Low : 10 à 20% des sujets AgHBs+ Intermediate : 20 à 60% des sujets AgHBs+ High : >60% des sujets AgHBs+ 23

24 En Europe, les sujets infectés par le VHD se divisent schématiquement en deux groupes. D une part, les patients contaminés depuis au moins les années , lorsque le VHD était fortement épidémique, la plupart présentant une cirrhose avancée. D autre part, les patients contaminés plus récemment, migrant en Europe depuis des zones où la séroprévalence du VHD reste élevée (25). En Europe, jusqu à un tiers des patients infectés avec le VHB et le VHD ont une sérologie VHC positive (15). Peu d études ont estimé la proportion de sujets séropositifs pour le VHD chez lesquels le virus se réplique. En 2005, une étude française sur 122 sujets, menée au laboratoire du CNR des hépatites B, C et delta, a évalué à 50 % la proportion de sujets séropositifs pour le VHD avec une RT-PCR positive (26). En France, les données du CNR concernant l origine géographique des patients nouvellement dépistés montrent qu en 2011 plus de 60 % d entre eux sont des migrants Africains, et 20 % sont des migrants d Europe de l Est (figure 10). Figure 10 : Origine des patients nouvellement dépistés en France (source : CNR) E-7) Variabilité et génotypes du VHD 1) Description La séquence génomique du virus delta est très variable. Des études longitudinales chez des patients porteurs chroniques ont estimé le taux de mutation de l ARN du VHD entre et substitution par nucléotide et par an (27). Or le VHD se réplique grâce aux ARN polymérases humaines, qui sont très fidèles. La variabilité pourrait alors être liée à l enzyme ADAR qui agirait sur d autres sites moins spécifiques que celui correspondant au codon 196. La variabilité observée entre les souches de VHD a conduit à décrire huit génotypes, 1 à 8 (4,5,24,28) (figure 11). 24

25 Figure 11 : Arbre phylogénétique des génotypes établi par séquençage du génome complet Le génotypage est réalisé dans des centres spécialisés, principalement par séquençage du génome complet ou de la région R0, séquence hautement conservée codant pour l extrémité C terminale de l AgHD, située entre les nucléotides 889 et 1289 (numérotation selon Wang (29); figure 12). La variabilité entre les différents génotypes est supérieure à 15 % au niveau de la région R0. Elle est supérieure à 20 % entre les génomes complets, et peut aller jusqu à 40 %. Des sous-génotypes, présentant au moins 10 % de divergence entre les génomes complets, sont également définis (figure 13). Deux régions du génome sont fortement conservées entre les génotypes : celle codant pour l AgHD, et le site ribozyme. 25

26 Figure 12 : Localisation de la région R0 Figure 13 : Génotypes et sous-génotypes du VHD définis par séquençage du génome complet (source : E. Gordien, EASL Istanbul 2010) 26

27 2) Distribution géographique Les génotypes présentent des différences inexpliquées dans leur distribution géographique. Dans le monde, le génotype 1 est le plus fréquent et est retrouvé sur tous les continents (figure 14). Le génotype 2 est présent au Japon, à Taiwan et en Russie. Le génotype 3 est retrouvé dans le bassin amazonien. Le génotype 4 est présent au Japon et à Taiwan. Les génotypes 5 à 8 sont présents en Afrique. Figure 14 : Distribution des génotypes du VHD dans le monde En France, le génotype 1 est majoritaire et représente 77 % des virus en circulation (40 % de génotypes 1 eurasiens, 37 % de génotypes 1 africains). Il est suivi par le génotype 5 (16 %) et le génotype 7 (3 %) (figure 15). De légères disparités existent entre les régions françaises. Le génotype 1 est toujours nettement prépondérant (plus de 75 %). En-dehors de la région parisienne et du Nord, les génotypes 1 eurasiens représentent plus de 50 % des virus circulants. La proportion de génotype 5 est plus élevée en région parisienne (20 %). Le génotype 7 est principalement retrouvé dans le Nord-Est (13 %), le génotype 8 est essentiellement présent dans le Sud- Ouest (13 %) (figure 16). 27

28 Figure 15 : Répartition des génotypes du VHD en France (source : données CNR 2011) Figure 16 : Distribution des génotypes du VHD en France selon les régions (source : données CNR 2011) 28

29 3) Génotype et pouvoir pathogène Une relation entre le génotype et le pouvoir pathogène n est pas clairement établie. Les virus de génotype 1 seraient dotés d une meilleure capacité d assemblage, d où une évolution plus fréquente vers une atteinte hépatique sévère, et une guérison moins fréquente. Le génotype 1 peut ainsi être associé à une atteinte hépatique modérée ou sévère. Le génotype 3 serait lié à une plus grande fréquence d hépatite aiguë (3). E-8) Diagnostic virologique Il ne se justifie que chez les sujets porteurs du VHB, c est-à-dire dont le marqueur AgHBs est positif. 1) Diagnostic indirect : sérologie - IgG ou Ig totales Toute découverte d hépatite B avec AgHBs positif doit faire l objet d un dépistage delta. On recherche la présence dans le sérum d IgG (ou Ig totales) spécifiques du VHD, par méthode immuno-enzymatique ou radio-immunologique. La production d IgG spécifiques est constante chez les sujets ayant été en contact avec le virus. Jusqu à ce jour, il n a été rapporté aucun cas de virémie VHD positive en l absence d IgG, même en cas d immunodépression (15). La recherche du génome viral n est donc pas justifiée chez un sujet séronégatif pour le VHD. Chez les porteurs chroniques du VHB, il est recommandé de suivre la sérologie delta une fois par an, pour dépister une éventuelle surinfection, ainsi qu en cas d augmentation des transaminases. Ces IgG persistent après guérison, mais peuvent disparaître plusieurs années après (3). D autres techniques sont donc nécessaires pour distinguer une infection résolutive d une infection active. - IgM Les IgM spécifiques sont détectées dans le sérum 2 à 4 semaines après une surinfection delta. En cas d infection résolutive, elles disparaissent en 12 semaines (figure 17). A la différence des autres infections virales, les IgM persistent dans l hépatite delta chronique (sous forme monomérique). Chez les sujets possédant des IgG spécifiques du VHD, il est donc informatif de rechercher les IgM par méthode immuno-enzymatique ou radioimmunologique. Leur présence indique une infection active. Cependant, elles peuvent être absentes, notamment chez certains patients africains. En raison de la variabilité du génome du VHD, des faux négatifs sont possibles avec les méthodes détectant l ARN delta; ainsi la détection des IgM garde toute son importance. 29

