ESSAIS INTERLABORATOIRES DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE PROGRAMME 2014

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1 ESSAIS INTERLABORATOIRES DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE PROGRAMME 2014 ESSAIS INTERLABORATOIRES (EIL) PORTANT SUR DES PARAMÈTRES MICROBIOLOGIQUES DANS LES DENRÉES ALIMENTAIRES L ASBL REQUASUD ( organise des essais interlaboratoires (EIL) de microbiologie alimentaire depuis En 2013, 18 laboratoires de Belgique et du Luxembourg ont pris part aux EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD. L organisation des EIL est assurée par la Cellule de Coordination de REQUASUD : Marie-Julie Goffaux +32 (0) L organisation et l expertise techniques (préparation des matériaux) sont confiées au Laboratoire de Microbiologie Alimentaire de l UCL (ELI-M) : Marleen Abdelmassih Place Croix du Sud 2 L Louvain-la-Neuve : +32 (0) L analyse statistique des résultats est confiée au statisticien de la cellule de coordination de l ASBL REQUASUD : Elena Pitchugina +32 (0) L expertise statistique est confiée au CRA-W Département Agriculture et milieu naturel (D3), Unité Systèmes agraires, territoire et technologie de l information (U11) : Contact : V. Planchon +32 (0) Les EIL de REQUASUD répondent aux prescriptions de la norme ISO (demande d accréditation en cours auprès de BELAC). L organisation et la conception des EIL sont décrites dans un Manuel Qualité (disponible sur demande) et des procédures. 1. OBJECTIFS DES EIL DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE DE REQUASUD L objectif des EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD est d évaluer et de démontrer la performance des laboratoires participants et de suivre leur justesse dans le temps, conformément à la norme ISO Les EIL de microbiologie de REQUASUD sont exploités par les laboratoires dans le cadre de l évaluation de leurs performances, de la validation de nouvelles méthodes d analyse, de la formation continue du personnel ainsi que de l harmonisation des méthodes au sein de plusieurs laboratoires. D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

2 Ces EIL incluent la plupart des paramètres analysés en routine, avec des niveaux de contamination proches de ceux rencontrés en routine : - Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles - Dénombrement des B. cereus - Dénombrement des spores aérobies - Dénombrement des bactéries lactiques mésophiles - Dénombrement des staphylocoques à coagulase positive - Dénombrement des entérobactéries - Dénombrement des coliformes totaux - Dénombrement des E. coli - Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs - Dénombrement des C. perfingens - Dénombrement des levures et moisissures osmophiles/non-osmophiles - Dénombrement des L. monocytogenes - Dénombrement des Campylobacter spp - Détection de L. monocytogenes - Détection de Salmonella spp - Détection de E. coli O157:H7 L évaluation de la performance est réalisée pour chacun de ces paramètres analytiques, grâce à une étude de la fidélité et de la justesse du laboratoire, basée sur les normes ISO et ISO ORGANISATION DES EIL L ASBL REQUASUD organise annuellement deux EIL de microbiologie, dont le planning est communiqué aux laboratoires participants l année précédente. Pour l année 2014, le planning des EIL est le suivant : EIL MIC 14-1 du 20/01/14 : Matrices analysées : Saucisson de jambon, lait entier UHT Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles, entérobactéries, coliformes, E. coli, B. cereus, spores aérobies, bactéries lactiques, S. aureus, anaérobies sulfitoréducteurs, C. perfringens, Campylobacter spp et L. monocytogenes Recherche de salmonelles et de E. coli O157:H7 EIL MIC 14-2 du 08/09/14 : Matrices analysées : Saumon fumé, lait de soja, cake Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles, entérobactéries, coliformes, E. coli, B. cereus, bactéries lactiques, S. aureus,, anaérobies sulfito-réducteurs, C. perfringens et des levures et moisissures (osmophiles et non-osmophiles) Recherche de L. monocytogenes Plusieurs semaines avant le début de l EIL, des instructions claires sont envoyées aux laboratoires (formulaire F MIC E07), par courrier électronique, pour l analyse des objets soumis à l essai. Ce formulaire comprend les instructions spécifiques sur la réception (date, mesure de la température de réception), la conservation (à 4 C) des échantillons, leur analyse et la manière d enregistrer et de D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

