Développement de l imagerie RMN par agents CEST : application à un modèle rongeur de tumeur cérébrale

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1 Développement de l imgerie RMN pr gents CEST : ppliction à un modèle rongeur de tumeur cérérle Julien Flment To cite this version: Julien Flment. Développement de l imgerie RMN pr gents CEST : ppliction à un modèle rongeur de tumeur cérérle. Other. Université Pris Sud - Pris XI, French. <NNT : 2012PA112094>. <tel > HAL Id: tel Sumitted on 23 Jul 2012 HAL is multi-disciplinry open ccess rchive for the deposit nd dissemintion of scientific reserch documents, whether they re pulished or not. The documents my come from teching nd reserch institutions in Frnce or rod, or from pulic or privte reserch centers. L rchive ouverte pluridisciplinire HAL, est destinée u dépôt et à l diffusion de documents scientifiques de niveu recherche, puliés ou non, émnnt des étlissements d enseignement et de recherche frnçis ou étrngers, des lortoires pulics ou privés.

2 UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11 ÉCOLE DOCTORALE : LABORATOIRE : DISCIPLINE : Sciences et Technologies de l Informtion des Télécommunictions et des Systèmes (STITS) Lortoire d Imgerie et de Spectroscopie RMN (CEA/DSV/I²BM/NeuroSpin/LRMN) Sciences Physiques - Imgerie Médicle THÈSE DE DOCTORAT Soutenue le 20 juin 2012 pr Julien FLAMENT DÉVELOPPEMENT DE L IMAGERIE RMN PAR AGENTS CEST : APPLICATION À UN MODÈLE RONGEUR DE TUMEUR CÉRÉBRALE COMPOSITION DU JURY : RAPPORTEURS : Emmnuelle CANET-SOULAS Professeur, UCBL, Lyon Roert MULLER Professeur, UMH, Mons EXAMINATEURS : Brigitte GILLET PhD, UPSUD, Orsy Mrc PORT PhD, Gueret, Aulny-sous-Bois DIRECTEUR DE THÈSE : Gilles BLOCH PhD, CEA, Fonteny-ux-Roses ENCADRANT DE THÈSE : Fwzi BOUMEZBEUR PhD, CEA, Scly

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4 Remerciements Ces qutre nnées pssées à NeuroSpin ont été pour moi une source immense d enrichissements scientifiques et techniques. Elles m ont ussi et surtout permis de fire des rencontres humines formidles. Je tiens donc pr l intermédiire de ces quelques lignes à remercier l ensemle des personnes que j i pu côtoyer durnt cette période et qui ont lrgement contriué à l réussite, je l espère, de cette thèse. MERCI... à Fwzi Boumezeur pour son encdrement, son ide quotidienne et son soutien dns les instnts difficiles de l imgerie CEST. Ces moments de recherche et de mnipes mis ussi de détente pssés vec lui m ont été très plisnts et prticulièrement instructifs.... à Gilles Bloch pour voir ccepté de porter l csquette de Directeur de thèse en dépit de ses très nomreuses responsilités.... à Frnck Lethimonnier pour son investissement dns le cdre du projet Iseult et pour ses conseils toujours très éclirés.... à Emmnuelle Cnet-Souls et à Roert Muller pour voir rpporté mon trvil de thèse insi qu à Brigitte Gillet et Mrc Port pour leur prticiption à mon jury.... à Denis Le Bihn pour son ccueil u sein de NeuroSpin.... à l ensemle des memres du projet Iseult, et prticulièrement à Julien Vlette, Séstien Mériux et Aurélie Verpilleux pour les nomreux échnges scientifiques que nous vons pu voir, mis ussi pour les discussions plus légères qui ont certinement contriué à l très onne mince u sein du projet

5 ... à toute l équipe de Gueret, Clire Corot, Philippe Roert, Mrc Port, Croline Roic, Christelle Médin, Jen-Séstien Rynud, Gëlle Louin, Jen-Frnçois Myer, Xvier Viols et Roin Sntus pour leur collortion fructueuse dns le domine des lipocest.... à mes colytes de l espce ouvert 1025A, Benjmin Mrty, Céline Girudeu, Olivier Reynud, Ilen Jelescu, Alfredo Lopez et Ludovic Broche pour les moments de frnche rigolde pssés ensemle. Je suis sûr que nous serons menés à trviller ensemle à l venir et j espère que l esprit du Bureu des Horreurs perdurer.... à Frnçoise Geffroy pour ses tlents d histologiste et de cuisinière et surtout pour s onne humeur quotidienne.... à Boucif Djemï pour son ide prfois tôt le mtin et prfois trd le soir lors de mes mnipes.... à l ensemle des Mus musculus et Rttus norvegicus (ou souris et rts pour les noms vernculires) qui ont contriué à l réussite de mes mnipes.... ux inventeurs de l indispensle Trltne et des seringues «multifonction» Terumo.... à toute m fmille pour son soutien indéfectile et pour l relecture ttentive de ce mnuscrit.... et enfin à Élise pour s présence à mes côtés et pour l suite de l venture! - 4 -

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8 Tle des Mtières Liste des Arévitions 13 Liste des Figures 17 Liste des Tleux 21 CHAPITRE I - Contexte de l thèse 23 I.1. Introduction générle 23 I.2. Présenttion de NeuroSpin 24 I.3. Le Projet Iseult 26 I.4. Orgnistion du mémoire de thèse et contriutions 28 Biliogrphie du chpitre I 29 CHAPITRE II - Imgerie moléculire 31 II.1. Introduction 31 II.2. Les modlités d imgerie moléculire 32 II.2.. Tomogrphie d émission de positons 32 II.2.. Tomogrphie d émission monophotonique 33 II.2.c. Imgerie Optique 33 II.2.d. Imgerie pr Résonnce Mgnétique Nucléire 34 II.3. Comprison des modlités d imgerie moléculire 35 II.4. Vers l quntifiction en imgerie moléculire

9 Biliogrphie du Chpitre II 38 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique 41 III.1. Introduction 41 III.2. Théorie 42 III.2.. Equtions de Bloch-McConnell 42 III.2.. Condition d oservtion des popultions de spins A et B 44 III.2.c. Trnsfert de sturtion 47 III.2.d. Crctéristion du trnsfert d imnttion 52 III.3. Applictions 54 III.3.. Imgerie MT 54 III.3.. Imgerie dicest et APT 56 II.3.c. Imgerie prcest 58 Biliogrphie du Chpitre III 60 CHAPITRE IV - Les lipocest 65 IV.1. Générlités 65 IV.1.. Description 66 IV.1.. Influence du complexe de Lnthnide prmgnétique 68 IV.1.c. Influence de l memrne 70 IV.2. Optimistion des lipocest 73 IV.2.. Choix du Ln(III) 73 IV.2.. Choix du lignd 74 IV.2.c. Choix de l memrne 76 IV.2.d. Furtivité et Fonctionnlistion 77 IV.3. Formultion retenue et crctéristiques CEST

10 Biliogrphie du chpitre IV 81 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T 87 V.1. Montge expérimentl 87 V.1.. Scnner IRM 7T 87 V.1.. Sondes rdiofréquences 88 V.1.c. Anesthésie et positionnement des nimux 89 V.2. L Séquence CEST-MSME 89 V.2.. Présenttion 89 V.2.. Reconstruction 91 V.2.c. Module de sturtion 92 V.2.d. Choix de l puissnce et de l fréquence de sturtion 94 V.4. Acquisition des crtes de chmps B 1 et B 0 96 V.4.. Contrôle de l homogénéité du chmp B 1 96 V.4.. Contrôle de l homogénéité du chmp B 0 97 V.5. Protocole d imgerie CEST in vivo 99 Biliogrphie du chpitre V 101 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés 105 VI.1. Introduction 105 VI.1.. Enjeux de l imgerie moléculire de l tumeur cérérle 105 VI.1.. Mécnisme de l ngiogenèse tumorle 106 VI.1.c. Détection de l ngiogenèse tumorle 107 VI.2. Mtériels et Méthodes 109 VI.2.. Modèle niml 109 VI.2.. Protocole d imgerie

11 VI.2.c. Anlyse pr région d intérêt du contrste CEST 111 VI.2.d. Histologie et microscopie de fluorescence 112 VI.3. Résultts 113 VI.3.. Crctéristion des lipocest et du contrste MT 113 VI.3.. Détection in vivo des lipocest 114 VI.3.c. Sensiilité et persistnce du contrste CEST 115 VI.3.d. Vlidtion histologique 119 VI.4. Discussion 121 VI.4.. Tille des tumeurs U VI.4.. Significtivité sttistique des contrstes CEST oservés 121 VI.4.c. Justifiction du contrste CEST 123 VI.4.d. Avntges et limittions des lipocest 124 VI.5. Conclusion 125 Biliogrphie du chpitre VI 126 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo 131 VII.1. Modélistion des échnges de protons in vivo en présence d gents CEST 132 VII.1.. Modèle à 4 comprtiments 132 VII.1.. Détermintion des prmètres du modèle pour les contrstes APT et MT 137 VII.1.c. Détermintion des prmètres du modèle pour les lipocest 142 VII.2. Outil d Anlyse Quntittive (OAQ) 144 VII.2.. Architecture de l Outil d Anlyse Quntittive 144 VII.2.. Vlidtion in vitro de l OAQ 146 VII.3. Appliction in vivo de l OAQ chez l souris U VII.3.. Quntifiction des lipocest in vivo 148 VII.4.. Vers l modélistion comprtimentle

12 VII.5. Conclusion 156 Biliogrphie du chpitre VII 157 CHAPITRE VIII - Conclusion générle 161 Biliogrphie du chpitre VIII 164 Annexe

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14 Liste des Arévitions 1 H Proton α eff α ν β 3 δ st Δ λ γ σ APT B 0 B 1 BSM C 0 CEA CEST CNR CPMG d H dicest DSV FA GFP Angle de scule effectif de l imnttion Intégrine surexprimée lors de l ngiogenèse tumorle Fréquence de sturtion Déplcement chimique Longueur d onde Rpport gyromgnétique du proton Ecrt-type du ruit Amide Proton Trnsfer Chmp mgnétique sttique Chmp mgnétique vrile Bulk Mgnetic Susceptiility Concentrtion mximle théorique Commissrit à l Energie Atomique et ux Energie Alterntives Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer Rpport contrste-sur-ruit Crr-Purcell-Meioom-Gill Dimètre hydrodynmique Agent de contrste CEST dimgnétique Direction des Sciences du Vivnt Fcteur d mplifiction Green Fluorescent Protein

15 I²BM Institut d Imgerie BioMédicle IC 50 Concentrtion Inhiitrice 50 ICP-AES IRM IV lipocest Ln 3+ LRMN M 0 MSME MT MTR MTRsym M x,y M z n coupe n lipocest OAQ prcest PEG PFA ph ppm PTR q RF Inductively Coupled Plsm Atomic Emission Spectroscopy Imgerie pr Résonnce Mgnétique Intrveineuse Agent de contrste CEST liposoml Lnthnide(III) Lortoire d imgerie et spectroscopie RMN Aimnttion initile Multi-Slices Multi-Echos Mgnetiztion Trnsfer Mgnetiztion Trnsfer Rtio symmetric Mgnetiztion Trnsfer Rtio Composntes trnsverses de l imnttion Composnte longitudinle de l imnttion Nomre de coupes Nomre de molécules d eu déplcées pr lipocest Outil d Anlyse Quntittive Agent de contrste CEST prmgnétique Poly Ethylène Glycol Prformldehyde Potentiel hydrogène Prtie pr million Proton Trnsfer Rtio Nomre de coordintion Rdiofréquence

16 RGD r i RMN ROI SAR SNR S.R.E t T 1 T 2 * T 2 T cq TE TEP TEMP T in Tm 3+ T out TR T st U87MG USPIO VEGF WASSR Peptide rginine-glycine-cide sprtique Ryon interne du liposome Résonnce Mgnétique Nucléire Région d intérêt Specific Asorption Rte Rpport signl-sur-ruit Système réticulo-endothélil Temps Temps de relxtion longitudinle Temps de relxtion trnsverse Temps de relxtion trnsverse pprent Temps d cquisition Temps d écho Tomogrphie pr Emission de Positons Tomogrphie d émission monophotonique Temps d entrée du produit Thulium(III) Temps de sortie du produit Temps de répétition Temps de sturtion Cellules mlignes de gliolstome humin Ultrsmll SuperPrmgnetic Iron Oxides Fcteur de croissnce de l endothélium vsculire WAter Sturtion Shift Referencing

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18 Liste des Figures Figure F.I.1 : Photo de NeuroSpin 25 Figure F.I.2 : Vue en coupe du futur imgeur 11,75T 26 Figure F.I.3 : Principe du RF shimming sttique 27 Figure F.II.1 : Chîne de tritement de données pour l quntifiction en imgerie moléculire 37 Figure F.III.1 : Schém d une séquence de trnsfert de sturtion 42 Figure F.III.2 : Modèle à 2 comprtiments pour le trnsfert de sturtion 43 Figure F.III.3 : Spectres des popultions de spins A et B en fonction de l vitesse du tux d échnge 47 Figure F.III.4 : Tux de sturtion des spins A en fonction de M 0, de ex k et det 51 1 Figure F.III.5 : Z-spectrum et Z-spectrum symétrique simulés dns le cdre d un modèle à 2 comprtiments 53 Figure F.III.6 : Trnsfert d imnttion entre les protons lires et les protons liés 55 Figure F.III.7 : Appliction clinique de l imgerie de trnsfert de sturtion 56 Figure F.III.8 : Appliction clinique de l imgerie glucest 57 Figure F.III.9 : Appliction clinique de l imgerie APT 58 Figure F.IV.1 : Représenttion schémtique d un lipocest en milieu queux 67 Figure F.IV.2 : Structure des cinq lignds utilisés 70 Figure F.IV.3 : Structure des constitunts des memrnes des liposomes 71 Figure F.IV.4 : Schém du lipocest retenu pour le protocole d imgerie moléculire 79 Figure F.IV.5 : Z-spectr et Z-spectr symétriques cquis respectivement vec les lipocest contrôle et fonctionnlisé vec le peptide RGD 80 Figure F.V.1 : Scnner IRM 7T PhrmScn Bruker de NeuroSpin 87 Figure F.V.2 : Sondes rdiofréquences

19 Figure F.V.3 : Schém de l séquence CEST-MSME 90 Figure F.V.4 : Pondértion T 2 des échos u cours d un module CPMG 91 Figure F.V.5 : Reconstruction des imges CEST 92 Figure F.V.6 : Profil spectrl du module de sturtion 93 Figure F.V.7 : Evolution de l intensité de l effet CEST en fonction de T st 94 Figure F.V.8 : Z-spectrum 2D du RGD-lipoCEST 95 Figure F.V.9 : Crte typique de chmp B 1 97 Figure F.V.10 : Imges de sturtion directe utilisées pour l méthode WASSR et crte de chmp B 0 98 Figure F.V.11 : Protocole d imgerie CEST in vivo 99 Figure F.VI.1 : Imge RMN pondérée T 1 d un gliolstome humin près injection d gent de contrste à se de Gdolinium 105 Figure F.VI.2 : Mécnisme de l néo-ngiogenèse tumorle 107 Figure F.VI.3 : Schém d une intégrine α ν β Figure F.VI.4 : Imge ntomique de référence d une souris vec un gliolstome U Figure F.VI.5 : Evolution de l tille de l tumeur en fonction du nomre de jours près implnttion 110 Figure F.VI.6 : Délimittion mnuelle des ROI 112 Figure F.VI.7 : Z-spectr in vivo cquis dns un cerveu de souris 113 Figure F.VI.8 : Visulistion in vivo des lipocest 115 Figure F.VI.9 : Décours temporels du contrste MTRsym 116 Figure F.VI.10 : Persistnce du contrste CEST 118 Figure F.VI.11 : Coloclistion du RGD-lipoCEST vec l cile α ν β 3 dns l tumeur 120 Figure F.VI.12 : Significtivité sttistique en fonction du CNR 122 Figure F.VI.13 : Vsculristion des tissus tumorux et sins 123 Figure F.VII.1 : Schém du modèle d échnge de protons à 4 comprtiments 133 Figure F.VII.2 : Régions d intérêt des Z-spectr