30 2) Diagnostic direct : AgHD et ARN - Ag HD L AgHD peut être recherché dans le sérum par méthode immuno-enzymatique ou radioimmunologique. Sa positivité prouve le caractère actif de l infection. Cependant, sa présence dans le sérum des sujets immunocompétents est fugace car il est rapidement complexé par les anticorps. - Détection et quantification de l ARN L ARN du VHD est détectable dans le sérum ou le plasma dès 2 semaines après une surinfection par le VHD. La présence d ARN delta plasmatique signifie que l infection est active, avec un risque élevé d évolution péjorative. L instauration d un traitement doit alors être envisagée. La cinétique des différents marqueurs diagnostiques du VHD en fonction des circonstances de l infection et de son issue est illustrée sur la figure 17. Figure 17 : Schémas d évolution des marqueurs sériques et des charges virales VHB et VHD (4) La stratégie diagnostique à adopter combine donc la recherche des anticorps spécifiques avec celle de l ARN (figure 18). 30

31 Figure 18 : Stratégie diagnostique (source : CNR) La quantification de l ARN du VHD est essentielle pour le monitoring du traitement antiviral. Dans les études fondamentales, elle permet d explorer l histoire naturelle de l infection, et d analyser les interactions entre le VHD et le VHB. Par contre, aucune corrélation entre la clinique et le niveau de la charge virale n a été démontrée pour l instant (3). Notamment, la charge virale n est pas corrélée au stade de fibrose hépatique, qui sera déterminé par une biopsie hépatique (les techniques non invasives d évaluation de la fibrose hépatique ne sont pas validées dans l hépatite delta chronique (3,13) ). 31

32 L hybridation moléculaire permet de détecter l ARN à partir de 10 4 à 10 6 copies/ml de sérum ou de plasma (4). La RT-PCR est beaucoup plus sensible, avec une limite de détection pouvant être de l ordre de 10 copies/ml. La plupart des techniques utilisées aujourd hui sont des RT-PCR «maison», basées sur la technologie temps-réel. Elles présentent des divergences importantes à plusieurs niveaux : - type d échantillon (sérum ou plasma) - volume d échantillon - méthode d extraction de l ARN - région de l amplification - présence ou non d un contrôle interne - type de standard utilisé pour la gamme d étalonnage (ADN plasmidique contenant la séquence-cible, ADN synthétique, ARN de la séquence-cible transcrit in vitro, ARN génomique entier) - automate de PCR - technologie de PCR en temps réel. De façon à pouvoir comparer les différentes charges virales d un patient, il est donc impératif de réaliser le suivi toujours dans le même laboratoire. Les tableaux 1 à 4 synthétisent les caractéristiques des principales RT-PCR en temps réel ayant été mises au point pour le VHD. La majorité des équipes réalise une extraction des acides nucléiques à partir de 140 à 250 µl de plasma ou sérum, basée sur l utilisation de membranes de silice. Les amorces choisies amplifient dans la plupart des cas le ribozyme et/ou la région codant pour l AgHD. L amplification est réalisée immédiatement après la rétro-transcription sans ouvrir les tubes dans environ la moitié des cas (RT-PCR en une étape). Le type de standard est réparti équitablement entre ADN et ARN. Seulement 2 techniques utilisent un contrôle interne ARN, qui est introduit avant l extraction. La majorité des RT-PCR repose sur la technologie des sondes d hydrolyse. Les cycles se déroulent en 2 étapes dans la moitié des cas, et en 3 étapes pour l autre moitié. Cinq publications rapportent une étape préliminaire de chauffage de l ARN. La limite de détection varie de 13 à 3800 copies/ml. Le domaine de linéarité s étend sur 4 à 9 log. Parmi les 12 techniques présentées, 7 sont conçues pour amplifier tous les génotypes du VHD. 32

33 Yamashiro, 2004 (30) Le Gal, 2005 (31) Mederacke, 2010 (32) échantillon sérum sérum ou plasma sérum ou plasma EDTA volume d'échantillon 150 µl 250 µl 200 µl méthode d'extraction extraction liquide-liquide guanidinium thiocyanate-phénolchloroforme en milieu acide colonne de silice: QIAamp MinElute Virus Vacuum (QIAGEN) particules magnétiques à membrane de silice: COBAS AmpliPrep-Total Nucleic Acid Isolation (Roche) région amplifiée Ag HD ribozyme Ag HD 1 ou 2 étapes 2 étapes 2 étapes 1 étape contrôle interne absence absence absence type de standard ARN (transcrit) ADN (plasmide digéré) ADN (plasmide) thermocycleur Light Cycler (Roche) ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) plateforme COBAS AmpliPep TaqMan (Roche) technologie de PCR SYBR Green sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse variations de température 50 cycles de 3 étapes: dénaturation 95 C 10", hybridation 68 C 5", amplification 72 C 20" initiation: 50 C 2', 95 C 10' 45 cycles de 2 étapes: 95 C 15", 60 C 1' rétrotranscription: 50 C 20', 95 C 5' 50 cycles de 2 étapes: dénaturation 95 C 15", amplification 60 C 45" efficacité? 93%? limite de détection (95%) copies/ml (= 1 copie/réaction) 100 copies/ml (= 1 copie/réaction) 15 copies/ml linéarité 10^3 à 10^9 copies/ml 10^3 à 10^9 copies/ml 3.10^2 à 10^7 copies/ml génotypes technique conçue pour les génotypes 2 et 4 amplification des génotypes 1,2,5,6 et 7. nécessité d'une amorce différente pour le génotype 3 Tableau 1 : Principales RT-PCR pour le VHD - 1? 33