3 retourner les résultats d essais (adresse mail, date limite). Les objets soumis à l essai doivent être analysés à la date imposée et traités de la même manière que les échantillons de routine. Les échantillons sont distribués par des transporteurs professionnels, en conditions de réfrigération et le jour de leur conception. Chaque laboratoire reçoit ainsi un lot de matériaux pour essai réfrigérés, dans un sachet nominatif. L analyse est effectuée par tous les laboratoires le jour suivant la réception des échantillons. A partir de la date de réception des échantillons, les laboratoires participants disposent de 9 jours pour envoyer leurs résultats d analyses à la cellule de coordination, en complétant le formulaire F MIC E07 transmis. Les méthodes d analyse utilisées par les différents laboratoires doivent être des méthodes de référence ou des méthodes alternatives validées suivant l ISO appartenant à la liste des méthodes reconnues par l AFSCA; ceci afin d éviter la production de résultats trop différents devant subir un traitement statistique séparément. Si une autre méthode est utilisée par un laboratoire, l organisateur évaluera la méthode en question et décidera d accepter ou non la demande de participation du laboratoire concerné. En cas de doute, l organisateur vérifie statistiquement si les méthodes différentes donnent des résultats significativement différents, c est-à-dire si la différence entre les niveaux de contamination moyens obtenus est supérieure à 0,3 log (limite de productivité généralement admise pour les milieux gélosés, selon l ISO ). Si la différence est bien supérieure à 0,3 log, les résultats des méthodes concernées seront analysés en clusters séparés (sauf si le plus petit cluster contient moins de 6 résultats, auquel cas il sera exclu de l analyse statistique). Un rapport d essai est transmis à chaque laboratoire participant dans les 2 mois suivant le retour des valeurs observées à la cellule de coordination. Ce rapport fait état de leur performance individuelle et permet aux laboratoires de se situer par rapport à l ensemble des participants. En cas de contestation des résultats, les laboratoires ont la possibilité d introduire une réclamation auprès de la cellule de coordination de REQUASUD. 3. MATÉRIAUX D ESSAI Deux catégories de matériaux pour essai sont intégrées dans les EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD : Matrices alimentaires naturellement contaminées et artificiellement inoculées : La moitié des matériaux pour essai est constituée de matrices alimentaires naturellement contaminées et artificiellement inoculées, représentatives des échantillons analysés par les laboratoires en routine. Les matrices naturellement contaminées sont généralement de type saumon fumé, saucisson de jambon, cake ou lait cru. Matrices alimentaires stériles inoculées : L autre moitié des matrices alimentaires utilisées est stérile (généralement du lait entier ou du lait de soja) et artificiellement contaminée, afin de garder un contrôle sur les valeurs cibles en cas de forte contamination naturelle des autres matrices. Les matériaux d essai sont préparés par le laboratoire expert technique (laboratoire ELIM de l UCL), suivant une procédure validée incluant une étape d'homogénéisation. L homogénéité des lots distribués lors de chaque campagne d EIL est validée par l organisateur suivant une procédure statistique. La stabilité des objets soumis à l essai fait également l objet d une validation sur la durée de l EIL. Les conclusions des tests d homogénéité et de stabilité des objets soumis à l essai sont présentées dans le rapport d EIL. D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