20 Figure F.VII.3 : Ajustement des Z-spectr in vivo 139 Figure F.VII.4 : Détermintion des prmètres d échnge exogènes 143 Figure F.VII.5 : Schém d un lipocest vec les dimensions utilisées pour le clcul du nomre de molécules d eu internes n lipocest 143 Figure F.VII.6 : Quntifiction des données CEST pr l Outil d Anlyse Quntittive 145 Figure F.VII.7 : Vlidtion in vitro de l OAQ 147 Figure F.VII.8 : Crtes de concentrtion en lipocest 149 Figure F.VII.9 : Décours temporels de l concentrtion en lipocest 150 Figure F.VII.10 : Modèle à 3 comprtiments pour décrire l dynmique de prise de contrste CEST 152 Figure F.VII.11 : Ajustement des décours temporels de l concentrtion en lipocest pr une fonction iexponentielle 153 Figure F.VII.12 : Crtes prmétriques T in, T out et C

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22 Liste des Tleux Tleu T.II.1 : Comprison des différentes modlités d imgerie moléculire 36 Tleu T.IV.1 : Influence du Ln Tleu T.IV.2 : Choix du Lnthnide 74 Tleu T.IV.3 : Choix du lignd 75 Tleu T.IV.4 : Choix de l memrne 76 Tleu T.VI.1 : P-vlues clculées à l ide d un test de Student 117 Tleu T.VII.1 : Prmètres d échnge endogènes 140 Tleu T.VII.2 : Vlidtion in vitro de l OAQ 146 Tleu T.VII.3 : P-vlues clculées à l ide d un test de Student 150 Tleu T.VII.4 : Prmètres T in, T out et C 0 du modèle pour les 4 conditions

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24 CHAPITRE I - Contexte de l thèse CHAPITRE I Contexte de l thèse I.1 Introduction générle L Imgerie pr Résonnce Mgnétique Nucléire (IRM) est une discipline reltivement récente. Son histoire déute vec l découverte pr Isidor Isc Ri (prix Noel de Physique en 1944) du phénomène de résonnce mgnétique nucléire en 1938 (Ri et l., 1938). Portée pr les trvux notmment de Félix Bloch et Edwrd Mills Purcell (prix Noel de Physique en 1952), l RMN est d ord utilisée pour élucider les structures chimiques des composés (Bloch et l., 1946; Purcell et l., 1946). Ce n est qu en 1969 que Rymond Vhn Dmdin propose d utiliser l RMN pour distinguer des tissus, notmment les tissus sins et les tumeurs (Dmdin, 1971). Mis il fut ttendre l utilistion pr Pul Luterur en 1973 de grdients de chmp mgnétique permettnt l encodge sptil du signl RMN pour psser de l RMN à l IRM (Luterur, 1973). Prllèlement, les trvux de Peter Mnsfield sur le tritement mthémtique des signux RMN permettent de fciliter l reconstruction d imges interprétles à prtir des signux RMN (Mnsfield nd Grnnell, 1973). Ils ont tous deux été récompensés du prix Noel de Médecine en Dès lors, l IRM connu des développements importnts et s est imposée dns le domine médicl comme l outil de dignostic de référence pour l imgerie des tissus mous. L IRM «conventionnelle» fournit principlement des informtions structurelles à l échelle du millimètre. Or certins phénomènes pthologiques ne se mnifestent à cette échelle qu à prtir d un stde reltivement vncé. A cette limite de détectilité, se rjoute l difficulté à interpréter de fçon non-équivoque les contrstes et mrqueurs liés à l évolution de l mldie. C est pourquoi, u déut des nnées 2000, est née l volonté d imger directement les processus iologiques impliqués dns les pthologies. Outre un dignostic précoce, l visulistion in vivo de iomrqueurs spécifiques promet une meilleure compréhension des phénomènes physiopthologiques et une évlution «en temps réel» des tritements (Mssoud nd Gmhir, 2003; Rudin nd Weissleder, 2003; Weissleder, 2002). Si certines modlités d imgerie moléculire, notmment l tomogrphie pr émission de positons, permettent d ores

25 CHAPITRE I - Contexte de l thèse et déjà d ccéder à l visulistion de processus iologiques de fçon non-invsive, leur utilistion en routine clinique reste mrginle en rison de coûts importnts et de contrintes d utilistion. L perspective d utiliser l IRM comme modlité d imgerie moléculire prît donc très séduisnte (Rudin et l., 1999). L pluprt des hôpitux sont équipés de scnners IRM, c est une modlité d imgerie peu coûteuse et elle est fcile à mettre en œuvre. Ainsi, le développement de l imgerie moléculire pr IRM permettrit de repousser les limites ctuelles de l technique en permettnt l explortion de phénomènes iologiques spécifiques ynt lieu à l échelle moléculire ou cellulire tout en tirnt profit de ces touts, à svoir une hute résolution sptile et un on contrste entre les tissus. Pour cel, deux chllenges mjeurs doivent être relevés. Le premier consiste à ccroître directement ou indirectement l sensiilité de l IRM en l étt incomptile vec l détection de quelques nno voir picomoles de molécules. L piste principle pour ugmenter l sensiilité de détection de l IRM est d ugmenter l imnttion des spins. C est dns cette optique que NeuroSpin été créé, fin de repousser un peu plus loin les limites ctuelles de l IRM grâce à l utilistion de très huts chmps mgnétiques. Le second prolème à résoudre est celui de l spécificité du contrste IRM. Pour cel, NeuroSpin s est llié vec l industriel Gueret fin de mettre u point une nouvelle génértion d gents de contrste fonctionnlisés. Cette llince s est cristllisée utour du projet Iseult que nous détillons dns l suite de ce chpitre. I.2 Présenttion de NeuroSpin NeuroSpin est un service de l Institut d Imgerie BioMédicle (I²BM), rttché à l Direction des Sciences du Vivnt (DSV) du Commissrit à l Energie Atomique (CEA). Il été inuguré en 2007 et est dirigé pr le Professeur Denis Le Bihn. L ojectif principl de NeuroSpin est de lever les verrous technologiques et méthodologiques de l IRM cérérle à très hut chmp mgnétique. Pour cel, NeuroSpin regroupe une équipe pluridisciplinire de physiciens, informticiens, iologistes, neuropsychologues, médecins, techniciens et infirmières utour d un prc d imgeurs précliniques (7T et 17,2T) et cliniques (3T et 7T) unique en Frnce. Cette proximité entre des outils d investigtion précliniques et cliniques été voulue fin de fciliter le trnsfert technologique de l souris à l homme. Pr illeurs, l volonté étit de rssemler en un même lieu des experts en méthodologie RMN, en tritement du signl, en

26 CHAPITRE I - Contexte de l thèse neurosciences et médecins pour repousser les limites de l IRM et mieux comprendre le cerveu à l étt norml et pthologique. Figure F.I.1 : Photo de NeuroSpin. Le âtiment extérieur rppelle l forme sinusoïdle des impulsions rdiofréquences utilisées en IRM. Les équipes de recherche et de support de NeuroSpin sont orgnisées utour de cinq lortoires : - le lortoire d imgerie et spectroscopie RMN (LRMN) dirigé pr Cyril Poupon et où cette thèse été rélisée, - le lortoire de Neuro-Imgerie Assistée pr Ordinteur (LNAO) dirigé pr Jen- Frnçois Mngin, - le lortoire de Sciences Cognitives (LCogn) dirigé pr Stnisls Dehene, - le lortoire de Biologie Intégrée (LBI) dirigé pr Michel Bottlender, - le lortoire d Investigtion Biomédicle (LBiom) dirigé pr Lucie Hertz-Pnnier

27 CHAPITRE I - Contexte de l thèse I.3 Le projet Le projet Iseult/INUMAC (pour Imging of Neuro disese Using high field MR nd Contrstophores) est un projet frnco-llemnd regroupnt des prtenires industriels (Gueret, Alstom, Siemens et Bruker) et cdémiques (le CEA et l Université de Freiurg) finncé pr Oséo (nciennement Agence de l Innovtion Industriel) en Frnce et le BMBF (Ministère fédérl de l'éduction et de l Recherche) en Allemgne. L ojectif d Iseult est de mettre u point une nouvelle génértion d gents de contrste pour l imgerie moléculire pr IRM à très hut chmp mgnétique. Pour cel, le projet Iseult est orgnisé en trois xes menés conjointement pr les différents prtenires. Le premier xe concerne l conception et l rélistion d un scnner IRM clinique corps entier vec un chmp mgnétique sttique de 11,75T. L oine suprconductrice est ctuellement en cours de friction et les premières imges devrient être rélisées en Figure F.I.2 : Vue en coupe du futur imgeur 11,75T. Les oines suprconductrices sont représentées en ornge, le cryostt en leu et l structure mécnique en gris. L ouverture ser de 90 cm, permettnt le pssge du corps entier du volontire

28 CHAPITRE I - Contexte de l thèse Le deuxième xe du projet Iseult est conscré ux développements hrdwre et softwre permettnt un meilleur contrôle de l excittion rdiofréquence (RF) des spins. En effet, l fréquence de Lrmor du signl RMN étnt proportionnelle u chmp mgnétique sttique, l longueur d onde de l onde RF est rccourcie à très hut chmp mgnétique et devient comprle ux dimensions de l orgne imgé. L propgtion de l onde RF donne lieu à des phénomènes d interférence et d ondes sttionnires. Ceci se mnifeste pr une forte inhomogénéité du chmp B + 1 et des pertes de signl. Le «RF shimming» (Hoult nd Phil, 2000) est une technique consistnt à dpter les formes d impulsions RF émises simultnément + pr les éléments d un réseu d ntennes RF fin de minimiser l inhomogénéité du chmp B 1 dns une région d intérêt. L pproche l plus simple consiste à ppliquer une même impulsion RF sur chque cnl mis en justnt les mplitudes et les phses pour minimiser l dispersion de l ngle de scule des spins dns une région d intérêt (voir figure F.I.3.). Figure F.I.3 : Principe du RF shimming sttique. () Une impulsion RF est ppliquée sur chque cnl vec une mplitude et une phse propre grâce à une électronique dédiée multicnux. () Prototype d ntenne réseu à 8 cnux dédiée à l trnsmission prllèle. Pr illeurs, le «RF shimming» permet de sélectionner prmi les scenrii simulés celui qui minimise l quntité d énergie déposée dns l ojet fin de respecter les limites de Tux d Asorption Spécifique ou SAR pour Specific Asorption Rte. L figure F.I.3. représente un prototype d ntenne réseu 8 cnux développé pr l équipe de Michel Luong (CEA/DSM/IRFU) dns le cdre du projet Iseult pour l imgerie cérérle chez l homme à 7T

29 CHAPITRE I - Contexte de l thèse Enfin, le troisième volet vise u développement et à l évlution d une nouvelle génértion d gents de contrste pour l imgerie moléculire pr IRM. Ce troisième xe est mené en étroite collortion vec Gueret, un industriel spécilisé dns les gents de contrste pour l imgerie médicle. L ojectif est de développer et d optimiser en collortion vec les chimistes de Gueret des gents de contrste nnoprticulires fonctionnlisés fin de ciler des mrqueurs de pthologies cérérles telles que l mldie d Alzheimer, les ccidents vsculires et les tumeurs cérérles. Dns ce troisième xe, qutre types d gents de contrste sont évlués pour l imgerie moléculire pr IRM : les gents super-prmgnétiques (Ultrsmll SuperPrmgnetic Iron Oxides, USPIO), les émulsions de complexes de Gdolinium, les émulsions d huile perfluorée et les gents déplçnt l fréquence de résonnce des protons échngeles. Les trvux présentés dns ce mnuscrit portent sur cette dernière ctégorie d gent de contrste, dits gents CEST pour Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer. I.4 Orgnistion du mémoire de thèse et contriutions Ce mémoire de thèse est sudivisé en huit chpitres. Dns le second chpitre, l prolémtique de l imgerie moléculire pr IRM est posée. Dns le chpitre suivnt, les principes de l imgerie de trnsfert d imnttion pr échnge chimique (CEST) sont détillés. Le chpitre IV est conscré ux gents de contrste utilisés durnt cette thèse, à svoir les «lipocest» puis le protocole expérimentl mis u point pour l imgerie CEST est présenté u chpitre V. Le chpitre VI constitue le chpitre centrl de ce mnuscrit. L preuve de concept des gents lipocest fonctionnlisés y est étlie pour l imgerie de l ngiogenèse tumorle chez l souris. Ces trvux ont donné lieu à une puliction dns Mgnetic Resonnce in Medicine (Flment et l., 2012). Dns le chpitre VII, une strtégie de quntifiction des gents lipocest est proposée et ppliquée ux données d imgerie présentées u chpitre précédent. Celle-ci repose sur l ppliction d un modèle à qutre comprtiments des échnges de protons entre eu lire, mcromolécules, protons des fonctions mides et gents lipocest dns le cerveu de rongeur. Un rticle sur l modélistion et l vlidtion de cet outil de quntifiction est en cours de rédction et devrit être soumis à l revue NMR in Biomedicine. Enfin, dns le dernier chpitre, nous dresserons un iln des trvux rélisés et les résultts otenus fin de fournir des pistes sur le futur de l imgerie moléculire pr IRM-CEST

30 CHAPITRE I - Contexte de l thèse Biliogrphie du chpitre I Bloch, F., W. Hnsen, nd M. Pckrd, 1946, Nucler Induction: Phys. Rev., v. 69, p Dmdin, R., 1971, Tumor Detection y Nucler Mgnetic Resonnce: Science, v. 171, p Flment, J., F. Geffroy, C. Medin, C. Roic, J. F. Myer, S. Mériux, J. Vlette, P. Roert, M. Port, D. Le Bihn, F. Lethimonnier, nd F. Boumezeur, 2012, In vivo CEST MR imging of U87 mice rin tumor ngiogenesis using trgeted LipoCEST contrst gent t 7 T.: Mgn Reson Med. Hoult, D. I., nd D. Phil, 2000, Sensitivity nd power deposition in high-field imging experiment.: J Mgn Reson Imging, v. 12, p Luterur, P., 1973, Imge Formtion y Induced Locl Interctions: Exmples employing Nucler Mgnetic Resonnce: Nture, v. 242, p Mnsfield, P., nd P. Grnnell, 1973, NMR 'Diffrction' in solids?: J Phys, v. 6, p Mssoud, T. F., nd S. S. Gmhir, 2003, Moleculr imging in living sujects: seeing fundmentl iologicl processes in new light.: Genes Dev, v. 17, p Purcell, E., H. Torrey, nd R. Pound, 1946, Resonnce sorption y nucler mgnetic moments in solid: Phys. Rev., v. 69, p Ri, I., J. Zchris, S. Millmn, nd P. Kusch, 1938, A new method of mesuring nucler mgnetic moment: Phys. Rev., v. 53, p Rudin, M., N. Beckmnn, R. Porszsz, T. Reese, D. Bochelen, nd A. Suter, 1999, In vivo mgnetic resonnce methods in phrmceuticl reserch: current sttus nd perspectives.: NMR Biomed, v. 12, p Rudin, M., nd R. Weissleder, 2003, Moleculr imging in drug discovery nd development.: Nt Rev Drug Discov, v. 2, p Weissleder, R., 2002, Scling down imging: moleculr mpping of cncer in mice.: Nt Rev Cncer, v. 2, p