34 Hofmann, 2010 (33) Schaper, 2010 (34) Ferns, 2012 (35) échantillon sérum sérum plasma EDTA volume d'échantillon? 200 µl 140 µl méthode d'extraction colonne de silice: QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)? colonne de silice: QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) région amplifiée ni Ag HD ni ribozyme Ag HD et ribozyme ribozyme 1 ou 2 étapes 2 étapes 1 étape 1 étape contrôle interne absence absence type de standard ADN (plasmide) ADN (plasmide) thermocycleur Light Cycler 2.0 (Roche) Light Cycler (Roche) Brome Mosaic Virus (ARN) introduit avant extraction transcrit ARN (ARN génomique entier) ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) technologie de PCR sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse variations de température initiation: 95 C 10' 50 cycles de 3 étapes: 95 C 5", 48 C 15", 72 C 10" étape préliminaire de choc thermique: ARN chauffé 5' à 100 C puis refroidi par éthanol à -70 C rétrotranscription: 61 C 20', 94 C 30" 45 cycles de 3 étapes: dénaturation 95 C 4", hybridation 55 C 15", amplification 72 C 15" rétrotranscription: 50 C 30', 95 C 2' 45 cycles de 2 étapes: dénaturation 95 C 15", amplification 64 C 40" efficacité?? 94% limite de détection (95%) (10 copies/réaction) copies/ml (= 40 copies/réaction) copies/ml (= 130 copies/réaction) linéarité 2.10^3 à 10^8 copies/ml 10^3 à 10^7 copies/ml 7 log copies/ml génotypes technique conçue pour les génotypes 1 et 3 technique conçue pour tous les génotypes Tableau 2 : Principales RT-PCR pour le VHD - 2 technique conçue pour tous les génotypes 34

35 Shang, 2012 (36) Katsoulidou, 2013 (37) Scholtes, 2012 (38) échantillon sérum ou plasma EDTA plasma sérum ou plasma EDTA volume d'échantillon 250 µl 500 µl 500 µl méthode d'extraction particules magnétiques: MagMAX Viral RNA Isolation kit (Applied Biosystems)? particules magnétiques à membrane de silice: NucliSENS easymag (biomérieux) région amplifiée Ag HD et ribozyme ribozyme Ag HD 1 ou 2 étapes 2 étapes 2 étapes 1 étape contrôle interne absence absence ARN encapsulé introduit avant extraction type de standard ADN (plasmide) ADN synthétique ARN (transcrit) thermocycleur COBAS TaqMan 48 (Roche) Light Cycler 2.0 (Roche) Rotor-Gene 6000 (QIAGEN) technologie de PCR SYBR Green sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse variations de température étape préliminaire: ARN chauffé 10' à 65 C puis plongé dans de la glace initiation: 95 C 10' 45 cycles de 3 étapes: dénaturation 95 C 15", hybridation 60 C 25", amplification 72 C 16" étape préliminaire: ARN chauffé 10' à 65 C 50 cycles:? rétrotranscription: 50 C 20', 95 C 5' 45 cycles de 2 étapes: dénaturation 95 C 15", amplification 60 C 45" efficacité 91%?? limite de détection (95%) linéarité génotypes 640 copies/ml (= 10 copies/réaction) 6,4.10^2 à 6,4.10^8 copies/ml technique conçue pour tous les génotypes 13 copies/ml (= 1 copie/réaction) 13 à 13.10^10 copies/ml technique conçue pour tous les génotypes Tableau 3 : Principales RT-PCR pour le VHD copies/ml (= 24 copies/réaction) 500 à 1,7.10^11 copies/ml technique conçue pour "les génotypes majeurs" 35

36 Kodani, 2013 (39) Botelho-Souza, 2013 (40) Homs, 2014 (41) échantillon sérum sérum? volume d'échantillon 200 µl 200 µl? méthode d'extraction particules magnétiques à membrane de silice: MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation kit (Roche) colonne de silice: QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) région amplifiée ribozyme Ag HD Ag HD et ribozyme 1 ou 2 étapes 1 étape 2 étapes 1 étape contrôle interne absence absence absence type de standard thermocycleur ARN (transcrit) ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) ADN (plasmide) et ARN (transcrit) ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems)? ADN (plasmide) et transcrit ARN (ARN génomique entier) ABI Vii A7 (Applied Biosystems) technologie de PCR sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse sonde d'hydrolyse variations de température rétrotranscription: 45 C 10', 94 C 10' 45 cycles de 2 étapes: dénaturation 95 C 30", amplification 60 C 1' étape préliminaire: ARN chauffé 5' à 95 C initiation: 94 C 2' 40 cycles de 3 étapes: dénaturation 94 C 30", hybridation 60 C 50", amplification 72 C 45" étape préliminaire de choc thermique: ARN chauffé 10' à 95 C puis refroidi à -80 C rétrotranscription: 50 C 15' 40 cycles de 2 étapes: dénaturation 95 C 3", amplification 60 C 30" efficacité >90% limite de détection (95%) linéarité génotypes 750 copies/ml (= 15 copies/réaction) 750 à 7,5.10^8 copies/ml technique conçue pour tous les génotypes 100% avec le standard ADN, 119% avec le standard ARN 130 copies/ml avec le standard ADN, 84 copies/ml avec le standard ARN 130 à 1,3.10^7 copies/ml avec le standard ADN, 84 à 8,4.10^6 avec le standard ARN technique conçue pour tous les génotypes Tableau 4 : Principales RT-PCR pour le VHD - 4?? 10^3 à 10^9 copies/ml technique conçue pour tous les génotypes 36

37 E-9) Traitement de l hépatite delta chronique 1) Objectifs et définitions Le but du traitement est d obtenir l indétectabilité de l ARN du VHD de façon persistante, ainsi que la normalisation des transaminases et la régression des lésions nécroticoinflammatoires du foie. On parle de réponse virologique soutenue ou prolongée lorsque la charge virale est indétectable 6 mois après la fin du traitement. On parle de réponse biochimique prolongée lorsque les ALAT ont une valeur normale 6 mois après la fin du traitement. 2) Molécules utilisables Le VHD pose un problème de cible thérapeutique : il ne possède pas de système enzymatique, ses mécanismes d attachement et d entrée dans l hépatocyte sont mal connus. L interféron-alpha à haute dose est la seule option actuellement. Les inhibiteurs de polymérase actifs sur le VHB, comme la lamivudine et l adéfovir, n ont pas montré d efficacité sur la réplication du VHD. Administrés seuls, ils ne réduisent pas la charge virale VHD. Co-administrés avec l IFNα, ils n augmentent pas le taux de réponse virologique soutenue. En effet, l AgHBs reste produit en quantité suffisante pour permettre la réplication du VHD. Il en est de même pour la ribavirine (42 46). Par contre, les analogues nucléos(t)idiques sont utiles en association avec l IFNα quand la réplication du VHB est importante (47). L IFNα n a pas montré d activité antivirale contre le VHD in vitro, ce qui suggère une action indirecte par le biais du système immunitaire (4). 3) Traitement par IFNα Concernant le traitement par IFNα recombinant à dose classique pendant 12 mois, une méta-analyse de 5 études a montré une réduction significative de la cytolyse hépatique, mais pas de négativation significative de la charge virale VHD, et une rechute fréquente de la cytolyse après l arrêt du traitement. Les résultats sont meilleurs avec l IFNα à haute dose (9 MU trois fois par semaine). Une étude randomisée, contrôlée et avec un suivi prolongé sur 12 ans a montré que le traitement par IFNα à haute dose améliore significativement la survie à long terme, même en cas de cirrhose présente avant l instauration (48). Une réponse virologique prolongée est observée dans 0 à 50 % des cas selon les études. Une réponse biochimique prolongée est observée dans 21 à 50 % des cas selon les études (3). Cependant, aucun patient n a présenté de réponse virologique prolongée dans la seule étude randomisée mesurant la charge virale VHD par une technique de RT-PCR sensible (48). Il n a pas été clairement démontré de bénéfice d un traitement de 24 mois par rapport à un traitement de 12 mois (46,49). L indétectabilité de la charge virale VHD est associée à une chute du titre de l AgHBs. La perte de l AgHBs survient plus tard que l indétectabilité de la charge virale VHD (45). 37