4 Les valeurs assignées des matériaux d essai sont déterminées a posteriori comme étant la moyenne consensuelle des participants. Les objets sont introduits en double pour permettre une évaluation de la répétabilité de chaque laboratoire (ISO et ISO 5725). 4. ANALYSE STATISTIQUE L analyse statistique des résultats d EIL est réalisée suivant les prescriptions des normes ISO et ISO 5725, comme décrit brièvement ci-dessous. 4.1 COMPILATION DES DONNÉES Avant tout calcul statistique, l ensemble des données est compilé et transformé en log afin que ces dernières suivent une distribution normale. A ce stade, les valeurs de type «inférieur à» sont remplacées par la moitié de la valeur indiquée (par exemple, un résultat «< 100 CFU/g» sera remplacé par «50 CFU/g») afin de permettre l analyse statistique. Les valeurs de types «supérieur à» seront remplacées par le même résultat sans le signe «>» (par exemple, un résultat «> 100 CFU/g» sera remplacé par «100 CFU/g») pour permettre l analyse statistique, et le z-score obtenu se verra ajouter le signe «>». 4.2 DÉTECTION DES VALEURS ABERRANTES POUR LA VARIANCE OU LA MOYENNE Les valeurs suspectes et aberrantes pour la variance ou la moyenne sont détectées respectivement grâce aux tests de Cochran et de Grubbs (suivant la norme ISO 5725). Les valeurs suspectes sont signalées par un symbole «#» dans les tableaux de résultats. Les valeurs aberrantes sont signalées par un symbole «##» et éliminées de la suite de l analyse statistique. 4.3 DÉTERMINATION DE LA VALEUR ASSIGNÉE DES MATÉRIAUX D ESSAI Dans les EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD, la valeur assignée des matériaux d essai est la moyenne des résultats obtenus par tous les participants, après suppression des valeurs aberrantes. 4.4 ECART-TYPE POUR L ÉVALUATION DES PERFORMANCES L écart-type robuste (s*) est utilisé dans le calcul des z-scores, et sert donc à l évaluation de la justesse des laboratoires. Il est également utilisé pour établir les limites de tolérance (ou incertitude élargie «U») autour de la valeur cible, suivant la formule U 95% = 2 s*. Sur les graphiques de résultats d EIL, ces limites de tolérance apparaissent comme des pointillés autour de la valeur assignée. Dans les EIL de de microbiologie alimentaire de REQUASUD, s* est calculé comme étant la moyenne robuste de tous les résultats obtenus durant les EIL REQUASUD depuis Cette moyenne robuste est calculée au moyen de l Algorithme A de l ISO Cet écart-type robuste est calculé pour chaque paramètre analysé lors des EIL. Il est re-calculé annuellement jusqu à ce qu un minimum de 10 résultats aient été accumulés ; il peut ensuite être fixé. Le tableau ci-dessous récapitule les écart-types robustes de la chaine Microbiologie de REQUASUD pour chaque paramètre analytique (données ). D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

5 Paramètre s* REQUASUD Germes totaux 0,25 Lactiques 0,25 S. aureus 0,25 B. cereus 0,25 Spores aérobies 0,35 Entérobactéries 0,25 Coliformes 0,25 E. coli 0,25 Anaérobies sulfito-réducteurs 0,25 Clostridium perfringens 0,25 L. monocytogenes (non figé) Levures 0,25 Moisissures 0,25 Campylobacter spp (non figé) Germes totaux anaérobies (non figé) Note : L utilisation de s* robustes basés sur une accumulation de données est un choix de REQUASUD afin d augmenter la fiabilité de l analyse statistique. Toutefois, lorsque le nombre de participants est supérieur à 10, il est tout aussi correct d utiliser le sr du seul EIL considéré. Chaque laboratoire a donc la possibilité de recalculer ses z-scores en utilisant les sr propres à l EIL, qui sont donnés dans le rapport d EIL. 4.5 JUSTESSE L évaluation de la justesse est basée sur le calcul des z-scores : les résultats de chaque participant sont comparés à la valeur assignée, avec une zone de tolérance (proportionnelle à s*) autour de cette valeur. Les z-scores reflètent donc la cohérence entre le résultat analytique et la valeur assignée : mi M z = s * où m i est la moyenne des résultats du ième laboratoire ; M est la valeur assignée ; s* est l écart-type pour l évaluation des performances. Pour l interprétation de la justesse, la norme ISO préconise les limites suivantes sur base de la valeur absolue du z-score : [ 0 2 ]: résultat satisfaisant ] 2 3 ]: signe de surveillance ] 3...[: signe d action D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