31 CHAPITRE I - Contexte de l thèse

32 CHAPITRE II - Imgerie moléculire CHAPITRE II Imgerie moléculire II.1 Introduction L imgerie moléculire est une discipline émergente de l imgerie in vivo répondnt u esoin croissnt de l iologie moléculire, de l phrmcologie et de l médecine d explorer des processus ou des iomrqueurs à l échelle cellulire ou moléculire de l fçon l moins invsive possile. Dns l foulée des progrès rélisés en génomique, l perspective d imger des ltértions moléculires fines dns des modèles pthologiques ou directement chez le ptient ouvre un vste chmp d opportunités pour l recherche iomédicle, pr exemple l élucidtion des mécnismes physiopthologiques, le dignostic précoce, l évlution des thérpeutiques ou l médecine personnlisée. Pr illeurs, en promettnt l visulistion et l quntifiction de mrqueurs spécifiques d un processus iologique, l imgerie moléculire devrit permettre ux études cliniques et précliniques d tteindre un meilleur degré d ojectivité scientifique. Même si cel reste encore mrginl, certines études ont déjà montré le potentiel de l imgerie moléculire pour des pplictions cliniques (Grhm, 2011; Lusser, 2008; Miller nd Thrll, 2004). Les nnées à venir seront donc prticulièrement cruciles pour le développement de l imgerie moléculire et son ppliction en recherche clinique. Etnt une discipline jeune et en pleine effervescence, les frontières de l imgerie moléculire restent floues notmment vis-à-vis de certines modlités récentes de microscopie telle que l microscopie de fluorescence. Dns ce mnuscrit, nous entendrons pr imgerie moléculire toute modlité d imgerie permettnt de visuliser et quntifier, de fçon noninvsive et in vivo des processus iologiques à l échelle d un orgne entier ou d un individu. Cette définition s pplique notmment à l imgerie nucléire, l imgerie optique et l IRM. Chcune d elles utilise un gent d imgerie (ex : rdio-mrqueur, fluorophore ou complexe prmgnétique) le plus souvent dministré en file quntité pour ne ps perturer l physiologie du sujet. Elles possèdent ussi leurs crctéristiques propres, vntges et limittions qui sont rièvement exposés dns ce chpitre

33 CHAPITRE II - Imgerie moléculire II.2 Les modlités d imgerie moléculire II.2. Tomogrphie pr émission de positons L tomogrphie pr émission de positons (TEP ou en nglis PET pour Positron Emission Tomogrphy (Phelps, 2004)) est ujourd hui l modlité d imgerie moléculire de référence en recherche clinique. En TEP, des noyux émetteurs de positons (rdition β+) tels que le 11 C ou 18 F sont incorporés à une molécule d intérêt. Une fois émis, le positon se déplce dns les tissus sur une courte distnce de l ordre du mm vnt de rencontrer son ntiprticule : l électron. Il s en suit une réction d nnihiltion conduisnt à l émission de deux photons de 511 kev vec un ngle de 180 pproximtivement. L détection de l pire de photons γ lieu en coïncidence grâce à une couronne de γ-cmérs plcée utour du sujet. Grâce à l «collimtion électronique» qui permet de n enregistrer que les évènements ynt eu lieu dns une fenêtre de 0.5 à 10 nnosecondes et u grnd nomre de désintégrtions ynt lieu, il est possile de reconstruire l distriution sptile de rdioctivité u cours du temps. Du fit de l hute énergie des photons γ et du on rendement des photodétecteurs, l imgerie TEP possède une excellente sensiilité, de l ordre de à M. Elle souffre toutefois de deux inconvénients mjeurs. D une prt, s résolution sptile est limitée intrinsèquement pr le lire prcours moyen du positon. Celui-ci dépend du rdio-isotope mis est compris entre 0,5 et 3 mm. A cel s joute l impct de l géométrie de l cmér TEP et notmment de ses photodétecteurs. L fonction d'étlement du point crctérise l réponse de l cmér (pour un lgorithme de reconstruction donné) à une source ponctuelle de rdioctivité. En définitive, l résolution sptile est de l ordre de 3 à 5 mm pour les cmérs TEP cliniques et de l ordre de 1 à 1,5 mm pour les cmérs TEP précliniques. L utre inconvénient mjeur de l TEP est l demi-vie courte des isotopes utilisés. Ainsi, l5 O possède une demi-vie de seulement 122 secondes ; pour le 18 F s demi-vie est de 110 minutes. Pr conséquence, il est souvent nécessire d cquérir un cyclotron et de disposer d une équipe de rdiochimistes à demeure pour l synthèse des rdio-mrqueurs. Pr illeurs, ces derniers doivent définir des voies d incorportion du rdio-isotope rpide et efficce pour mximiser l ctivité spécifique du rdio-mrqueur. Mlheureusement, ceci n est ps toujours possile et limite donc l pplicilité de l imgerie TEP (Pimlott nd Sutherlnd, 2011). De nomreux développements se poursuivent utour de l imgerie TEP. On peut noter en prticulier le développement de photodétecteurs de plus petites dimensions ou possédnt une

34 CHAPITRE II - Imgerie moléculire meilleure résolution temporelle (Lewellen, 2008) insi que l rrivée de systèmes hyrides TEP/IRM (Judenhofer et l., 2008). II.2. Tomogrphie d émission monophotonique L tomogrphie d émission monophotonique (TEMP ou en nglis SPECT pour Single Photon Emission Computed Tomogrphy) est une technique d'imgerie médicle nucléire tomogrphique reposnt comme l imgerie TEP sur l scintigrphie. Elle permet de détecter u moyen d'un ensemle de γ-cmérs collimtées en rottion utour du ptient l distriution tridimensionnelle d un rdio-isotope, émetteur de ryon gmm, tel que l iode-123 ( 123 I) ou le technetium-99 métstle ( 99m Tc). L utilistion d une collimtion physique conduit à exclure un certin nomre de désintégrtions et donc à une sensiilité inférieure à l TEP. L sensiilité de l imgerie TEMP demeure toutefois excellente de l ordre de 10-9 à M. Bien que l résolution sptile des γ-cmérs cliniques soit le plus souvent d pproximtivement 10 mm, des résolutions sumillimétriques ont été tteintes pour certines γ-cmérs précliniques utilisnt des collimteurs et des photodétecteurs optimisés (vn der Hve et l., 2009). En ttendnt que ces développements technologiques s ppliquent dns le domine clinique, le principl vntge de l imgerie TEMP réside dns l longue demi-vie des rdioisotopes utilisés. Ces demi-vies de plusieurs heures (de 6h pour le 99m Tc à 78h pour 67 G) ont deux conséquences positives pr rpport à l TEP. D une prt, les coûts sont réduits. D utre prt, l demi-vie physiologique des rdio-mrqueurs TEMP est souvent plus courte que s demivie rdioctive. Cel permet de minimiser l contriution de l frction non-spécifique du signl, conduisnt à une modélistion plus isée des données dynmiques. Cel permet ussi d explorer des voies métoliques plus lentes (Pimlott nd Sutherlnd, 2011). II.2.c Imgerie Optique L imgerie optique est une modlité d imgerie moléculire qui se décline selon de multiples techniques tirnt prti de l sorption, de l réflexion, de l fluorescence, ou de l ioluminescence dns le domine visile (du proche infrrouge à l ultrviolet) d un tissu ou d un gent d imgerie (Luker nd Luker, 2008). Ces techniques sont prticulièrement ttrctives pour l recherche préclinique en rison de leur sensiilité, du crctère non-ionisnt des

35 CHAPITRE II - Imgerie moléculire ryonnements, de leur file coût et de leur fcilité de mise en œuvre. Toutefois, leur pplicilité en clinique reste très réduite, à l exception d pplictions cliniques de surfce notmment pour l détection de cncers du sein (Ntzichristos et l., 2000) ou du côlon (Funovics et l., 2003). Ceci est dû à l file profondeur d explortion (de l ordre du mm) des photons dns le domine visile. En effet, leur longueur d onde (200 à 900 nm) étnt proche de l tille des différentes orgnelles, l lumière émise est lrgement diffusée et sorée lors de s propgtion dns le milieu. Pr conséquent, l sensiilité (10-9 à M) et l résolution sptile (de 1 à 2 mm) de l imgerie optique se dégrdent rpidement vec l profondeur de l source et les tissus prissent reltivement opques. En rison d un coefficient d sorption moindre des tissus, l profondeur d explortion pour l imgerie spectroscopique proche infrrouge peut nénmoins tteindre quelques centimètres (Ferrri nd Quresim, 2012). Au-delà des molécules endogènes possédnt des ries d sorption dns le visile (ex : hémogloine) ou une fluorescence nturelle (ex : collgène), il existe une grnde vriété d gents d imgerie optique synthétiques. On peut citer les protéines de fusion fluorescentes telle que l GFP (pour Green Fluorescent Protein). Son gène peut être fusionné in vitro u gène d'une protéine d intérêt et introduit dns le génome d une cellule ou d un emryon. Ceci permet lors d étudier in situ l expression et l distriution de cette protéine pr fluorescence. S découverte été récompensée pr le prix Noel de Chimie en 2008 ttriué à M. Chlfie, O. Shimomur et R. Tsien. Il existe ussi des nnoprticules fluorescentes fonctionnlisles : les oites quntiques (ou quntum dots). Il s git de nnocristux de mtériu semi-conducteur dont les dimensions sont inférieures à 10 nm. Ces nnoprticules possèdent une excellente stilité, efficience lumineuse et leur fréquence d émission est commodément liée à leur géométrie, permettnt insi de suivre plusieurs ciles moléculires simultnément. Il existe toutefois de sérieux doutes qunt à leur toxicité (Hrdmn, 2006). II.2.d Imgerie pr Résonnce Mgnétique Nucléire L imgerie moléculire pr résonnce mgnétique nucléire est prolement l modlité d imgerie moléculire l moins développée à ce jour. L IRM souffre en tout premier lieu de s file sensiilité reltivement ux utres modlités d imgerie moléculire. Si on considère l IRM du 1 H, l sensiilité est de l ordre de 10-3 à 10-5 M. Ceci est lié à l file polristion des spins (de 10-5 à 10-6 ) à tempérture minte. Afin d ccroître cette polristion, il est possile mis très coûteux d ugmenter l intensité du chmp mgnétique sttique ou

36 CHAPITRE II - Imgerie moléculire encore de recourir à l hyperpolristion (Vile nd Aime, 2010). En dépit de cette limittion, l imgerie moléculire pr RMN offre l opportunité d cquérir u cours de l même session des imges ntomiques énéficint d une résolution sptile sumillimétrique et d un excellent contrste entre tissus mous. Pr illeurs, l IRM est une méthode extrêmement verstile et permet de mesurer des prmètres physiologiques ou structurels tels que le flux snguin locl ou le tenseur de diffusion de l eu (Hcke et l., 1999). Afin de pllier à l moindre sensiilité de l IRM, il est possile d utiliser des gents de contrste. Ces gents de contrste IRM sont le plus souvent des complexes de Gdolinium prmgnétiques ou des nnocristux d oxyde de fer superprmgnétiques. L interction de ces molécules vec les protons de l eu lire conduit loclement à une ccélértion des phénomènes de relxtion longitudinux et trnsversux gouvernés pr les temps de relxtion T 1, T 2 et T 2 *. Ces «contrstophores» présentent une toxicité réduite et ont rpidement été utilisés en recherche clinique. Prmi ses pplictions, on peut notmment citer l ngiogrphie RMN, l IRM de perfusion ou encore de l infiltrtion mcrophgique (Corot et l., 2006). Ainsi, des sensiilités de l ordre de 10-6 à 10-9 M sont tteintes. Cependnt, ce sont des gents de contrste non-spécifiques. Leur distriution dns l orgnisme ou dns l orgne est gouvernée pr leurs propriétés physico-chimiques. C est pourquoi, des gents de contrste IRM fonctionnlisés sont ctuellement en phse de développement. Ils consistent en l ssocition d un ou plusieurs contrstophores à un peptide ou un phrmceutique (on prle lors de phrmcophore) ynt une ffinité pour un iomrqueur d intérêt. En fonction de l ffinité du phrmcophore pour s cile et de l iodistriution de l gent de contrste fonctionnlisé, il est lors possile de détecter spécifiquement le couple phrmcophore-iomrqueur vi les protons de l eu intergissnt vec le contrstophore. II.3 Comprison des modlités d imgerie moléculire Cette rève introduction à l imgerie moléculire permet de constter l vriété des modlités d imgerie moléculire. Le tleu T.II.1 résume certines de leurs crctéristiques, notmment leurs vntges et inconvénients. Les modlités les plus sensiles sont les modlités d imgerie nucléire. Elles permettent de détecter des rdiotrceurs à des concentrtions de l ordre du picomolire. De plus, ces deux modlités d imgerie nucléire présentent l vntge d être quntittives. En effet, l

37 CHAPITRE II - Imgerie moléculire quntité de ryonnements γ reçue u niveu des détecteurs est directement proportionnelle à l quntité de rdiotrceurs. En revnche, leur résolution sptile reste limitée comprtivement ux utres modlités, u mieux de l ordre du mm. Tleu T.II.1 : Comprison des différentes modlités d imgerie moléculire. Le tleu résume les crctéristiques principles de chque modlité notmment leurs principux vntges et inconvénients. L imgerie optique permet églement d tteindre une excellente sensiilité de détection et reste très peu coûteuse pr rpport ux utres. Cependnt, son potentiel pour des pplictions cliniques est limité en rison de l file profondeur d explortion. Elle reste donc cntonnée à des visulistions en surfce. Qunt à l IRM, il s git d une modlité reltivement fcile d ccès (l pluprt des hôpitux en sont équipés), moins coûteuse que l imgerie nucléire, et surtout offrnt une excellente résolution sptile. Cependnt, c est une modlité peu sensile. Le développement d gents de contrste sensiles et spécifiques constitue donc l clef pour l vènement de l imgerie moléculire pr IRM. Le développement de séquences d IRM et d outils d nlyse dédiés à l imgerie de tels gents de contrste fonctionnlisés représente donc un projet de recherche pssionnnt

38 CHAPITRE II - Imgerie moléculire II.4 Vers l quntifiction en imgerie moléculire L finlité de l imgerie moléculire est l quntifiction d une cile ou d un processus iologique in vivo. Quelque soit l modlité d imgerie moléculire, l quntifiction n est possile qu près une chîne de tritement de données que l on peut représenter schémtiquement pr l figure F.II.1. Figure F.II.1 : Chîne de tritement de données pour l quntifiction en imgerie moléculire. L première étpe consiste en l cquisition du signl rut et/ou des imges. Puisque des gents d imgerie sont le plus souvent utilisés, il est nécessire de modéliser le mécnisme de contrste. Il est insi possile de remonter à l densité d gent d imgerie à l origine du signl ou du contrste dns l imge. Enfin, l dernière étpe est l quntifiction des ciles iologiques. Cel nécessite de modéliser l prise de contrste en fonction de l nture des tissus et des propriétés physico-chimiques de l gent de contrste. Le tux d expression de l cile, l iodistriution de l gent de contrste, son temps de demi-vie, son ffinité pour l cile sont utnt de prmètres qui entrent en ligne de compte. Souvent, certins de ces prmètres ne sont ps ccessiles et l opérteur est contrint de formuler des hypothèses. Pr conséquent, l quntifiction en imgerie moléculire reste une tâche très compliquée, et il est souvent plus juste de prler de semi-quntifiction. Cependnt, cette informtion est plus pertinente qu une simple intensité pour pprécier le processus iologique d intérêt. Dns le cdre de cette thèse, nous vons dopté cette pproche de semi-quntifiction et nous vons tenté de l ppliquer à l imgerie CEST de l néo-ngiogenèse tumorle chez l souris U87. Les résultts sont présentés dns les chpitres VI et VII de ce mnuscrit