38 4) Traitement par IFNα pegylé L utilisation d IFNα pegylé a également été testée dans plusieurs études, à la dose d 1,5 µg/kg/semaine pendant 12 à 18 mois. Le taux de réponse virologique prolongée varie de 17 à 43 %. Le taux de réponse biochimique prolongée varie de 16 à 57 % (43,50,51). Pour confirmer et affiner ces résultats, des études à plus grande échelle sont requises. Le traitement de l hépatite chronique delta est donc difficile. Les rechutes sont fréquentes. Les effets indésirables, nombreux et préoccupants (syndrome pseudo-grippal, troubles digestifs, asthénie, troubles hématologiques, troubles thymiques), rendent l observance difficile à dose élevée. 5) Facteurs prédictifs de réponse au traitement Ils sont mal définis car peu de données sont disponibles. D autres essais sont nécessaires sur de plus gros effectifs, afin d identifier les facteurs prédictifs de réponse, de non-réponse, et de caractériser les patients pour lesquels un traitement prolongé serait bénéfique. Semblent être liés à un faible taux de réponse : - une charge virale VHD élevée avant traitement (> 7 log copies/ml) (4) - un titre d AgHBs élevé - le génotype 1 (l impact du génotype sur l efficacité du traitement est mal connu, car la majorité des patients inclus dans les essais cliniques étaient infectés par un virus de génotype 1) - un traitement tardif - une cinétique d évolution de la charge virale VHD défavorable. 6) Monitoring au cours du traitement - Intérêt de la cinétique d évolution de la charge virale VHD Plusieurs études suggèrent que l indétectabilité de la charge virale VHD à 6 mois de traitement est prédictive de réponse virologique soutenue (44,50). Une étude turque définit trois types de réponse à l interféron (52) : - réponse complète : la charge virale indétectable à 6 mois de traitement prédirait une réponse virologique soutenue - réponse partielle : la charge virale diminuée à 6 mois mais toujours détectable prédirait une rechute à l arrêt du traitement - absence de réponse : la charge virale ne diminue pas, ou diminue de moins de 2 log en un an. Une équipe allemande propose d arrêter le traitement lorsque la charge virale VHD a diminué de moins de 3 log à 6 mois, car les chances de réponse virologique prolongée seraient nulles (51). 38

39 - Intérêt de la cinétique d évolution du taux d AgHBs En 2012, une étude française argumentant sur le suivi de 4 patients propose d adapter la durée du traitement selon la décroissance du taux d AgHBs. Le traitement était arrêté lorsque le taux d AgHBs devenait indétectable, ce qui est survenu en 7 à 48 mois. Pour les 4 patients, un an après la fin du traitement, le taux d AgHBs est toujours indétectable, et les transaminases ont toujours une valeur normale (53). 7) Algorithme décisionnel et suivi du traitement recommandé Le traitement par IFNα pegylé en une administration sous-cutanée hebdomadaire est entrepris pour une durée minimale de un an, en cas de charge virale positive, d atteinte hépatique, et en l absence de contre-indication. Il est recommandé de suivre les charges virales VHB et VHD tous les 3 à 6 mois, car le niveau de réplication du VHD peut évoluer rapidement (14). La durée optimale de traitement n est pas définie. Lorsque la charge virale VHD n est pas indétectable au bout d un an, mais qu elle a diminué régulièrement ainsi que les transaminases, une prolongation pourrait être bénéfique, si la tolérance est correcte (3,52,54). Cette conduite est recommandée par l EASL en 2012 (55). Une équipe turque propose un algorithme décisionnel illustré par la figure 19, concernant l instauration du traitement et la conduite à tenir après un an (52). L IFNα pegylé est mis en place si la charge virale VHD est positive et que les transaminases sont élevées. Au bout d un an, il est envisagé de continuer le traitement pour les répondeurs partiels, dont la charge virale a diminué d au moins 2 log. L IFNα pegylé est arrêté en cas de non réponse, et en cas de charge virale VHD indétectable avec transaminases normales. 39

40 Ag HBs + Ig G delta + ARN VHD + ALAT normales ARN VHD ALAT normales ARN VHD + ALAT Contrôler à 3 mois ARN VHD et ALAT Suivi tous les 6 mois Traitement pendant 1 an Traitement si ARN VHD + et ALAT Absence de réponse : ARN VHD < 2log Arrêt du traitement Réponse partielle : ARN VHD > 2log Poursuivre le traitement 1 an Réponse complète : ARN VHD et ALAT N Arrêt. Suivi tous les 2 mois pendant 6 mois ARN VHD + ALAT Considérer reprise du traitement ARN VHD + ALAT N Figure 19 : Proposition d algorithme décisionnel pour le traitement de l hépatite delta chronique Réponses virologique et biochimique prolongées Contrôler à 3 mois ARN VHD et ALAT Considérer reprise du traitement si ALAT Contrôler tous les 3 à 6 mois ARN VHD et ALAT Est Ouest Nord