6 4.6 FIDÉLITÉ L évaluation de la fidélité des participants est basée sur leur répétabilité, qui est calculée grâce à la duplication en aveugle de certains échantillons de l EIL. Chaque laboratoire peut ainsi analyser deux échantillons identiques, en conditions de répétabilité, ce qui donne des résultats m 1 et m 2. Le calcul de la répétabilité limite (r) du laboratoire est alors réalisé comme suit : s r = STDEV(m 1,m 2 ) r = 2,772. s r L interprétation du r est laissée aux laboratoires ; des limites indicatives peuvent être issues des normes (par exemple dans les normes ISO 4833, ISO 7932 et ISO 7937). 5. RAPPORT Dans un délai de 2 mois après le début de la campagne, un rapport (F MIC E03) est envoyé à chaque laboratoire ayant participé à l EIL. Ce rapport se compose des parties suivantes : - un rappel des objectifs des EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD ; - une description des modalités pratiques de l EIL (conditions de transport, niveaux d inoculation, méthodes d analyses, ) ; - les résultats de l EIL et les commentaires de l organisateur. 5.1 PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE DÉNOMBREMENTS Pour les analyses quantitatives, la performance des laboratoires est présentée en termes de justesse (z-score) et de fidélité (répétabilité) de leurs résultats. Le rapport présente la valeur assignée de chaque matériau d essai. Celle-ci est calculée comme étant la moyenne de l ensemble des résultats, après élimination des valeurs aberrantes. Le niveau d inoculation des échantillons n est donné qu à titre indicatif. Pour chaque paramètre quantitatif l écart-type et le z-score du laboratoire sont donnés. 5.2 PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE DÉTECTIONS La performance des laboratoires pour les recherches de pathogènes est évaluée sur la sensibilité (absence de faux-négatifs) et la sélectivité (absence de faux-positifs). Le rapport présente, dans un tableau, les résultats attendus et les résultats obtenus par les laboratoires. 6. CONFIDENTIALITÉ Une politique de confidentialité est suivie pour l organisation des EIL. Un numéro est attribué à chaque laboratoire participant. Le lien entre l identité des laboratoires participants et le numéro attribué n apparait sur aucun document diffusé, ni en interne, ni en externe dans le réseau à l exception du document D RQ E01 (protégé informatiquement) qui est conservé et consultable uniquement par le coordinateur. Le coordinateur et le responsable techniquert de la chaine microbiologiee sont les seuls à connaitre la correspondance des numéros des différents participants aux EIL MIC. Chaque laboratoire participant connait uniquement son propre numéro. D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7

7 Dans le cadre de législations particulières, l ASBL REQUASUD pourrait être amenée à transmettre les résultats des EIL à une autorité particulière. Dans ce cas, les participants seront avertis préalablement par écrit. Pour l année 2014, les résultats aux EIL de microbiologie de REQUASUD des laboratoires agréés seront encodés automatiquement dans le module PT-Scheme de l AFSCA. Des mesures sont prises pour garantir la confidentialité des données tout au long du processus. Des déclarations de confidentialité sont signées par tous les intervenants dans l organisation des EIL. 7. COLLUSION, FALSIFICATION En cas de suspicion de falsification ou de collusion entre participants, REQUASUD se réserve le droit de demander aux laboratoires participants des preuves de la bonne réalisation de l essai (feuilles de paillasse, cartes de contrôle, ). 8. PARTICIPATION AUX EIL DE REQUASUD 8.1. CRITÈRES DE PARTICIPATION Les demandes de participation et les reconductions sont traitées suivant la procédure P RQ C01. Les critères de participation spécifiques à la chaine MIC sont évalués grâce au formulaire F RQ C25, qui comprend notamment les points suivants : - Etre un laboratoire de microbiologie alimentaire - Utiliser des méthodes d analyse de référence ou alternatives validées suivant l ISO Etre localisé dans une zone géographique compatible avec les tournées de livraison - Etre en mesure de comprendre les instructions dans les langues officielles de l ASBL (français et anglais) 8.2. FRAIS D INSCRIPTION Pour les laboratoires externes au réseau REQUASUD, le coût de participation annuelle est fixé à 500,00 euros hors TVA. La procédure P RQ C01 définit la gestion des demandes de participation aux EIL REQUASUD MODALITÉS PRATIQUES Les laboratoires déjà inscrits aux EIL REQUASUD reçoivent automatiquement une offre pour l année suivante. Pour toute nouvelle demande de participation, prendre contact avec : M-J. Goffaux La procédure d inscription est détaillée dans la P RQ C01 disponible sur demande. L inscription est validée après réception du payement. D RQ E05 v05 (fr) du 21/11/ / 7