39 CHAPITRE II - Imgerie moléculire Biliogrphie du Chpitre II Corot, C., P. Roert, J. M. Idée, nd M. Port, 2006, Recent dvnces in iron oxide nnocrystl technology for medicl imging.: Adv Drug Deliv Rev, v. 58, p Ferrri, M., nd V. Quresim, 2012, A rief review on the history of humn functionl nerinfrred spectroscopy (fnirs) development nd fields of ppliction.: Neuroimge. Funovics, M. A., H. Alencr, H. S. Su, K. Khzie, R. Weissleder, nd U. Mhmood, 2003, Miniturized multichnnel ner infrred endoscope for mouse imging.: Mol Imging, v. 2, p Grhm, M. M., 2011, Clinicl Moleculr Imging with Rdiotrcers: Current Sttus.: Med Princ Prct. Hcke, E., R. Brown, M. Thompson, nd R. Venkteson, 1999, Mgnetic resonnce imging: physicl principles nd sequence design: New York, p 349. Hrdmn, R., 2006, A toxicologic review of quntum dots: toxicity depends on physicochemicl nd environmentl fctors.: Environ Helth Perspect, v. 114, p Judenhofer, M. S., H. F. Wehrl, D. F. Newport, C. Ctn, S. B. Siegel, M. Becker, A. Thielscher, M. Kneilling, M. P. Lichy, M. Eichner, K. Klingel, G. Reischl, S. Widmier, M. Röcken, R. E. Nutt, H. J. Mchull, K. Uludg, S. R. Cherry, C. D. Clussen, nd B. J. Pichler, 2008, Simultneous PET-MRI: new pproch for functionl nd morphologicl imging.: Nt Med, v. 14, p Lewellen, T. K., 2008, Recent developments in PET detector technology.: Phys Med Biol, v. 53, p. R Luker, G. D., nd K. E. Luker, 2008, Opticl imging: current pplictions nd future directions.: J Nucl Med, v. 49, p Lusser, M., 2008, Chllenges in relizing the potentil of clinicl moleculr imging.: J Nucl Med, v. 49, p. 72N-73N. Miller, J., nd J. Thrll, 2004, Clinicl Moleculr Imging: J Am Coll Rdiol., p Ntzichristos, V., A. G. Yodh, M. Schnll, nd B. Chnce, 2000, Concurrent MRI nd diffuse opticl tomogrphy of rest fter indocynine green enhncement.: Proc Ntl Acd Sci U S A, v. 97, p Phelps, M., 2004, PET: Moleculr Imging nd its Biologicl Applictions: Springer, New York

40 CHAPITRE II - Imgerie moléculire Pimlott, S. L., nd A. Sutherlnd, 2011, Moleculr trcers for the PET nd SPECT imging of disese.: Chem Soc Rev, v. 40, p vn der Hve, F., B. Vstenhouw, R. M. Rmkers, W. Brnderhorst, J. O. Krh, C. Ji, S. G. Stelens, nd F. J. Beekmn, 2009, U-SPECT-II: An Ultr-High-Resolution Device for Moleculr Smll-Animl Imging.: J Nucl Med, v. 50, p Vile, A., nd S. Aime, 2010, Current concepts on hyperpolrized molecules in MRI.: Curr Opin Chem Biol, v. 14, p

41 CHAPITRE II - Imgerie moléculire

42 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique CHAPITRE III Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique III.1 Introduction L étude des échnges chimiques été et demeure un chmp d ppliction dynmique de l RMN. Les effets de l échnge chimique entre deux popultions de spins sur leur spectre RMN été rpporté dès 1951 (Arnold nd Pckrd, 1951; Liddel nd Rmsey, 1951). Quelques nnées plus trd, Forsén et Hoffmn (Forsén nd Hoffmn, 1963) étlirent l spectroscopie de trnsfert d imnttion comme une méthode de référence pour l étude des échnges de protons entre deux sites non-équivlents. Cependnt, ce n est qu en 1989 que cette pproche été dptée à l imgerie RMN in vivo. Wolff et Bln furent les premiers à démontrer que l échnge chimique entre l eu lire et des protons liles de solutés en file concentrtion permet de générer un contrste sur le signl de l eu lire (Guivel-Schren et l., 1998; Wrd et l., 2000; Wolff nd Bln, 1990). Ce nouveu mécnisme de contrste fut désigné pr l cronyme CEST (pour Chemicl Exchnge dependent Sturtion Trnsfer). Cette même pproche fut ppliquée pour générer un contrste lié à l échnge de protons entre l eu lire et les mcromolécules semi-moiles des tissus (Wolff nd Bln, 1989), définissnt l imgerie de trnsfert d imnttion (désigné pr l cronyme MT pour Mgnetiztion Trnsfer) comme une nouvelle modlité de crctéristion des tissus mous pour l recherche clinique (pour revue voir (Wolff nd Bln, 1994)). Plus trd, vn Zijl et collorteurs (Goffeney et l., 2001; Snoussi et l., 2003) ppliquèrent l imgerie CEST pour fciliter l détection indirecte de mcromolécules possédnt un très grnd nomre de fonctions mides ou imines (~500000) tel que l poly-l-lysine. Des fcteurs d mplifiction record de 10 7 furent tteints ouvrnt le chmp à une nouvelle génértion d gents de contrste exogènes tirnt prti de ce phénomène d mplifiction (Aime et l., 2002; Zhng et l., 2003; Zhng et l., 2001). Dns ce chpitre III, nous nous proposons de préciser le cdre théorique qui régit les imgeries CEST et MT. Nous nous sommes notmment inspirés des excellentes revues de Zhou et Woessner (Woessner et l., 2005; Zhou nd vn Zijl, 2006)

43 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique III.2 Théorie III.2. Equtions de Bloch-McConnell Considérons une séquence stndrd de trnsfert de sturtion (voir figure F.III.1). Cette séquence se compose de deux prties : une première prtie consiste à perturer le système de spins en échnge chimique. L seconde prtie consiste à mesurer l réponse du système à cette perturtion. Dns le cs de l imgerie de trnsfert de sturtion, l perturtion consiste à détruire sélectivement une prtie de l imnttion longitudinle. D utres méthodes, l pluprt spécifiques de l spectroscopie RMN, modifient l phse de l imnttion ou l polristion d une des popultions de spins. Figure F.III.1 : Schém d une séquence de trnsfert de sturtion. Afin de décrire l évolution des imnttions M A et M B de deux popultions de spins A et B en échnge chimique u cours d une séquence de trnsfert de sturtion, nous vons choisi d dopter l description semi-clssique donnée pr les équtions de Bloch-McConnell (McConnell, 1958; Woessner, 1961). Soient deux popultions de protons A et B en échnge chimique (voir figure F.III.2), et les prmètres du modèle : M x,y,z et M 0 et M 0 M x,y,z : les imnttions dns le référentiel tournnt, : leur imnttion à l équilire, T1 et T 1 : les temps de relxtion longitudinux en s, T2 et T 2 : les temps de relxtion trnsversux en s, et : les déplcement fréquentiels pr rpport à l fréquence du référentiel tournnt en Hz, kex et k ex : les tux d échnge en s -1,

44 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique et 1. B1 / 2 : l intensité du chmp d excittion en rd.s-1 (dns ce cs ppliqué selon l xe Ox). Figure F.III.2 : Modèle à 2 comprtiments pour le trnsfert de sturtion. Les équtions de Bloch-McConnell s écrivent : E1 E2 E3 E4 E5 E6 dm dt dm dt dm dt dm dt x x y y dm dt dm dt z z x 2 M kex M x kex M x 2 M y, T x 2 M kex M x kex M x 2 M y, T y 2 M kex M y kex M y 2 M x 1M z, T y 2 M kex M y kex M y 2 M x 1M z, T 0 1 z M M kex M z kex M z ω1m y, T 0 1 z M M kex M z kex M z ω1m y. T

45 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique III.2. Condition d oservtion des popultions de spins A et B Dns un premier temps, considérons l ppliction d une excittion non-sélective des deux systèmes de spins, l ngle de scule étnt de 90. Les imnttions à t = 0 sont : M (0 ) 0 M 0 et M (0 ) 0 M 0 0 décrite pr les équtions suivntes : 0. Leur évolution dns le pln trnsverse est E7 E8 E9 E10 dm dt dm dt dm dt dm dt x x y y x 2 M kex M x kex M x 2 M y, T x 2 M kex M x kex M x 2 M y, T y 2 M kex M y kex M y 2 M x, T y 2 M kex M y kex M y 2 M x. T Considérons les imnttions trnsversles complexes M T M y im x et M T y x M im, on peut réécrire le système d équtions {E7-E10} sous forme mtricielle : E11 d dt M M T T i2 k k ex ex 1 T 2 2 k k ex ex 1 T 2 M M T T. Ce système d équtions peut être résolu nlytiquement pour déterminer l évolution temporelle des imnttions trnsversles en présence d échnge chimique. Les solutions sont : E12 t c exp t c exp t MT E13 t c exp t c exp t MT et, vec 1, 2 les vleurs propres de l mtrice. prticulier où Afin de simplifier l expression de cette solution nlytique, considérons le cs M 0 et M 0 sont égux. Ceci implique que ex ex k k puisqu à l équilire, les flux

46 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique de protons entre les deux groupes sont égux, i.e. trnsverses sont négligées. On lors : ex 0 ex 0 k M k M. Aussi les relxtions k W 1,2 i ex, c M0 2W i 1 ex M 2W 0 k W, c i M0 c1 i ex 2W k W, 2 ex 0 k W, c i W. k ex M 2 kex W 2W et En définitive, le signl mesuré est : E14 S t M t M t. T T Afin de mieux ppréhender ces reltions et les conséquences de l échnge chimique sur l oservtion des popultions de spins A et B, considérons deux cs de figure : Echnge lent : kex On lors : W i, 1 i2 kex 2 kex, i2, 1 M0 c, 2 M0 2 1 c et c c 0. Il en découle l mesure d un signl temporel : E15 S t M exp i2 k.t M exp i2 k.t 0 ex 0 ex

47 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique dont le spectre (prtie réelle de l trnsformée de Fourier) correspond à l oservtion de deux 0 0 pics d intensités respectives M et M, centrés en et, et de lrgeur à mi-huteur (voir figure F.III.3). 2k ex Echnge rpide : kex On lors : W kex 2 2, kex 2 2 1,2 i kex kex 1, 2 2 kex 1 M0 c, 1 M0 2 2 c et c c 0. Il en découle l mesure d un signl temporel : E16 S t M 0 2 exp i ( ) 2 2 2kex.t M 0 exp i ( ) 2kex 2. t 0 M0 dont le spectre correspond à l oservtion d un pic unique d intensité M, centré en 2 2 2, et de lrgeur à mi-huteur kex (voir figure F.III.3). Etnt donné que le trnsfert d imnttion n est possile qu entre deux groupes de protons fréquentiellement distincts, il est nécessire que le tux d échnge soit inférieur u déplcement chimique entre les deux popultions de protons. Ceci constitue donc une condition d oservtion d un contrste CEST : E17 kex. Il est importnt de noter que cette condition E17 est plus isément remplie à hut chmp mgnétique puisque ugmente proportionnellement vec l intensité de celui-ci

48 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Figure F.III.3 : Spectres des popultions de spins A et B en fonction de l vitesse du tux d échnge. III.2.c Trnsfert de sturtion Sturtion complète du soluté B Considérons l expérience de trnsfert de sturtion durnt lquelle le soluté B est sélectivement et complètement sturé de sorte que : M z (t ) 0. De l résolution des équtions de Bloch-McConnell {E1-E6}, on dérive : E18 M M t z exp R.t, RT1 RT1-47 -

49 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique vec R 1 kex et t le temps de sturtion. On remrque que le tux de sturtion mximum T 1 tteint pour les spins A à t = n est ps égl à l unité : E19 t z 0 T1 kex 1 M M R 1 T k ex L éqution E19 illustre l existence d un équilire entre l imnttion détruite pr échnge chimique vec les spins B et celle resturée pr l relxtion longitudinle. Sturtion prtielle du soluté B Cette fois-ci, considérons l sturtion sélective mis incomplète des spins B. On lors le système d éqution de Bloch-McConnell suivnt (les termes d évolution fréquentielle étnt négligés) : E20 E21 E22 E23 dm dt dm dt y y dm dt dm dt z z y 2 M kex M y kex M y, T y 2 M kex M y kex M y 1M z, T 0 1 z M M kex M z kex M z, T 0 1 z M M kex M z kex M z ω1m y. T dm, x,y, z Le système peut être résolu nlytiquement pour 0 dt l équilire sont lors :. Les imnttions à E24 E25 1 M 0 M z M 0 2 p.q q.M 0, p.q M y 2 1,

50 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique E26 E27 E28 E29 1 M 0 M z M 0 kex T. 1., 2 p.q 1.q.M 0 M y kex.t 2, 2 p.q T2 2 1 ex T2 kex T2 T2 kex 1 k p et T T1 1 ex T1 kex T1 T1 kex 1 k q. T 1 2 On peut définir le rtio de sturtion des spins B : E30 M 0 M z 1. 2 M p.q On remrque que l sturtion complète du groupe B n est jmis tteinte en prtique puisque cel nécessiteri une intensité 1 infinie. Approximtion de sturtion file Enfin, considérons l dépendnce du trnsfert de sturtion en fonction du temps de sturtion T st. Afin de disposer d une solution nlytique, deux pproximtions sont nécessires : l imnttion des spins B tteint son étt d équilire qusi-instntnément, i.e. les reltions E24 et E25 sont vérifiées ; l imnttion des spins A reste inchngée pendnt ce court lps de temps ( 0 M M ). Ces pproximtions sont vlides si l on considère que le tux de z 0 sturtion du groupe B est supérieur u tux de trnsfert de sturtion vers le groupe A, i.e. si : 1 T1 1 1 k T2 T1 ex. Cette condition est ssez souvent vérifiée si le soluté B est significtivement moins moile que l eu lire A. On lors : E31 M z t M 0 k 1 T 1 ex k ex 2 1 M exp ( 2 1 p.q T1 k ex ). t

51 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Le tux de sturtion des spins A est régulièrement désigné dns l littérture pr l cronyme PTR (pour Proton Trnsfer Rtio) et est défini insi : E32 M 0 M z ( t ).k ex M 1 T k 0 1 ex 1. 1 exp ( T1 k ex ). t. On remrque que l efficcité de sturtion des spins A dépend du rtio de sturtion des 1 spins B et du tux de sturtion des protons A : k T1 ex. Comme l illustrent respectivement les figures F.III.4.,. et.c, ce dernier est impcté pr l concentrtion de soluté ( k k.m M ), pr le tux d échnge intrinsèque du soluté vec l eu lire ex ex 1 vleur du T 0 0 kex et pr l. Ainsi, un tux d échnge rpide entre les spins A et B, une concentrtion importnte en soluté B ou une ugmenttion du T 1 permettent d méliorer l efficcité de l sturtion des spins A. Or on sit que le temps de relxtion longitudinl ugmente vec le chmp mgnétique. Pr conséquent, le pssge ux huts chmps mgnétiques est fvorle à l imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique. L intérêt mjeur de l imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique est de pouvoir détecter indirectement un soluté peu concentré (ici les protons B) vi son échnge chimique vec les protons du solvnt évidemment plus concentré (ici les protons A). L détection des protons B est donc mplifiée grâce u trnsfert de sturtion et on peut définir un fcteur d mplifiction FA pr l reltion suivnte : E33 M 0 M z ( t ) PTR.M 0.k ex FA M M 1 T k ex 1. 1 exp ( T1 k ex ). t. Ainsi, dns le cs de l coure leue présentée sur l figure F.III.4 (α = 0,5 ; Hz ; T = 5000 ms ; M 0 = 100 M ; k ex = M 0 = 1 mm ; T st = 10s), l sturtion de 50% des protons B se mnifeste pr une vrition de 16% du signl mesuré à l fréquence des protons A ce qui correspond à un fcteur d mplifiction de C est en rison de fcteurs d mplifiction importnts que l imgerie de trnsfert de sturtion constitue une pproche intéressnte pour ccroître l sensiilité de détection de l imgerie moléculire pr IRM

52 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Figure F.III.4 : Tux de sturtion des spins A en fonction de, de et de. Prmètres de l simultion : () : α = 0,5 ; = Hz ; = 5000 ms ; = 100 M ; = 1/2/5/10 mm ; () : α = 0,5 ; = 5000/10000/25000/50000 Hz ; = 5000 ms ; = 100 M ; = 1 mm ; (c) : α = 0,5 ; = Hz ; = 1000/2000/3000/5000 ms ; = 100 M ; = 1 mm. L coure leue est commune ux trois grphes