41 Toutes les équipes n adoptent pas la même attitude. Le CNR français est favorable à l instauration d un traitement dès lors que la charge virale est positive, même si les transaminases sont normales. En ce qui concerne l arrêt de l IFNα pegylé, certaines équipes attendent d avoir deux charges virales successives indétectables. D autres continuent le traitement en cas de négativation de la charge virale mais pas des IgM, car ces patients seraient sujets à rechute. Après l arrêt de l IFNα pegylé, il faut continuer à suivre la charge virale VHD pour diagnostiquer les rechutes, et prêter attention à la multiplication du VHB, qui peut reprendre. La transplantation hépatique est la seule option thérapeutique en cas de maladie hépatique à un stade très avancé, avec administration d immunoglobulines anti-hbs et d analogues nucléos(t)idiques. Le taux de survie dans ce contexte est de près de 90 % à 5 ans (4). Si les options actuelles sont très limitées, de nouvelles pistes thérapeutiques sont apparues avec l avancée des connaissances sur le cycle du VHD: un inhibiteur de l isoprénylation de L- AgHD est actif dans les modèles murins (3). Son développement a abouti à la phase préclinique. 41

42 F) TRAVAIL PERSONNEL 1) Matériels 2) Méthodes 3) Résultats 42

43 F) TRAVAIL PERSONNEL Une quarantaine de porteurs chroniques B-delta sont actuellement suivis au CHU de Nantes. Ce chiffre a augmenté ces dix dernières années, avec notamment un accroissement du nombre des patients originaires d Europe de l Est. Jusqu'à présent, les RT-PCR delta sont réalisées au CNR des hépatites B, C et delta, à Avicenne. L'augmentation des demandes nous a conduit à envisager la mise au point d une technique de RT-PCR «maison» qui pourra être réalisée in situ au laboratoire du CHU de Nantes, afin d assurer le suivi virologique de ces patients. F-1) Matériels 1) Population étudiée Nous avons mis au point et testé notre technique sur des échantillons biologiques prélevés chez 18 sujets, appartenant à la population des porteurs chroniques B-delta suivis au CHU de Nantes, et pour lesquels un surplus de plasma a pu être conservé lors d un bilan biologique (tableau 5). Ces 18 patients, 11 hommes et 7 femmes, ont une moyenne d âge de 40,5 ans (± 9,1 ans); avec un âge médian de 41,5 ans. Sept sujets sont originaires d Europe de l Est ou de Turquie, 5 sont issus d Asie ou de Russie, 3 d Afrique, et enfin 3 d Europe de l Ouest. Un seul de ces patients est co-infecté par le VIH. La majorité de ces patients sont atteints d une maladie hépatique à un stade avancé (stade non connu pour deux d entre eux). Un traitement par IFNα pégylé, associé ou non à un(des) analogue(s) nucléos(t)idique(s), a été administré chez 11 individus en 2013/2014. Le séquençage des souches effectué par le CNR montre que le VHD appartient au génotype 1 (eurasien ou africain) dans les 18 cas. 43

44 Patient Age Sexe Origine Stade de l'hépatopathie Génotype VHD Co-infection VIH/VHC Traitement de l'hépatite B-delta en 2013/ H Turquie cirrhose 1 IFNα pegylé + TDF + FTC 2 45 H Daghestan A2F3 1 IFNα pegylé + ténofovir 3 49 H Russie cirrhose 1 absence 4 43 F Chine A3F2 1 IFNα pegylé 5 31 F Chine non évalué 1 IFNα pegylé + entecavir 6 54 F France CHC 1 TDF + FTC 7 53 H France cirrhose 1 IFNα pegylé + TDF + FTC 8 34 F Gabon foie multi-nodulaire 1 IFNα pegylé + entecavir 9 41 H Bénin A2F1 1 VIH+ TDF + FTC H Mongolie cirrhose 1 IFNα pegylé H Mongolie cirrhose 1 TDF + FTC H Roumanie A2F2 1 IFNα pegylé + TDF + FTC H Suisse CHC 1 IFNα pegylé + entecavir H Gabon cirrhose 1 absence H Turquie F3 1 IFNα pegylé + entecavir F Roumanie non évalué 1 absence F Roumanie cirrhose 1 IFNα pegylé + TDF + FTC F Roumanie A3F1 1 TDF Tableau 5 : Caractéristiques de la population étudiée 2) Prélèvements biologiques La RT-PCR est réalisée à partir de plasma, obtenu après centrifugation 15 minutes à 2200g et 17 C de sang prélevé sur EDTA. Le plasma est aliquoté et conservé à -80 C avant l analyse. 3) Amorces et sondes spécifiques du VHD utilisées pour la RT-PCR en temps réel Les amorces et la sonde retenues sont celles publiées par Kodani en 2013 (39). Leurs séquences nucléotidiques figurent dans le tableau 6. Elles permettent de rétro-transcrire, d amplifier et de détecter une séquence de 93 bases du ribozyme du VHD, entre les nucléotides 814 et 906 (numérotation selon Wang (29)). L amorce sens et la sonde sont dégénérées sur deux nucléotides, afin de prendre en compte le polymorphisme génétique observé à ces positions (figure 20). La sonde est marquée à chacune de ses extrémités par un fluorochrome : 6-FAM en 5, qui émet une lumière verte, et BlackHoleQuencher-1 en 3. Les oligonucléotides ont été synthétisés par la société Eurogentec et livrés sous forme lyophilisée. Des solutions-mères à 200 µm ont été reconstituées en eau distillée puis conservées à -20 C. 44

45 séquence nucléotidique taille (bases) amorce sens: PAN-HDV-RG1 5 TCTCCCTTWGCCATCMGAG C amorce antisens: PAN-HDV-RG2 3 GGCTGGGCTTCTCCT C sonde: PAN-HDV-RGS 3 CGGGTCCWGCCTGGCGCYC C Tableau 6 : Séquences, tailles et Tm des amorces et de la sonde spécifiques du VHD W = A ou T; M = A ou C; Y = C ou T Tm Figure 20 : Localisation des séquences-cibles de l amorce sens (forward primer), de la sonde (probe) et de l amorce anti-sens (reverse primer), en regard de l alignement des séquences des principales souches de VHD (39) 4) Contrôle interne ARN Afin de s assurer de l absence d inhibiteur de PCR, nous avons introduit dans chacun des mix un ARN témoin ou ARN internal positive control. Ce contrôle interne est un plasmide ARN de 500 nucléotides fourni par la société Applied Biosystems sous forme d une solution à 10 6 copies/µl: paw 109 crna. Il est conservé à -20 C et s utilise avec des amorces et une sonde permettant de l amplifier et de le détecter spécifiquement (tableau 7). La sonde est 45