53 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Si l efficcité de l sturtion ugmente vec l intensité de l sturtion B 1, l ppliction d une sturtion intense engendre ussi une ugmenttion de l sturtion directe des spins A (ou spill-over effect). Pr conséquent, il existe une intensité optimle pour lquelle le compromis entre le trnsfert de sturtion et l sturtion directe des protons lire entrine un PTR mximum. Cette intensité peut être otenue en nnulnt l dérivée première selon 1 de l éqution E32 (Sun et l., 2005). Une résolution numérique rpportée pr Woessner et collorteurs indique que l vleur optimle de l intensité de sturtion 1opt dépend u premier ordre du tux d échnge entre les spins A et B (Woessner et l., 2005). On peut lors estimer que l intensité optimle de sturtion vérifie l reltion suivnte : 1opt E34 k ex 2.. B, 1opt 1opt vec γ le rpport gyromgnétique du proton (exprimé en Hz.T -1 ) et B 1 l intensité de l sturtion (exprimée en T). III.2.d Crctéristion du trnsfert d imnttion De fçon générle, les équtions d évolution des imnttions u cours d une expérience de trnsfert d imnttion sont très rrement dérivées d une résolution nlytique des équtions de Bloch-McConnell en rison de l complexité des systèmes réels notmment in vivo. En revnche, il est fréquent de considérer le clcul numérique ou l mesure expérimentle du Z-spectrum (Grd et l., 1991). Le Z-spectrum correspond à l frction d imnttion longitudinle pour les spins oservés (ici M z M 0 exprimé en %) en fonction de l fréquence de sturtion (δ st ). L figure F.III.5 représente un Z-spectrum simulé pour un modèle à 2 comprtiments correspondnt à l eu lire (protons A) et ux protons déplcés pr un gent CEST (protons B)

54 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Figure F.III.5 : Z-spectrum (coure noire) et Z-spectrum symétrique (coure rouge) simulés dns le cdre d un modèle à 2 comprtiments. Les prmètres de l simultion sont ( = 110 M, = 3500 ms, = 100 ms, = 0 ppm, = 50 ms, = 2 ms, = 11 ppm, = 1,5 M, = 300 Hz, B 1 = 7 µt). Tel qu illustré pr l figure F.III.5, l effet de l sturtion est mximl lorsque celle-ci est ppliquée à l fréquence de résonnce des spins A ou B ( ou ). On remrque toutefois que l sturtion n est ps nulle hors-résonnce. Ceci est dû à l sturtion directe encore désignée pr l expression nglise de spill-over effect. Ce spill-over effect se mnifeste lorsqu une sturtion intense est ppliquée à proximité de l une des résonnces. Une étude théorique du spill-over effect été rélisée pr Bguet et Roy (Bguet nd Roy, 1997). Ce spill-over effect est pproximtivement symétrique. Pr conséquent, il est possile de s en ffrnchir en rélisnt deux expériences de sturtion vec l même sturtion ppliquée de prt et d utre de l fréquence de résonnce de l eu lire. Pr conséquent, un rtio de trnsfert d imnttion symétrique désigné pr l cronyme MTRsym pour symmetricl Mgnetiztion Trnsfer Rtio est défini pr l éqution suivnte : E35 MTRsym M z ( st ) M z ( st ). M

55 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Cette grndeur étnt spécifique de l échnge chimique vec le soluté B, il est prtique de trcer l fonction MTRsym ( ) pour mieux pprécier le trnsfert de sturtion entre A et st B. On prle lors de Z-spectrum symétrique (voir figure F.III.5, coure rouge). Dns l suite de ce mnuscrit, les deux types de Z-spectr seront exploités. III.3 Applictions III.3. Imgerie MT L imgerie de trnsfert d imnttion été proposée pour l première fois en 1989 pr Wolff et Bln pour générer un nouveu type de contrste (Wolff nd Bln, 1989). Ce contrste MT (pour Mgnetiztion Trnsfer) trouve son origine dns l échnge chimique et le couplge dipolire entre protons de l eu lire et protons semi-moiles des mcromolécules cellulires (protéines, memrnes cellulires, myéline). Etnt donné l reltive immoilité de ces protons mcromoléculires, leur T 2 est extrêmement court (< 100 µs) et pr conséquent leurs résonnces se crctérisent pr une lrgeur spectrle importnte de plusieurs khz. Pr illeurs, ce spectre est pproximtivement symétrique pr rpport à celui de l eu lire (voir figure F.III.6). Lorsqu une impulsion de sturtion est ppliquée hors-résonnce à moins de 5kHz de l résonnce de l eu lire, une frction de l imnttion de ces protons semi-moiles est sturée. Ainsi que nous l vons détillé dns le prgrphe III.2, cette sturtion est trnsférée à l eu lire. En prtique, un protocole d imgerie MT comprend l cquisition de deux imges, une imge de référence sns sturtion (Imge Ref ) et une imge vec sturtion (Imge ON ). Comme pour E35, on définit lors un rtio de trnsfert d imnttion désigné pr l cronyme MTR pour Mgnetiztion Trnsfer Rtio : E36 ImgeRef ImgeON MTR. Imge Ref

56 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Figure F.III.6 : Trnsfert d imnttion entre les protons lires et les protons liés. Comme nous l vons vu précédemment, l frction de protons en échnge vec les protons de l eu lire est un fcteur influençnt fortement le contrste MT. Pr conséquent, il été proposé d utiliser le contrste MT fin de mettre en évidence des chngements de composition des tissus. Le chmp d ppliction principl dns le domine clinique est l imgerie de pthologies de l mtière lnche, comme pr exemple l sclérose en plque, qui se mnifeste pr une démyélinistion des fires nerveuses. L évolution de l pthologie est lente et certines lésions ne sont ps toujours visiles en imgerie stndrd pondérée T 1 ou T 2. Aussi, le recourt à l imgerie MT permet de détecter certines pthologies plus précocement et de mieux les crctériser (Filippi nd Rocc, 2004; Grossmn et l., 1994). L figure F.III.7 présente une ppliction clinique de l imgerie de trnsfert de sturtion pour l détection de l sclérose en plque. L lésion est visile sur l imge ntomique conventionnelle mis le contrste vec les tissus sins est file (voir figure F.III.7.). Sur l imge de trnsfert de sturtion (voir figure F.III.7.), le contrste entre l lésion et les tissus sins est nettement ugmenté. L différence entre ces deux imges (voir figure F.III.7.c) permet de mettre en évidence les zones où le trnsfert de sturtion est moindre, comme c est le cs dns l lésion en rison de l démyélinistion de l mtière lnche

57 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Figure F.III.7 : Appliction clinique de l imgerie de trnsfert de sturtion. L démyélinistion ffectnt l mtière lnche dns le cdre de l sclérose en plque est visile sur l imge conventionnelle mis le contrste est file (). L lésion pprit en hypersignl sur l imge de trnsfert de sturtion en rison d un trnsfert de sturtion moindre que dns le prenchyme sin (). L différence des deux imges permet d ugmenter le contrste entre l lésion et les tissus sins (c). Illustrtion tirée de (Grossmn et l., 1994). III.3. Imgerie dicest et APT En 2000, Wrd et Bln proposèrent l utilistion de petits composés possédnt des protons liles (lcool, mide, imine) en tnt qu gent de contrste CEST pour l IRM (Wrd et l., 2000). L originlité de ces molécules tient d une prt à l possiilité «d llumer ou d éteindre» le contrste grâce à l ppliction d une impulsion sélective. D utre prt, les propriétés d échnge de ces composés étnt intrinsèquement dépendntes de prmètres physiologiques tels que l tempérture ou le ph, on peut envisger l ppliction de cette technique pour l thermométrie et l crtogrphie de ph (vn Zijl nd Ydv, 2011). Ces gents de contrste dimgnétiques sont désignés pr l cronyme dicest. On peut insi répertorier les pproches glycocest pour l imgerie du glycogène (vn Zijl et l., 2007), ggcest pour l imgerie des glycosminoglycnes (Ling et l., 2008) ou très récemment le glucest pour l imgerie du glutmte (Ci et l., 2012). Cette pproche dicest constitue une lterntive crédile à l imgerie spectroscopique de ces métolites. L figure F.III.8 montre une ppliction clinique de l imgerie du glucest. Une crte glucest (voir figure F.III.8.) cquise à 7T chez un volontire sin montre une réprtition du glutmte

58 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique dns le cerveu comprle ux volumes de distriution des récepteurs métotropes u glutmte de sous-type 5 (mglur5) déterminés grâce à l imgerie TEP (voir figure F.III.8.c). Figure F.III.8 : Appliction clinique de l imgerie glucest. () : Imge ntomique de référence cquise à 7T chez un volontire sin ; () : Crte glucest cquise sur l même coupe du cerveu. Les conditions de sturtion sont B 1 = 3,6 µt et δ st = -5 à 5 ppm vec un ps de 0,1 ppm. L échelle de couleur représente le pourcentge de contrste glucest ; (c) : Imge TEP des volumes de distriution des récepteurs métotropes u glutmte de sous-type 5. Illustrtion tirée de (Ci et l., 2012). Ces dernières nnées, un type d imgerie dicest en prticulier connu un essor importnt. Il s git de l imgerie de trnsfert d imnttion des protons mides (Zhou et l., 2003). Ce contrste est désigné pr l cronyme APT (pour Amide Proton Trnsfer) et est lié à l échnge des protons mides vec les protons de l eu lire. Les protons mides présentent des crctéristiques d échnge fvorles, vec des tux d échnge de l ordre de 10 à 30 Hz et sont reltivement concentrés (environ 72 µm). De plus, les tux d échnges sont dépendnts des propriétés physiologiques du milieu comme l tempérture ou le ph. Ces propriétés font de l imgerie APT une méthode prometteuse pour l crtogrphie in vivo de ces prmètres mis ussi pour détecter des zones où ces prmètres vrient comme dns le cs des tumeurs ou des ischémies cérérles. Des études in vivo menées chez le rt ont montré que l imgerie APT permet de mieux visuliser les contours des tumeurs cérérles que l imgerie de pondértion T 1 et T 2 trditionnelle et est ussi performnte que l imgerie de diffusion (Zhou et l., 2003). De plus, des études ont églement démontré le potentiel de l imgerie APT pour l détection de tumeurs cérérles chez l homme (Jones et l., 2006; Zho et l., 2008), comme l illustre l figure F.III.9. Afin d ugmenter l sensiilité de détection des gents dicest, l équipe de Peter vn Zijl proposé d utiliser des mcromolécules possédnt un grnd nomre de fonctions mides ou imides (~500000) telles que l poly-l-lysine. Des fcteurs d mplifiction records ont été

59 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique tteints (FA ~ 10 7 ) ouvrnt le chmp à une nouvelle génértion d gents de contrste exogènes tirnt prti de ce phénomène d mplifiction (Aime et l., 2002; Zhng et l., 2003; Zhng et l., 2001). De telles mcromolécules peuvent ussi être exprimées de fçon endogène en reltion vec une protéine d intérêt. Dns ce cs de figure, l imgerie APT constitue une pproche d imgerie du gène-rpporteur prticulièrement prometteuse pour l iologie moléculire et l génétique (Liu nd Gild, 2011). Enfin, ces molécules dimgnétiques peuvent être encpsulées dns des liposomes pour multiplier le nomre de site d échnge de protons pr nnoprticule, permettnt d tteindre des seuils de détection de l ordre de 2 nm (Liu et l., 2011). Figure F.III.9 : Appliction clinique de l imgerie APT. Les imges conventionnelles pondérées T 2 et T 1 cquises à 3T chez un ptient tteint d une tumeur cérérle permettent de visuliser l tumeur ( et respectivement). Une injection d gent de contrste à se de Gdolinium permet de rehusser le contrste entre l tumeur et les tissus sins (c). L imge APT (d) été cquise vec les prmètres de sturtion suivnts : B 1 = 2 µt et δ st = -3,5 ppm. L imge APT permet de visuliser clirement l tumeur. Illustrtion tirée de (Zho et l., 2008). III.3.c Imgerie prcest Les gents décrits précédemment sont intéressnts cr ils permettent d tteindre des seuils de sensiilité très s, et d être sensiles ux vritions physiologiques comme l tempérture ou le ph. Nénmoins, en rison du déplcement chimique file des protons liles (< 6 ppm), il peut être très compliqué de distinguer leur effet CEST des effets MT et APT endogènes. L détection de ces gents nécessite donc l cquisition d un Z-spectrum prtiel. Ceci est coûteux en temps et de ce fit limite les pplictions in vivo. Afin de s ffrnchir des contrstes endogènes inhérents ux tissus, l équipe de Den Sherry proposé l utilistion

60 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique d gents prmgnétiques déplçnt fortement l fréquence des protons de l eu en interction vec ceux-ci (Sherry et l.; Zhng et l., 2001). Il s git de complexes de Lnthnides (Ln 3+ ) prmgnétiques désignés pr l cronyme prcest (Zhng et l., 2003). Tous les Lnthnides (à l exception du Gdolinium(III), du Lutétium(III) et du Lnthne(III)) ont l cpcité de déplcer très fortement l fréquence de résonnce des protons dns leur environnement proche (Peters et l., 1996). De plus, l nture du lignd permet de moduler le tux d échnge des molécules d eu qui entrent dns l sphère de coordintion du Ln 3+. Ainsi, il est possile d otenir des déplcements chimiques de plusieurs centines de ppm vec des tux d échnge comptiles vec l condition d oservtion de l effet CEST. Similirement ux gents dicest, ces gents prcest présentent des crctéristiques dépendnt fortement de prmètres physico-chimiques tels que l tempérture ou le ph. Ils peuvent donc être utilisés pour crtogrphier ces prmètres (Li et l., 2008; Sheth et l., 2011; Terreno et l., 2004; Zhng et l., 2005; Zhou et l., 2003). Cependnt, les prcest souffrent de deux limittions mjeures pour une ppliction in vivo. D une prt, les prcest nécessitent l utilistion d une impulsion de sturtion reltivement intense en rison du temps de résidence court des molécules d eu u niveu du site métllique (voir éqution E34). D utre prt, ien que le fcteur d mplifiction tteint soit prometteur (FA ~ 10 5 à 10 6 ), le seuil de détection record enregistré est de 60 µm in vitro, ce qui reste incomptile vec l imgerie moléculire de ciles nnomolires. Une solution pour remédier à ce mnque de sensiilité est d ugmenter le nomre de sites d échnge de protons pr molécule CEST. C est à prtir de cette idée que l équipe de Silvio Aime (Aime et l., 2005) proposé de concentrer des gents prcest dns des liposomes. Ces nouveux gents de contrste CEST sont désignés pr l cronyme lipocest. Des gents lipocest développés pr notre prtenire Gueret ont été évlués u cours de cette thèse et sont présentés dns le chpitre suivnt

61 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Biliogrphie du Chpitre III Aime, S., A. Brge, D. Delli Cstelli, F. Fedeli, A. Mortillro, F. U. Nielsen, nd E. Terreno, 2002, Prmgnetic lnthnide(iii) complexes s ph-sensitive chemicl exchnge sturtion trnsfer (CEST) contrst gents for MRI pplictions.: Mgn Reson Med, v. 47, p Aime, S., D. D. Cstelli, nd E. Terreno, 2005, Highly sensitive MRI chemicl exchnge sturtion trnsfer gents using liposomes: Angewndte Chemie-Interntionl Edition, v. 44, p Arnold, T., nd M. E. Pckrd, 1951: J. Chem. Phys, v. 19, p Bguet, E., nd C. Roy, 1997, Off-resonnce irrdition effect in stedy-stte NMR sturtion trnsfer.: J Mgn Reson, v. 128, p Ci, K., M. Hris, A. Singh, F. Kogn, J. H. Greenerg, H. Hrihrn, J. A. Detre, nd R. Reddy, 2012, Mgnetic resonnce imging of glutmte.: Nt Med, v. 18, p Filippi, M., nd M. A. Rocc, 2004, Mgnetiztion trnsfer mgnetic resonnce imging in the ssessment of neurologicl diseses.: J Neuroimging, v. 14, p Forsén, S., nd R. Hoffmn, 1963, Study of Modertely Rpid Chemicl Exchnge Rections y Mens of Nucler Mgnetic Doule Resonnce, J Chem Phys 1963; 39: Goffeney, N., J. W. M. Bulte, J. Duyn, L. H. Brynt, nd P. C. M. vn Zijl, 2001, Sensitive NMR detection of ctionic-polymer-sed gene delivery systems using sturtion trnsfer vi proton exchnge: Journl of the Americn Chemicl Society, v. 123, p Grd, J., D. Mendelson, F. Hyder, nd R. G. Brynt, 1991, Applictions of nucler mgnetic cross-relxtion spectroscopy to tissues.: Mgn Reson Med, v. 17, p Grossmn, R. I., J. M. Gomori, K. N. Rmer, F. J. Lex, nd M. D. Schnll, 1994, Mgnetiztion trnsfer: theory nd clinicl pplictions in neurordiology.: Rdiogrphics, v. 14, p Guivel-Schren, V., T. Sinnwell, S. D. Wolff, nd R. S. Bln, 1998, Detection of proton chemicl exchnge etween metolites nd wter in iologicl tissues: Journl of Mgnetic Resonnce, v. 133, p Jones, C. K., M. J. Schlosser, P. C. vn Zijl, M. G. Pomper, X. Goly, nd J. Zhou, 2006, Amide proton trnsfer imging of humn rin tumors t 3T.: Mgn Reson Med, v. 56, p

62 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Li, A. X., R. H. E. Hudson, J. W. Brrett, C. K. Jones, S. H. Psternk, nd R. Brth, 2008, Four-Pool Modeling of Proton Exchnge Processes in Biologicl Systems in the Presence of MRI-Prmgnetic Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer (PARACEST) Agents: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 60, p Liddel, U., nd N. F. Rmsey, 1951, Temperture Dependent Mgnetic Shielding in Ethyl Alcohol: J. Chem. Phys., v. 19, p Ling, W., R. R. Regtte, G. Nvon, nd A. Jerschow, 2008, Assessment of glycosminoglycn concentrtion in vivo y chemicl exchnge-dependent sturtion trnsfer (ggcest). Proc Ntl Acd Sci U S A, v. 105, p Liu, G., nd A. A. Gild, 2011, MRI of CEST-sed reporter gene.: Methods Mol Biol, v. 771, p Liu, G., M. M. Moke, Y.-E. Hr-el, C. M. Long, K. W. Y. Chn, A. Crdon, M. Jmil, P. Wlczk, A. A. Gild, G. Sgouros, P. C. M. vn Zijl, J. W. Bulte, nd M. T. McMhon, 2011, In Vivo Multicolor Moleculr MR Imging Using Dimgnetic Chmicl Exchnge Sturtion Trnsfer Liposomes. Mgnetic Resonnce in Medicine 2011, DOI /mrm McConnell, H., 1958, Rection rtes y nucler mgnetic resonnce, J Chem Phys, 28: Peters, J., J. Huskens, nd D. Rer, 1996, Lnthnide induced shifts nd relxtion rte enhncements: Prog. NMR Spectrocopy, v. 28, p Sherry, A., P. Winter, nd K. Wu, Prmgnetic metl ion-sed mcrocyclic mgnetiztion trnsfer contrst gents nd method of use. WO ptent ; Sheth, V. R., Y. Li, L. Q. Chen, C. M. Howison, C. A. Flsk, nd M. D. Pgel, 2011, Mesuring in vivo tumor phe with CEST-FISP MRI. Mgnetic Resonnce in Medicine 2011, DOI /mrm.23038: Mgn Reson Med. Snoussi, K., J. W. M. Bulte, M. Gueron, nd P. C. M. vn Zijl, 2003, Sensitive CEST gents sed on nucleic cid imino proton exchnge: Detection of poly(ru) nd of dendrimer-poly(ru) model for nucleic cid delivery nd phrmcology: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 49, p Sun, P., P. vn Zijl, nd J. Zhou, 2005, Optimiztion of the irrdition power in chemicl exchnge dependent sturtion trnsfer experiments: Journl of Mgnetic Resonnce, v. 175, p Terreno, E., D. Cstelli, G. Crvotto, L. Milone, nd S. Aime, 2004, Ln(III)-DOTAMGIY complexes: A verstile series to ssess the determinnts of the efficcy of prmgnetic

63 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique chemicl exchnge sturtion trnsfer gents for mgnetic resonnce imging pplictions: Investigtive Rdiology, v. 39, p vn Zijl, P. C., nd N. N. Ydv, 2011, Chemicl exchnge sturtion trnsfer (CEST): wht is in nme nd wht isn't?: Mgn Reson Med, v. 65, p vn Zijl, P. C. M., C. K. Jones, J. Ren, C. R. Mlloy, nd A. D. Sherry, 2007, MR1 detection of glycogen in vivo y using chemicl exchnge sturtion trnsfer imging (glycocest): Proceedings of the Ntionl Acdemy of Sciences of the United Sttes of Americ, v. 104, p Wrd, K. M., A. H. Aletrs, nd R. S. Bln, 2000, A new clss of contrst gents for MRI sed on proton chemicl exchnge dependent sturtion trnsfer (CEST): Journl of Mgnetic Resonnce, v. 143, p Woessner, D., 1961, Nucler trnsfer effects in nucler mgnetic resonnce pulse experiments, J Chem Phys,35: Woessner, D. E., S. R. Zhng, M. E. Merritt, nd A. D. Sherry, 2005, Numericl solution of the Bloch equtions provides insights into the optimum design of PARACEST gents for MRI: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 53, p Wolff, S., nd R. Bln, 1990, NMR imging of lile proton exchnge: Journl of Mgnetic Resonnce, v. 86, p Wolff, S. D., nd R. S. Bln, 1989, Mgnetiztion trnsfer contrst (MTC) nd tissue wter proton relxtion in vivo.: Mgn Reson Med, v. 10, p Wolff, S. D., nd R. S. Bln, 1994, Mgnetiztion trnsfer imging: prcticl spects nd clinicl pplictions.: Rdiology, v. 192, p Zhng, S., C. Mlloy, nd A. Sherry, 2005, MRI thermometry sed on PARACEST gents: Journl of the Americn Chemicl Society, v. 127, p Zhng, S., M. Merritt, D. Woessner, R. Lenkinski, nd A. Sherry, 2003, PARACEST gents: modulting MRI contrst vi wter proton exchnge.: Acc Chem Res, v. 36, p Zhng, S. R., P. Winter, K. C. Wu, nd A. D. Sherry, 2001, A novel europium(iii)-sed MRI contrst gent: Journl of the Americn Chemicl Society, v. 123, p Zho, J. M., Y. E. Hr-el, M. T. McMhon, J. Zhou, A. D. Sherry, G. Sgouros, J. W. Bulte, nd P. C. vn Zijl, 2008, Size-induced enhncement of chemicl exchnge sturtion trnsfer (CEST) contrst in liposomes.: J Am Chem Soc, v. 130, p Zhou, J., nd P. C. M. vn Zijl, 2006, Chemicl exchnge sturtion trnsfer imging nd spectroscopy: Progress in Nucler Mgnetic Resonnce Spectroscopy, v

64 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique Zhou, J. Y., B. Ll, D. A. Wilson, J. Lterr, nd P. C. M. vn Zijl, 2003, Amide proton trnsfer (APT) contrst for imging of rin tumors: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 50, p Zhou, J. Y., J. F. Pyen, D. A. Wilson, R. J. Trystmn, nd P. C. M. vn Zijl, 2003, Using the mide proton signls of intrcellulr proteins nd peptides to detect ph effects in MRI: Nture Medicine, v. 9, p

65 CHAPITRE III - Imgerie de trnsfert de sturtion pr échnge chimique

66 CHAPITRE IV - Les lipocest CHAPITRE IV Les lipocest IV.1 Générlités L imgerie moléculire pr RMN est potentiellement une modlité moins coûteuse que l imgerie nucléire, énéficint d une meilleure résolution sptile et comptile vec l cquisition durnt l même session d imges ntomiques ou fonctionnelles. Toutefois, elle souffre d une moindre sensiilité intrinsèque (10-3 à 10-5 M contre 10-9 à M pour l imgerie nucléire). Aussi, l mjorité des trvux récents en imgerie moléculire pr IRM se sont concentrés sur le développement d gents de contrstes permettnt de comler ce fossé. Dns ce contexte, de nouveux gents mcromoléculires prmgnétiques (l pluprt à se de complexe de Gd(III)) et superprmgnétiques (le plus souvent des nnoprticules d oxyde de fer) ont été développés (Crvn, 2009; Corot et l., 2006; Di Mrco et l., 2007). Le principe de ces gents de contrste est de perturer loclement les temps de relxtion T 1, T 2 et T * 2 des protons de l eu. Toutefois ces gents de contrste présentent l inconvénient de perturer le contrste des imges ntomiques de repérge et cette perturtion est mnifeste prfois plusieurs heures près leur dministrtion. Prllèlement, des gents de contrste CEST ont été développés comme lterntive (Aime et l., 2005; Sherry et l.; Zhng et l., 2003). L imgerie d gents de contrste CEST permet de générer un contrste «ctivle» lorsqu une sturtion sélective des solutés est rélisée. L imgerie CEST permet d tteindre des fcteurs d mplifiction de 10 5 à 10 7 in vitro (Goffeney et l., 2001; Zhng et l., 2003). Aussi, du fit de s dépendnce fréquentielle, l imgerie CEST utorise l détection de plusieurs gents de contrste CEST à l condition que leurs fréquences de résonnce soient distinctes (Liu et l., 2011; Sun, 2010). Dns ce chpitre IV, nous présentons l gent de contrste CEST développé en collortion vec l équipe de Recherche et Développement de Gueret (composée de Mrc Port, Croline Roic, Christelle Médin et Jen-Frnçois Myer) et que nous vons utilisé pour l étude d imgerie moléculire pr IRM-CEST présentée Chpitre VI. Il s git de liposomes nnoprticulires encpsulnt une forte concentrtion de complexes de Thulium. Proposés

67 CHAPITRE IV - Les lipocest initilement pr l équipe de Silvio Aime, ces gents CEST sont désignés pr l cronyme lipocest (Aime et l., 2005). Nous essyerons d expliquer leur fonctionnement, leur synthèse insi que les risons qui ont mené à l formultion retenue. IV.1. Description Un lipocest est un liposome encpsulnt une forte concentrtion de complexes de Lnthnide prmgnétiques. Un liposome est une vésicule rtificielle formée pr une icouche lipidique ellipsoïdle, définissnt en son cœur un comprtiment queux (Bnghm et l., 1965). Il est le plus souvent sphérique et son dimètre peut ller de l centine de nnomètres à quelques micromètres. Dns l perspective de l imgerie moléculire, les liposomes offrent l opportunité d encpsuler un grnd nomre d gents d imgerie ugmentnt de fçon significtive leur concentrtion locle. Cette strtégie été ppliquée vec succès pour différentes techniques d imgerie (Ghghd et l., 2010). Ces dernières nnées, une grnde vriété d rchitectures nno-prticulires ont été explorées et vlidées telles que les micelles, les émulsions, les nno-cpsules, non-seulement en tnt qu gents d imgerie à forte chrge mis ussi en tnt que vecteur pour l dministrtion cilée de drogues (Lmmers et l., 2011; Reddy nd Couvreur, 2011). Dns le cdre de l imgerie CEST, les liposomes constituent un choix nturel. En effet, l icouche lipidique permet à l fois de piéger les complexes prcest sns empêcher l échnge de spins entre deux sites non-équivlents, les deux sites correspondnt ux espces intr- et extr-liposomux. Telles que schémtisées pr l figure F.IV.1, deux popultions de protons cohitent dns une solution queuse de lipocest. Les protons des molécules d eu à l intérieur des liposomes ont une fréquence de précession déplcée en rison, d une prt de leur couplge dipolire rpide vec les complexes de Lnthnides (voir chpitre III échnge rpide), et d utre prt en rison du super-prmgnétisme résultnt de l forte concentrtion locle en ions prmgnétiques (Kuchel et l., 2003)

68 CHAPITRE IV - Les lipocest Figure F.IV.1 : Représenttion schémtique d un lipocest en milieu queux. Une importnte concentrtion de prcest est piégée dns l cvité intr-liposomle d une icouche lipidique. Les molécules d eu de l cvité sont en échnge rpide vec les complexes de Ln 3+ ce qui se mnifeste pr un déplcement chimique importnt de l fréquence de résonnce des protons intr-liposomux. Prllèlement, ces molécules d eu déplcées sont en échnge chimique vec les molécules d eu extr-liposomles. Le tux d échnge trnsmemrnire reltivement lent permet de remplir l condition d oservtion de l effet CEST. Dns une expérience CEST, l impulsion de sturtion est ppliquée à l fréquence de précession moyenne de ces protons internes. Cette sturtion est ensuite trnsférée ux molécules d eu du solvnt vi l diffusion lire à trvers l memrne. Cette diffusion trnsmemrnire des molécules d eu est équivlente à un échnge chimique vec un tux égl à l inverse du temps de résidence moyen d une molécule d eu dns l cvité intrliposomle. Contrirement ux gents prcest présentés u chpitre précédent, il est vntgeux que le tux d échnge lipo k ex pr kex entre les molécules d eu de l cvité intérieure et l gent prcest soit le plus rpide possile. Ainsi, on mximise l quntité de molécules d eu en interction dipolire vec les complexes et pr conséquent le déplcement chimique moyen et l effet CEST tteignle pr nnoprticule. En fit, c est le tux d échnge trnsmemrnire qui permet de stisfire l condition d oservtion de l effet CEST (voir

69 CHAPITRE IV - Les lipocest reltion E17). On peut donc identifier deux éléments mjeurs à optimiser pour mximiser l efficcité du lipocest : le complexe de Lnthnide prmgnétique et l memrne du liposome. IV.1. Influence du complexe de Lnthnide prmgnétique Comme expliqué précédemment, des complexes de Lnthnide prmgnétiques, les prcest, ont été développés pour l imgerie CEST. Afin notmment de grntir l même stilité thermodynmique que les complexes de Gd(III) utilisés pour l imgerie pondéré T 1, des chéltes similires ont été considérés (Hekmtyr et l., 2005). Les lignds courmment utilisés sont des chéltes de Lnthnide dérivés du 1,4,7,10-tetrz-1,4,7,10- tetrkis(croxymethyl)cyclodecne (DOTA, figure F.IV.2, formule [1]) (Aime et l., 2005). Ces lignds possèdent un site d échnge rpide pour lequel l théorie de Solomon-Bloemergen prévoit des tux d échnge de l ordre de 10 8 s -1 (Prker et l., 2002). De tels tux d échnge sont fvorles à une forte relxivité du complexe de Gd(III) mis incomptile vec l oservtion d un effet CEST. Pour l imgerie prcest, l dynmique de solvttion des molécules d eu donc été rlentie grâce à l jout de chînes ltérles sur les lignds mcrocycliques, comme des groupements tétr-mides pr exemple (Aime et l., 1998; Aime et l., 1999; Zhng et l., 2003). Toutefois, cet effet stérique est modulé en fonction du Lnthnide considéré. Ainsi, le tux d échnge peux vrier de deux ordres de grndeur pour le même chélte (voir le tleu T.IV.1 tiré de (Zhng et l., 2003)). On remrque notmment le tux d échnge reltivement lent du complexe d Europium(III) fvorle à l imgerie prcest. On constte églement les tux d échnge rpides pour le Thulium et l Ytterium ( 300 khz) insi que les déplcements chimiques importnts oservés pour les complexes de Dysprosium (-720 ppm) et de Thulium (500 ppm). Toutefois, l encpsultion de tels complexes dns des liposomes sphériques n permis de n tteindre que des déplcements chimiques de l ordre de 4 ppm (Terreno et l., 2008)