46 marquée à chacune de ses extrémités par un fluorochrome: JOE en 5, qui émet une lumière jaune, et BlackHoleQuencher-1 en 3. Les amorces et la sonde ont été synthétisées par la société Eurogentec et livrées sous forme lyophilisée. Des solutions-mères à 200 µm ont été reconstituées en eau distillée puis conservées à -20 C. séquence nucléotidique taille (bases) amorce sens: IPC-RG1 5 TCCCCAGGAACAGTTGAAAGA C amorce antisens: IPC-RG2 5 AACAGGGAACCCAGGCTCC C sonde: IPC-RGS 5 CAGTGCCTGCCCATTCGGAGGA C Tableau 7 : Séquences, tailles et Tm des amorces et de la sonde spécifiques de l ARN IPC 5) Mélange réactionnel Le mélange réactionnel est préparé à l aide du kit One Step PrimeScript RT-PCR Kit, commercialisé par la société TaKaRa. Le tampon fourni (2X Buffer III) permet de maintenir un ph optimal pour la Taq polymérase. Il contient les quatre désoxyribonucléotides nécessaires à la rétro-transcription et à l élongation, ainsi que des ions Mg 2+, cofacteurs indispensables à la réaction de polymérisation. Le kit comprend également les deux enzymes nécessaires à la RT-PCR: la reverse-transcriptase (PrimeScript) et la Taq polymérase (TaKaRa Ex Taq HS). A ces réactifs s ajoutent les amorces et la sonde spécifiques du VHD, le contrôle interne (ARN IPC) avec ses amorces et sa sonde, 5 µl d extrait à amplifier, et de l eau distillée exempte de RNAse qsp 25 µl. Les concentrations des amorces et de la sonde spécifiques du VHD sont celles préconisées par l équipe de Kodani: 600 nm de chaque amorce et 200 nm de sonde (39). Les concentrations des autres réactifs sont celles employées en routine dans notre laboratoire pour les RT-PCR en temps réel (tableau 8). Tm PAN-HDV-RG1 0,6 PAN-HDV-RG2 0,6 PAN-HDV-RGS 0,2 IPC-RG1 0,15 IPC-RG2 0,15 IPC-RGS 0,08 ARN IPC 400 copies/ L TaKaRa Ex Taq HS 0,1 U/ L PrimeScript 0,1 U/ L Tableau 8 : Concentrations finales des réactifs dans le mélange réactionnel initial 46

47 6) Thermocycleurs L appareil de PCR en temps réel utilisé est le Rotor-Gene Q (QIAGEN). Ce thermocycleur est relié à un bloc optique comprenant six sources d excitation, qui sont des LEDs couplées à des filtres de largeur de bande étroite. Un photomultiplicateur détecte et amplifie l énergie émise par le marqueur excité. Jusqu à six canaux peuvent être utilisés lors d une PCR, dont le canal vert et le canal jaune, avec respectivement des longueurs d onde d excitation de 470 et 530 nm, et des longueurs d onde de détection de 510 et 557 nm. Le canal vert permet l acquisition du signal d amplification du génome du VHD, et le canal jaune détecte l amplification du contrôle interne ARN. La rotation des tubes à 400 RPM permet d uniformiser les températures, et évite la formation de condensation et de bulles qui gêneraient la détection optique. Le laboratoire du CHU de Nantes possède deux Rotor-Gene Q; tous les essais de mise au point ont été réalisés sur le même instrument. Cet appareil est fourni avec son logiciel d exploitation de données et d analyse des résultats, Rotor-Gene Q Series Software. Pour quantifier l ARN par RT-PCR en temps réel, une droite d étalonnage est construite à partir des points de gamme, choisis pour encadrer la majorité des valeurs attendues. La quantité d ARN dans chaque échantillon est déduite du C t mesuré. Le LightCycler 96 (Roche) a été employé à une reprise pour la mise au point de la méthode. Ce thermocycleur possède une fonction gradient, qui permet d appliquer une température d hybridation différente à chaque échantillon lors de l amplification. 47

48 F-2) Méthodes 1) Extraction des acides nucléiques L extraction de l ARN est réalisée à partir de 1000 µl de plasma, grâce à l extracteur automatisé QIAsymphony SP (QIAGEN), associé au kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen (QIAGEN). Cette technique de fixation-élution des acides nucléiques utilise des particules magnétiques à membrane de silice (figure 21). Les éluats de 60 µl sont conservés à -80 C. Figure 21 : Principe de l extraction des acides nucléiques par le QIAsymphony SP (QIAGEN) 2) Conditions d amplification initiales Nous avons tout d abord programmé le thermocycleur en respectant le mode opératoire employé par Kodani (39). Son équipe réalise en premier lieu la rétro-transcription à 45 C pendant 10 minutes; ensuite, la Taq polymérase est activée en chauffant à 94 C pendant 10 minutes. Suivent 45 cycles d amplification en 2 étapes, avec 30 secondes à 95 C puis 1 minute à 60 C. Toutes ces réactions se déroulent dans le même tube sans qu il soit ouvert: il s agit d une RT-PCR en une seule étape. 3) Construction d un standard ADN Pour quantifier le génome du VHD par RT-PCR, il faut disposer d une gamme de dilutions contenant la séquence cible à des concentrations connues. Pour ce faire, nous avons synthétisé un standard ADN par clonage plasmidique. - Amplification d un échantillon connu positif Tout d abord, un échantillon de patient à charge virale VHD élevée (quantifiée par le CNR à 7,85 log copies/ml) est amplifié en utilisant le protocole précédemment décrit, mais sans introduire la sonde spécifique du VHD ni le contrôle ARN, de façon à obtenir un amplicon pur. L efficacité de l amplification est vérifiée en réalisant une migration du produit de PCR 48