70 CHAPITRE IV - Les lipocest Tleu T.IV.1 : Influence du Ln 3+. Comprison des déplcements fréquentiels Δ et des tux d échnge k ex des protons liés à un complexe de Ln(III)-DOTA-tétr-mide (vec Ln 3+ = Pr 3+ (Prséodyme) / Nd 3+ (Néodyme) / Sm 3+ (Smrium) / Eu 3+ (Europium) / T 3+ (Terium) / Ho 3+ (Holmium) / Er 3+ (Erium) /Tmr 3+ (Thulium) / Y 3+ (Ytterium). Données tirées de (Zhng et l., 2003). Afin d ugmenter dvntge le déplcement chimique du lipocest (pour une concentrtion en complexes fixe et une géométrie de liposome donnée), deux options ont été proposées pr l équipe de Silvio Aime (Terreno et l., 2008). L première solution consiste à ugmenter le nomre de centres prmgnétiques pr gent prcest. Ceci été rélisé en utilisnt des complexes multimériques, présentnt jusqu à 3 centres prmgnétiques. En évlunt des complexes de Tm 3+ monomérique, dimérique et trimérique, des déplcements chimiques de 15, 21 et 28 ppm ont été tteints respectivement. Comme ttendu, le déplcement chimique croît vec le nomre de centres prmgnétiques. Cependnt, l dépendnce n est ps linéire cr l ccessiilité des molécules d eu ux différents centres prmgnétiques n est ps équivlente. L seconde possiilité consiste à utiliser des complexes prcest ynt un nomre de coordintion q supérieur à un. Cette pproche été proposée pr l équipe de Recherche et Développement de Gueret et fit l ojet d un dépôt de demnde de revet en 2004 pulié en 2006 (Port, 2006). Ainsi, pour une concentrtion donnée en complexe de Lnthnide, le nomre de molécules d eu dns l sphère de coordintion du complexe est multiplié pr le nomre de coordintion q ugmentnt théoriquement d utnt le déplcement du lipocest. Dns le cdre de cette thèse, nous vons testé vec notre prtenire industriel Gueret, différentes formultions de complexes prmgnétiques fin d optimiser le déplcement chimique des protons encpsulés. Nous vons insi testé différents Lnthnides, différentes formultions de chéltes, notmment des complexes multimériques et des complexes vec un nomre de coordintion q égl à

71 CHAPITRE IV - Les lipocest Figure F.IV.2 : Structure des cinq lignds utilisés. [1] DOTA ; [2] DOTMA ; [3] PCTA ; [4] DO3A et [5] Tétr-DOTA

72 CHAPITRE IV - Les lipocest IV.1.c Influence de l memrne L memrne du lipocest doit ssurer une doule fonction. D une prt, s perméilité ux molécules d eu doit stisfire l condition d oservtion de l effet CEST, à svoir un lipo k ex nettement inférieur u déplcement chimique moyen des protons de l eu encpsulée. D utre prt, elle doit ssurer une encpsultion efficce et stle d une quntité mximle de complexes prmgnétiques. On comprend dès lors que l perméilité de l memrne est le prmètre physico-chimique essentiel. Figure F.IV.3 : Structure des constitunts des memrnes des liposomes. Les memrnes sont constituées d un mélnge de POPC, de DPPG et de Cholestérol. Une memrne constituée essentiellement de phospholipides vec des chînes d cides grs insturés (tels que le POPC (1-plmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)) est eucoup plus perméle qu une memrne vec des phospholipides sturés (tels que le DPPG (1,2-diplmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rc-glycerol)) (Huster et l., 1997; Koenig et l., 1992). Les structures de ces composés sont présentées sur l figure F.IV.3. Cette différence s explique pr l gencement plus compct des chînes hydrophoiques vec le DPPG. Dns le cs du POPC, l présence d insturtions réduit l étnchéité de l memrne et ugmente donc l diffusivité des molécules d eu. L pluprt des memrnes sont donc composées d un mélnge de ces deux phospholipides. Cependnt, une telle memrne est reltivement instle. Il été montré que l jout de Cholestérol permet de stiliser l icouche lipidique (Gensure et

73 CHAPITRE IV - Les lipocest l., 2006; Koenig et l., 1992). Etnt donné que l memrne est plus compcte, l perméilité est réduite. Pr conséquent, le tux d échnge trnsmemrnire est rlenti, ce qui permet de remplir l condition d oservtion de l effet CEST. Les lipocest de première génértion étient insi composés de POPC/DPPG/Cholestérol dns des proportions en msse de 55/5/40, ce qui correspond à des proportions molires de 40/4/56 (Aime et l., 2005). L synthèse d un tel lipocest est rélisée dns un milieu isotonique, et pr conséquent il présente une géométrie sphérique. Or, des trvux de l même équipe ont démontré que l forme des liposomes pouvit fortement influencer le déplcement des lipocest. En effet, le déplcement Δ du lipocest est en rélité une somme de deux composntes : E37 dipolire BMS eu eu. L composnte dipolire dipolire eu correspond u déplcement chimique moyen des molécules d eu en interction vec les complexes de Tm(III) encpsulés et de l eu lire intrliposomle. Elle dépend de l concentrtion en complexes et de leur tux d échnge k deuxième composnte pr ex. L BMS eu est liée à l effet de susceptiilité mgnétique dû à l forte concentrtion de centres prmgnétiques (BMS pour Bulk Mgnetic Susceptiility) (Chu et l., 1990). Pour oserver un effet de susceptiilité mgnétique, il fut que les moments mgnétiques des complexes encpsulés s orientent préférentiellement selon le chmp mgnétique sttique. Dns le cs d un lipocest sphérique, les moments individuels sont équidistriués, le moment BMS mgnétique glol du lipocest est donc nul, eu l est ussi pr conséquent. Pour rendre ce terme non nul, il fut forcer l nisotropie des complexes prmgnétiques. Une méthode consiste à déformer les liposomes grâce à l ppliction d un choc osmotique dns une solution hypotonique (~ 40 mosm/kg) (Terreno et l., 2007). Cette technique permet d tteindre des déplcements chimiques de plusieurs dizines de ppm (jusqu à -45 ppm). Nénmoins, il ne s git ps d une solution envisgele pour l imgerie in vivo. En effet, les vleurs typiques d osmollité du plsm snguin vrient entre 280 et 310 mosm/kg chez les mmmifères (Iseri et l., 1965). Pr conséquent, des liposomes vec une osmollité interne de 40 mosm/kg sont susceptiles d imploser à l suite de leur injection dns le sng. C est pourquoi nous n vons ps considéré ces liposomes nisotropes pour notre étude en dépit de leurs performnces remrqules

74 CHAPITRE IV - Les lipocest Dns le cdre de cette thèse, nous vons testé des liposomes sphériques synthétisés pr notre prtenire industriel Gueret dns le mnnitol vec une osmollité d environ 300 mosm/kg vec des memrnes composées de POPC/DPPG/Cholestérol (Aime et l., 2005). Nous vons en prticulier évlué l influence du tux de Cholestérol sur les performnces de notre lipocest. IV.2 Optimistion des lipocest IV.2. Choix du Ln(III) Afin de confirmer les oservtions rpportées pr l équipe de Silvio Aimé concernnt l influence du Lnthnide sur le déplcement du lipocest, nous vons cquis les Z-spectr de cinq lipocest encpsulnt des complexes de Prséodyme (Pr 3+ ), d Ytterium (Y 3+ ), de Dysprosium (Dy 3+ ), de Néodyme (Nd 3+ ) et de Thulium (Tm 3+ ). Le lignd de complextion étit le même, à svoir de l cide 4,7-Bis-croxymethyl-1,4,7,10-tetr z-cyclododec-1-yl)- cetique (DO3A, figure F.IV.2, formule [4]). Les prmètres de sturtion utilisés pour l cquisition des Z-spectr sont précisés dns le chpitre suivnt. Le tleu T.IV.2 résume les effets CEST et les déplcements chimiques oservés pour chque lipocest. Les résultts sont en ccord vec les propriétés des complexes de Lnthnides présentées dns le tleu T.IV.1. Conformément à nos ttentes, le complexe de Tm 3+ permet d otenir les performnces les plus intéressntes. En effet, les complexes de Tm 3+ présentent en milieu queux des déplcements chimiques importnts et des tux d échnge rpides (respectivement 500 ppm et 333 khz). Les deux complexes d Y 3+ et de Dy 3+ présentent églement des crctéristiques CEST intéressntes. Mis on peut expliquer leurs moindres performnces pr le plus file déplcement chimique de l Y 3+ pr rpport u Tm 3+ (200 ppm contre 500 ppm) et en rison du tux d échnge reltivement modeste des complexes de Dy 3+ (59 khz contre 333 khz). Enfin, les complexes de Pr 3+ et Nd 3+ ne constituent ps des solutions crédiles pour l imgerie CEST. Nous vons donc retenu le Tm

75 CHAPITRE IV - Les lipocest Tleu T.IV.2 : Choix du Lnthnide. Des lipocest contennt des complexes de DO3A- Ln(III) sont comprés vec Ln 3+ = Prséodyme (Pr 3+ ), Ytterium (Y 3+ ), Dysprosium (Dy 3+ ), Néodyme (Nd 3+ ) et Thulium (Tm 3+ ). IV.2. Choix du lignd Nous vons évlué les performnces de lipocest encpsulnt cinq complexes différents (voir figure F.IV.2) : 2 lipocest de référence contennt des complexes monovlents de DOTA- Tm(III) formule [1], et d cide α,α,α,α -tetrmethyl-1,4,7,10-tetrcetique (DOTMA-Tm(III), formule [2]), déjà évlués pr Aime et collorteurs (Aime et l., 2005), 2 lipocest contennt des complexes multivlents (q = 2) d cide 3,6,9,15- tetrzicyclo[9.3.1]pentdec-1(15),11,13-triene-3,6,9,-tricetique (PCTA- Tm(III), formule [3]), et d cide 4,7-Bis-croxymethyl-1,4,7,10-tetr zcyclododec-1-yl)-cetique (DO3A-Tm(III), formule [4]), et un complexe tétrmérique de DOTA (Tétr-DOTA, formule [5]). Leurs crctéristiques CEST sont résumées dns le tleu T.IV

76 CHAPITRE IV - Les lipocest Tleu T.IV.3 : Choix du lignd. Des lipocest contennt des complexes de DOTMA-Tm(III), DOTA-Tm(III), PCTA-Tm(III), DO3A-Tm(III) et Tétr-DOTA-Tm(III) sont comprés. On constte que le déplcement otenu vec les lignds ynt un nomre de coordintion q = 1 est u mximum de 4 ppm, ce qui est cohérent vec les résultts de l littérture (Viswnthn et l., 2010). Comme espéré, l utilistion de lignds vec un q = 2 permet d ugmenter significtivement le déplcement du lipocest, d u moins un fcteur 2. Avec le DO3A, le déplcement est de 10 ppm. Enfin, le plus grnd déplcement chimique (11 ppm) est oservé vec le lipocest encpsulnt le complexe tétrmérique. Nénmoins, nous espérions un déplcement plus importnt. Théoriquement, le déplcement vec le complexe tétrmérique urit dû être 4 fois plus importnt que celui vec les complexes monomériques, soit d environ 16 ppm. Une expliction prole est liée à l difficulté d encpsultion de l solution de complexes tétrmériques lors de l synthèse du lipocest. En effet, l solution de tétrmère est nettement plus visqueuse que les solutions de monomère, il est lors difficile d encpsuler l même concentrtion de complexes monomériques. Pr illeurs, cette difficulté de synthèse se mnifeste pr une plus grnde vriilité dns les crctéristiques CEST entre lots de lipocest. Pr conséquent, nous vons écrté ce lipocest u énéfice du lipocest encpsulnt des complexes de DO3A-Tm(III) dont les performnces sont stisfisntes. Nous vons insi privilégié l reproductiilité des crctéristiques CEST pour notre étude d imgerie moléculire in vivo

77 CHAPITRE IV - Les lipocest IV.2.c Choix de l memrne En nous inspirnt des mélnges de phospholipides (POPC et DPPG) et de lipides (Cholestérol) courmment utilisés pour l formultion de liposomes, nous vons optimisé les crctéristiques CEST en fonction de l proportion de Cholestérol dns l memrne (de 0 à 57% en moles). Les liposomes ont été synthétisés selon l méthode décrite dns l littérture (Bnghm et l., 1965). Bien que l distriution des tilles de lipocest ne soit ps vérifiée systémtiquement, le procédé permet en générl d otenir des liposomes dont le ryon hydrodynmique moyen est de l ordre de 170 nm. Tleu T.IV.4 : Choix de l memrne. Différentes proportions de POPC, DPPG et Cholestérol ont été testées. Les proportions de chque constitunt sont indiquées en pourcentge molire. D près le tleu T.IV.4, on constte que le déplcement chimique Δ du lipocest ugmente vec le tux de Cholestérol dns l memrne. Etnt donné que l jout de Cholestérol est connu pour rigidifier l memrne du liposome (Tilcock et l., 1990), il est prole qu un tux plus importnt de Cholestérol limite les fuites de complexes prmgnétiques à trvers l memrne et stilise leur concentrtion intr-liposomle. Ceci pour conséquence d ugmenter le déplcement du lipocest. Pr illeurs, on constte un effet CEST croissnt vec le tux de Cholestérol (jusqu à 35% pour 57% de Cholestérol). Cette oservtion est

78 CHAPITRE IV - Les lipocest cohérente vec l encpsultion d une plus grnde concentrtion de complexes. Elle nous indique églement que jusqu à 57% de Cholestérol, il n y ps d entrve nette à l diffusion intrmemrnire des molécules d eu. Enfin, des lipocest vec 57% de Cholestérol ont été conservés à 4 C et des Z-spectr ont été cquis vnt et près 9 mois fin d évluer leur stilité. Les crctéristiques CEST étient légèrement dégrdées (Δ = 7 ppm, MTRsym = 31%), ttestnt d une stilité suffisnte pour notre protocole d imgerie CEST. Pr conséquent, nous vons retenu l composition de memrne POPC/DPPG/Cholestérol de 39,6/3,7/56,7 % en moles. IV.2.d Furtivité et Fonctionnlistion L ojectif de cette thèse étit d évluer les gents lipocest pour l imgerie moléculire pr IRM-CEST. Or, on sit que des liposomes injectés dns l circultion snguine peuvent être cptés rpidement pr le système réticulo-endothélil (S.R.E), notmment u niveu du foie et de l rte (Fidler et l., 1980; Hunt et l., 1979; Poste et l., 1982). Après injection dns l circultion snguine, les opsonines (protéines se lint à des ntigènes) se lient ux liposomes pour permettre une reconnissnce rpide pr les mcrophges (Moghimi nd Hunter, 2001). L méthode courmment utilisée pour rendre des nnoprticules «furtives» visà-vis du S.R.E et insi llonger leur temps de demi-vie est d jouter u liposome un polymère iocomptile et iodégrdle : le polyéthylène glycol (Klinov et l., 1990). Grâce u PEG, l fixtion des opsonines sur les liposomes est rlentie, ce qui permet de limiter leur cpttion pr le système immunitire. Pr conséquent, nous vons intégré 5% de PEG à l composition précédemment décrite. En définitive, l composition retenue est donc POPC/DPPG/Cholestérol/ DSPE-PEG2000 dns des proportions molires de 32/5/58/5. Pr illeurs, l memrne étnt formée d une icouche lipidique, il est reltivement fcile de fonctionnliser le lipocest en y greffnt des phrmcophores, le plus souvent des peptides ynt une ffinité importnte pour un iomrqueur pthologique. Afin de réliser cette fonctionnlistion, un phospholipide DSPE-PEG2000 conjugué u peptide est jouté à l préprtion lipidique à 2%. Afin d évluer nos gents lipocest, nous vons choisi de nous intéresser à un modèle tumeur chez l souris (U87MG) et de ciler l intégrine α ν β 3 surexprimée lors de l ngiogenèse tumorle (nous y reviendrons plus en détils dns le chpitre VI) (Temming et l., 2005). Ainsi, nous vons fonctionnlisé notre lipocest en greffnt à s surfce un peptide RGD (enchînement d cides minés rginine, glycine et cide sprtique)