49 sur un gel de polyacrylamide (figure 22). La bande visualisée sur le gel migre bien au niveau attendu de 93 paires de bases. Figure 22 : Gel d électrophorèse du produit de RT-PCR 1 : Marqueur de taille 2 : Produit de RT-PCR (93 pb) - Purification enzymatique du produit de RT-PCR Les différentes molécules du mélange réactionnel de la PCR sont éliminées par ExoSAP-IT (Affymetrix). Une exonucléase 1 dégrade les résidus d amorces simple brin, et une phosphatase alcaline détruit les désoxyribonucléotides non incorporés. L incubation 15 minutes à 37 C permet l action des deux enzymes, qui sont par la suite inactivées à 80 C pendant 15 minutes. - Ligation et transformation A l aide du kit TOPO TA Cloning (Life Technologies), l amplicon purifié est ligué dans un plasmide (figure 23), qui est ensuite intégré par des bactéries compétentes naturellement sensibles à l ampicilline, après un choc thermique. 49

50 Figure 23 : Carte du plasmide utilisé, pcr II-TOPO (Life Technologies) - Sélection des bactéries transformées Les bactéries sont ensemencées sur un milieu nutritif contenant de l ampicilline, ainsi que du X-gal, hétéroside formé de galactose et d un noyau indole. Il s agit d un substrat chromogénique de la β-galactosidase: les bactéries produisant cette enzyme se colorent en bleu. Le vecteur comprend le gène de la β-galactosidase, mais celui-ci est interrompu par l insertion d un produit de PCR. Après 24 heures de culture à 37 C, les bactéries possédant le plasmide se sont développées, car un gène de résistance à l ampicilline est présent sur pcr II-TOPO. Les bactéries bleues ont intégré un plasmide, mais sans séquence insérée. 50

51 Les bactéries non colorées, renfermant le plasmide comprenant la séquence d intérêt, sont donc réisolées pour obtenir une culture pure. - Multiplication des bactéries transformées Les bactéries transformées sont ensemencées en milieu liquide contenant de l ampicilline, placé sous agitation à 37 C pendant 24 heures. - Extraction plasmidique Le Plasmid Mini Kit (QIAGEN) permet d extraire l ADN plasmidique des bactéries transformées. Le principe est basé sur des colonnes à résine échangeuse d anions, à laquelle l ADN plasmidique se lie spécifiquement dans des conditions d osmolarité et de ph appropriées. - Vérification des extraits par une PCR La présence de la séquence cible du génome delta dans l extrait plasmidique est vérifiée par une PCR, en utilisant le protocole précédemment décrit. - Congélation des bactéries transformées Les bactéries transformées sont congelées à -80 C dans des tubes contenant du BCC et du glycérol, de façon à pouvoir réaliser une nouvelle extraction plasmidique dès que nécessaire. - Mesure de la concentration en ADN de l extrait plasmidique Par méthode spectrophotométrique au NanoDrop (Thermo SCIENTIFIC), la concentration en ADN de l extrait plasmidique est évaluée à 206,7 ng/µl (soit 0, g/µl), après trois mesures d une dilution au dixième. Le ratio 260/280 nm, qui permet d évaluer la pureté de l ADN, est supérieur à 1,5. Le poids moléculaire de l insert est calculé à l aide du logiciel Oligo Calc: il est de g/mol. Celui du vecteur est de kg/mol. Le poids moléculaire du plasmide avec la séquence d insertion est donc de ,354 = kg/mol = 2, g/mol. Le nombre de copies de plasmide (X) dans 1 µl de la solution mère de plasmide est défini par la formule suivante : X (copies/µl) = concentration pondérale (g/µl) x nombre d Avogadro / PM (g/mol) Le nombre d Avogadro est le nombre de molécules dans une mole (6, ). La concentration de la solution mère de plasmide obtenue est donc de 4, copies/µl. - Constitution de la gamme plasmidique La gamme de standard est préparée en effectuant une dilution au cinquantième de la solution mère de plasmide, puis des dilutions de 10 en 10. On obtient ainsi des solutions de 10 9 copies/µl à 1 copie/µl. La figure 24 présente un exemple de RT-PCR des dilutions plasmidiques, réalisée dans des conditions optimisées qui seront détaillées dans la partie F- 3-1). L efficacité de la réaction est ici de 1,02. Le coefficient de corrélation R 2 de la droite de régression est de 0,

52 Figure 24 : Résultats d une RT-PCR de la gamme plasmidique, avec droite d étalonnage 52

53 F-3) Résultats 1) Optimisation du mode opératoire - Premier essai Un premier essai de RT-PCR en temps réel a été effectué dans les conditions décrites précédemment, à partir d un extrait de plasma quantifié à 6,95 log copies/ml par le CNR (n ), et de dilutions de 10 en 10 de cet extrait (figure 25). La dernière dilution présentant un signal positif est celle au centième, correspondant à 8, copies dans la réaction. En tenant compte du volume de plasma extrait, du volume d élution et du volume d extrait prélevé pour la PCR, la limite de détection de cet essai est de 8, copies/ml de plasma; alors que la limite de détection annoncée de la technique de l équipe de Kodani est de 7, copies/ml (39). Une optimisation des conditions initiales doit donc être envisagée. Name Ct Given Conc (Copies) pur 18,01 8, dilution 1/10 21,73 8, dilution 1/100 27,13 8, dilution 1/ dilution 1/ Figure 25 : RT-PCR réalisée dans les conditions de la publication de Kodani La colonne «Given Conc» indique le nombre de copies par réaction 53

54 - Raccourcissement de la rétro-transcription et de l activation de la Taq polymérase Les dilutions de 10 en 10 du même extrait ont ensuite été amplifiées après une étape de rétro-transcription de 5 minutes, et une activation de la Taq polymérase de 10 secondes. La dernière dilution donnant un signal positif est également celle au centième (figure 26). Les C t obtenus ne présentent pas de différence notable avec les C t de l essai précédent. Ces deux étapes peuvent donc être raccourcies, de façon à diminuer le temps global d analyse, sans altérer la qualité des résultats. Figure 26 : RT-PCR avec des temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis - Introduction de la T4 gène 32 protéine Le gène 32 du bactériophage T4 code pour une protéine capable de se lier aux acides nucléiques à simple brin. Notre laboratoire intègre classiquement une forme recombinante de cette protéine dans tous les mix de RT-PCR, pour améliorer l efficacité de la rétrotranscription et de l amplification. Elle est produite par l entreprise NEW ENGLAND BioLabs et utilisée à une concentration de 0,08 µg/µl. Les dilutions de ce même extrait ont été analysées en doublons, avec ou sans T4 gène, en parallèle lors de la même manipulation 54

55 (figure 27). Nous observons que sans T4 gène, la dernière dilution donnant un signal positif est celle au dixième; alors qu avec T4 gène, nous obtenons un signal jusqu à la dilution au millième. De plus, dans les mix avec T4 gène, la phase exponentielle est plus prononcée, avec une intensité finale de fluorescence supérieure. L addition de T4 gène dans le mélange réactionnel montre donc un réel gain pour améliorer l efficacité et la sensibilité de notre technique. Name Ct Given Conc (Copies) dilution 1/10 + T4 gene dilution 1/100 + T4 gene dilution 1/ T4 gene dilution 1/ T4 gene 23,50 8, ,49 8, , NEG (NTC) 89 Avec T4 gène dilution 1/10 25,40 8, dilution 1/100 NEG (NTC) 8, Sans T4 gène Figure 27 : RT-PCR avec des temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis, avec ou sans T4 gène - Optimisation de la température d hybridation La dilution au centième de cet extrait a été amplifiée avec le LightCycler 96. Le même mélange réactionnel a été déposé dans 6 tubes différents, et un gradient a été appliqué lors des cycles d amplification: la température d hybridation variait de 54 C à 61,9 C selon les tubes (figure 28). Le C t le plus bas (29,33) est obtenu avec une température d hybridation de 59,3 C (figure 29). La température d hybridation choisie par la suite a donc été de 59 C. Une RT-PCR a été réalisée dans les mêmes conditions que celles illustrées par la figure 27, 55

56 excepté la température d hybridation qui était de 59 C au lieu de 60 C. Les résultats ne présentaient pas de différence notable. Cette température d hybridation optimale voisine de 60 C est à rapporter aux Tm des amorces et de la sonde spécifiques du VHD (50, 62 et 72 C). Figure 28 : Gradient de température d hybridation Figure 29 : C t obtenus dans les tubes soumis au gradient de température d hybridation - Cycles de 3 étapes Notre laboratoire a l habitude de réaliser les PCR temps réel avec des cycles en 3 étapes. L addition d une étape d amplification à 72 C permet de raccourcir la durée globale de l hybridation-amplification, car 72 C correspond à l optimum thermique de la Taq polymérase. Un essai a été effectué à partir des dilutions de l extrait n en appliquant des cycles de 3 étapes: 30 secondes de dénaturation à 94 C, 30 secondes d hybridation à 59 C, et 15 secondes d amplification à 72 C (figure 30). En comparaison des résultats présentés en figure 27, les C t sont plus élevés, mais la limite de détection est abaissée, et l allure des courbes est conservée. Par conséquent, le passage à des cycles de 3 étapes a été adopté. 56

57 Figure 30 : RT-PCR aux temps de rétro-transcription et d activation de la Taq polymérase raccourcis, en présence de T4 gène, avec température d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes - Cycles de 3 étapes avec dénaturation raccourcie Afin de raccourcir la durée de la RT-PCR, nous avons tenté de diminuer le temps de dénaturation de 30 secondes à 15 secondes. Pour cela, des dilutions du même extrait ont été testées, engendrant des résultats semblables à ceux obtenus avec une dénaturation de 30 secondes (figures 30 et 31). Par contre, d autres manipulations avec 5 secondes de dénaturation ont donné des résultats nettement moins bons. L étape de dénaturation a donc été raccourcie à 15 secondes. 57

58 Figure 31 : RT-PCR aux temps de rétro-transcription, d activation de la Taq polymérase et de dénaturation raccourcis, en présence de T4 gène, avec température d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes - Doublement de la quantité de Taq polymérase Les dilutions de cet extrait ont été analysées en doublons, en présence de concentrations de Taq polymérase de 0,1 U/µL et de 0,2 U/µL, en parallèle dans la même série (figure 32). Les C t sont plus faibles avec une concentration 2 fois supérieure de Taq polymérase, d où un doublement de la quantité de cette enzyme lors des manipulations ultérieures. 58

59 Figure 32 : Comparaison de 2 concentrations de Taq polymérase 0,1 U/µL (à gauche) et 0,2 U/µL (à droite) sur une RT-PCR avec des temps de rétro-transcription, d activation de la Taq polymérase et de dénaturation raccourcis, en présence de T4 gène, avec température d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes - Chauffage des échantillons avant dépôt Afin de faciliter la linéarisation des séquences cibles pour optimiser l accessibilité des amorces, des dilutions de l extrait n ont été chauffées 10 minutes à 65 C puis plongées dans de la glace avant leur introduction dans le mélange réactionnel. Simultanément, les mêmes échantillons ont été analysés sans avoir été chauffés au préalable. Il s avère que l étape pré-analytique à 65 C permet de diminuer les C t (figure 33). Au laboratoire du CNR, les échantillons sont préalablement chauffés 5 minutes à 100 C puis plongés dans de l éthanol à -20 C. Nous avons testé cette méthode sur 3 extraits. Les résultats obtenus étaient semblables à ceux après chauffage des échantillons 10 minutes à 65 C et immersion dans de la glace. L étape pré-analytique que nous avons choisie correspond à cette deuxième solution, moins contraignante techniquement. 59

60 Figure 33 : Comparaison de 2 RT-PCR, sans (à gauche) et avec chauffage préalable à 65 C (à droite) avec des temps de rétro-transcription, d activation de la Taq polymérase et de dénaturation raccourcis, en présence de T4 gène, avec T C d hybridation de 59 C et amplification en 3 étapes - Essai de RT-PCR en 2 étapes Des dilutions d extraits positifs pour l ARN du VHD ont subi une RT-PCR en 2 étapes. Une rétro-transcription est réalisée grâce à des amorces hexamères, puis le mix réactionnel de PCR est ajouté et le mélange transféré sur Rotor-Gene Q. Les résultats obtenus sont similaires à ceux d une RT-PCR en une étape des mêmes dilutions (tableau 9). Tableau 9 : Comparaison d une RT-PCR en 1 étape et d une RT-PCR en 2 étapes - Synthèse des modifications adoptées Les changements apportés au mode opératoire par rapport aux conditions définies initialement décrites dans les parties F-1-5) et F-2-2) sont les suivants : - chauffage préalable des échantillons 10 minutes à 65 C, puis immersion dans de la glace - addition de T4 gène - concentration de Taq polymérase de 0,2 U/µL - rétro-transcription courte (5 minutes) - activation de la Taq polymérase courte (10 secondes) - cycles en 3 étapes: 15 secondes à 94 C, 30 secondes à 59 C, 15 secondes à 72 C. 60