79 CHAPITRE IV - Les lipocest lrgement utilisé dns l communuté de l imgerie moléculire pour ciler l intégrine α ν β 3. Enfin, un phospholipide DSPE-PEG2000 conjugué à de l rhodmine églement été incorporé dns l memrne (à 0,1%) fin de pouvoir visuliser l gent de contrste pr imgerie de fluorescence. IV.3 Formultion retenue et crctéristiques CEST Grâce ux tests que nous vons menés sur différentes compositions de lipocest, nous vons pu sélectionner une formultion fvorle à une ppliction en imgerie moléculire pr IRM-CEST (voir figure F.IV.4). L memrne de ce lipocest est composée de POPC/DPPG/ Cholestérol/DSPE-PEG2000/rhodmine dns des proportions molires de 32/5/58/5/0,1. L rhodmine est insérée dns l memrne fin de visuliser le lipocest en imgerie de fluorescence. Le lipocest fonctionnlisé ne comporte que 30% de POPC, les 2% restnts étnt remplcés pr le DSPE-PEG2000 couplé u peptide RGD. Le complexe de Lnthnide choisi est un complexe de DO3A-Tm(III) encpsulé à une concentrtion intr-liposomle de 153 mm. Ceci implique que pour un volume moyen de l cvité liposomle de L, pproximtivement 10 5 complexes sont encpsulés pr lipocest. Un peptide RGD est greffé à l surfce de l memrne fin de ciler spécifiquement l intégrine α ν β 3 surexprimée lors de l ngiogenèse tumorle. Des tests in vitro ont permis de montrer que le RGD-lipoCEST une ffinité su-nnomolire pour le récepteur α ν β 3 (coures dose-réponse confidentielles, données cquises pr notre prtenire industriel Gueret)

80 CHAPITRE IV - Les lipocest Figure F.IV.4 : Schém du lipocest retenu pour le protocole d imgerie moléculire. L memrne est composée de POPC/DPPG/Cholestérol/RGD/PEG/rhodmine (30/5/58/2/5/0,1), le complexe prmgnétique est un complexe de DO3A-Tm(III). L fonctionnlistion du lipocest est ssurée pr le peptide RGD greffé à s surfce et l rhodmine permet de visuliser le lipocest pr imgerie de fluorescence. Enfin, les lipocest contrôle (sns RGD) et fonctionnlisé (vec RGD) ont été crctérisés grâce à l cquisition de leur Z-spectrum (voir figures F.IV.5. et. respectivement). On constte que les 2 lipocest sont légèrement moins efficces que ceux évlués pour l optimistion de l formultion. L différence pourrit être imputle à l jout de PEG dns l memrne. Bien que les Ctrl- et RGD-lipoCEST soient qusiment identiques, ils présentent des effets MTRsym légèrement différents (voir figures F.IV.5.c et.d respectivement). Il est possile que l jout de RGD à l surfce de l memrne perture l échnge d eu trnsmemrnire. Cette différence peut ussi être ttriuée u processus de synthèse. En effet, si l quntité de complexes encpsulée ou l concentrtion en nnoprticules vrient légèrement entre deux lots, les déplcements chimiques et les effets CEST peuvent chnger. Ces 2 lipocest ont été évlués pour l imgerie moléculire de l ngiogenèse tumorle près injection intrveineuse (IV). Les résultts de cette étude font l ojet du chpitre VI de ce mnuscrit

81 CHAPITRE IV - Les lipocest Figure F.IV.5 : Z-spectr ( et ) et Z-spectr symétriques (c et d) cquis respectivement vec les lipocest contrôle et fonctionnlisé vec le peptide RGD. L concentrtion en Ctrl- et RGD-lipoCEST est de 14 nm

82 CHAPITRE IV - Les lipocest Biliogrphie du chpitre IV Aime, S., A. Brge, M. Bott, A. S. De Sous, nd D. Prker, 1998, Direct NMR Spectroscopic Oservtion of Lnthnide-Coordinted Wter Molecule whose Exchnge Rte Is Dependent on the Conformtion of the Complexes: Angew. Chem. Int. Ed., v. 37, p Aime, S., A. Brge, J. I. Bruce, M. Bott, J. A. K. Howrd, J. M. Moloney, D. Prker, A. S. de Sous, nd M. Woods, 1999, NMR, Relxometric, nd Structurl Studies of the Hydrtion nd Exchnge Dynmics of Ctionic Lnthnide Complexes of Mcrocyclic Tetrmide Lignds: J. Am. Chem. Soc, v. 121, p Aime, S., D. D. Cstelli, nd E. Terreno, 2005, Highly sensitive MRI chemicl exchnge sturtion trnsfer gents using liposomes: Angewndte Chemie-Interntionl Edition, v. 44, p Bnghm, A. D., M. M. Stndish, nd J. C. Wtkins, 1965, Diffusion of univlent ions cross the lmelle of swollen phospholipids.: J Mol Biol, v. 13, p Crvn, P., 2009, Protein-trgeted gdolinium-sed mgnetic resonnce imging (MRI) contrst gents: design nd mechnism of ction.: Acc Chem Res, v. 42, p Chu, S. C., Y. Xu, J. A. Blschi, nd C. S. Springer, 1990, Bulk mgnetic susceptiility shifts in NMR studies of comprtmentlized smples: use of prmgnetic regents.: Mgn Reson Med, v. 13, p Corot, C., P. Roert, J. M. Idée, nd M. Port, 2006, Recent dvnces in iron oxide nnocrystl technology for medicl imging.: Adv Drug Deliv Rev, v. 58, p Di Mrco, M., C. Sdun, M. Port, I. Guilert, P. Couvreur, nd C. Duernet, 2007, Physicochemicl chrcteriztion of ultrsmll superprmgnetic iron oxide prticles (USPIO) for iomedicl ppliction s MRI contrst gents.: Int J Nnomedicine, v. 2, p Fidler, I. J., A. Rz, W. E. Fogler, R. Kirsh, P. Bugelski, nd G. Poste, 1980, Design of liposomes to improve delivery of mcrophge-ugmenting gents to lveolr mcrophges.: Cncer Res, v. 40, p Gensure, R. H., M. L. Zeidel, nd W. G. Hill, 2006, Lipid rft components cholesterol nd sphingomyelin increse H+/OH- permeility of phosphtidylcholine memrnes.: Biochem J, v. 398, p

83 CHAPITRE IV - Les lipocest Ghghd, K. B., R. R. Colen, C. R. Hwley, N. Ptel, nd S. Mukundn, 2010, Liposoml contrst gents in rin tumor imging.: Neuroimging Clin N Am, v. 20, p Goffeney, N., J. W. M. Bulte, J. Duyn, L. H. Brynt, nd P. C. M. vn Zijl, 2001, Sensitive NMR detection of ctionic-polymer-sed gene delivery systems using sturtion trnsfer vi proton exchnge: Journl of the Americn Chemicl Society, v. 123, p Hekmtyr, S. K., P. Hopewell, S. K. Pkin, A. Bsky, nd N. Bnsl, 2005, Noninvsive MR thermometry using prmgnetic lnthnide complexes of 1,4,7,10- tetrzcyclodoecne-lph,lph',lph'',lph'''-tetrmethyl-1,4,7,10-tetrcetic cid (DOTMA4-). Mgn Reson Med, v. 53, p Hunt, C. A., Y. M. Rustum, E. Myhew, nd D. Pphdjopoulos, 1979, Retention of cytosine rinoside in mouse lung following intrvenous dministrtion in liposomes of different size.: Drug Met Dispos, v. 7, p Huster, D., A. J. Jin, K. Arnold, nd K. Gwrisch, 1997, Wter permeility of polyunsturted lipid memrnes mesured y 17O NMR.: Biophys J, v. 73, p Iseri, L. T., M. A. Kpln, M. J. Evns, nd E. D. Nickel, 1965, Effet of concentrted contrst medi during ngiogrphy on plsm volume nd plsm osmollity: Am Hert J, v. 69, p Klinov, A. L., K. Mruym, V. P. Torchilin, nd L. Hung, 1990, Amphipthic polyethyleneglycols effectively prolong the circultion time of liposomes.: FEBS Lett, v. 268, p Koenig, S. H., Q. F. Ahkong, R. D. Brown, M. Lfleur, M. Spiller, E. Unger, nd C. Tilcock, 1992, Permeility of liposoml memrnes to wter: results from the mgnetic field dependence of T1 of solvent protons in suspensions of vesicles with entrpped prmgnetic ions.: Mgn Reson Med, v. 23, p Kuchel, P., B. E. Chpmn, W. Bu, P. Hnsen, C. Durrnt, nd M. Hertzerg, 2003, Mgnetic susceptiility: Solutions, emulsions, nd cells: Concepts in Mgnetic Resonnce, v. 18A, p Lmmers, T., S. Aime, W. E. Hennink, G. Storm, nd F. Kiessling, 2011, Thernostic nnomedicine.: Acc Chem Res, v. 44, p Liu, G., M. M. Moke, Y.-E. Hr-el, C. M. Long, K. W. Y. Chn, A. Crdon, M. Jmil, P. Wlczk, A. A. Gild, G. Sgouros, P. C. M. vn Zijl, J. W. Bulte, nd M. T. McMhon, 2011, In Vivo Multicolor Moleculr MR Imging Using Dimgnetic Chmicl

84 CHAPITRE IV - Les lipocest Exchnge Sturtion Trnsfer Liposomes. Mgnetic Resonnce in Medicine 2011, DOI /mrm Moghimi, S. M., nd A. C. Hunter, 2001, Recognition y mcrophges nd liver cells of opsonized phospholipid vesicles nd phospholipid hedgroups.: Phrm Res, v. 18, p Prker, D., R. S. Dickins, H. Puschmnn, C. Crosslnd, nd J. A. Howrd, 2002, Being excited y lnthnide coordintion complexes: qu species, chirlity, excited-stte chemistry, nd exchnge dynmics.: Chem Rev, v. 102, p Port, M., 2006, Contrst gents encpsulting systems for CEST imging. WO 2006/032705; Poste, G., C. Bucn, A. Rz, P. Bugelski, R. Kirsh, nd I. J. Fidler, 1982, Anlysis of the fte of systemiclly dministered liposomes nd implictions for their use in drug delivery.: Cncer Res, v. 42, p Reddy, L. H., nd P. Couvreur, 2011, Nnotechnology for therpy nd imging of liver diseses.: J Heptol, v. 55, p Sherry, A., P. Winter, nd K. Wu, Prmgnetic metl ion-sed mcrocyclic mgnetiztion trnsfer contrst gents nd method of use. WO ptent ; Sun, P., 2010, Simplified nd sclle numericl solution for descriing multi-pool chemicl exchnge sturtion trnsfer (CEST) MRI contrst: Journl of Mgnetic Resonnce, v. 205, p Temming, K., R. M. Schiffelers, G. Molem, nd R. J. Kok, 2005, RGD-sed strtegies for selective delivery of therpeutics nd imging gents to the tumour vsculture.: Drug Resist Updt, v. 8, p Terreno, E., A. Brge, L. Beltrmi, G. Crvotto, D. D. Cstelli, F. Fedeli, B. Jesingh, nd S. Aime, 2008, Highly shifted LIPOCEST gents sed on the encpsultion of neutrl polynucler prmgnetic shift regents.: Chem Commun (Cm), p Terreno, E., C. Cell, C. Crrer, D. Delli Cstelli, R. Mzzon, S. Rollet, J. Stncnello, M. Visiglli, nd S. Aime, 2007, From sphericl to osmoticlly shrunken prmgnetic liposomes: n improved genertion of LIPOCEST MRI gents with highly shifted wter protons.: Angew Chem Int Ed Engl, v. 46, p Tilcock, C., P. McDougll, E. Unger, D. Crdens, nd L. Fjrdo, 1990, The effect of lipid composition on the relxivity of Gd-DTPA entrpped in lipid vesicles of defined size.: Biochim Biophys Act, v. 1022, p

85 CHAPITRE IV - Les lipocest Viswnthn, S., Z. Kovcs, K. N. Green, S. J. Rtnkr, nd A. D. Sherry, 2010, Alterntives to Gdolinium-Bsed Metl Cheltes for Mgnetic Resonnce Imging: Chemicl Reviews, v. 110, p Zhng, S., M. Merritt, D. Woessner, R. Lenkinski, nd A. Sherry, 2003, PARACEST gents: modulting MRI contrst vi wter proton exchnge.: Acc Chem Res, v. 36, p

86 CHAPITRE IV - Les lipocest

87 CHAPITRE IV - Les lipocest

88 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T CHAPITRE V Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T V.1 Montge expérimentl V.1. Scnner IRM 7T Tous les résultts présentés dns ce mnuscrit de thèse ont été cquis sur le scnner IRM 7T PhrmScn Bruker (Bruker Biospin, Ettlingen, Allemgne, voir figure F.V.1). Le chmp sttique de ce scnner IRM est de 7,05T, correspondnt à une fréquence de résonnce du proton de 300,31 MHz. Ce système est équipé de grdients d intensité mximle de 752 mt/m et le dimètre interne utile est de 8.5 cm. Le logiciel utilisé pour l cquisition des données et l progrmmtion de séquences est le logiciel PrVision 5.1. Figure F.V.1 : Scnner IRM 7T PhrmScn Bruker de NeuroSpin

89 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T V.1. Sondes rdiofréquences Deux ntennes 1 H ont été utilisées u cours de cette thèse. L première est une ntenne volumique 1 H commercile de type «cge d oiseu» (voir figure F.V.2.) dont le dimètre interne de 34 mm permet l imgerie cérérle chez le rt. Cette ntenne été utilisée principlement pour tester in vitro les performnces de nos lipocest. L deuxième ntenne est une ntenne qudrture volumique 1 H de 28 mm de dimètre intérieur. Cette ntenne été développée et rélisée dns le lortoire d électronique de NeuroSpin (voir figure F.V.2.). En rison de s plus file dimension et de l disposition en qudrture de ses circuits résonnts, cette ntenne est prticulièrement dptée à l imgerie cérérle chez l souris. D près des tests in vitro sur fntôme d eu slée (0,9% de NCl), cette ntenne permet de ggner pproximtivement 100% en Rpport Signl-sur-Bruit (SNR pour Signl-to-Noise Rtio) pr rpport à l ntenne volumique Bruker. Nous vons donc utilisé cette ntenne pour notre étude in vivo chez l souris. Figure F.V.2 : Antennes rdiofréquences 1 H. L ntenne volumique Bruker () été utilisée pour les expériences in vitro. L ntenne qudrture volumique () été développée dns le lortoire d électronique et été utilisée pour les expériences chez l souris

90 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T V.1.c Anesthésie et positionnement des nimux Conformément ux réglementtions ntionle (87/848) et européenne (86/609) en vigueur, les rongeurs ont été systémtiquement nesthésiés vnt et pendnt les cquisitions IRM. L nesthésie gzeuse été rélisée vec 1 à 3% d isoflurne diffusé dns un mélnge ir/o 2 (50/50 en volume). L nesthésie gzeuse permis d juster le niveu d nesthésie de l niml (notmment s fréquence respirtoire) durnt le protocole d cquisition. Les prmètres physiologiques des nimux ont été contrôlés et mintenus pendnt l durée du protocole. L tempérture été grdée constnte à 37 C grâce à un système de soufflerie d ir chud et un système d sservissement. Le rythme respirtoire des souris été mintenu entre 50 et 80 respirtions pr minute. Les souris ont été disposées dns un msque dpté ux dimensions de l ntenne qudrture. En rison de l géométrie de l ntenne incomptile vec l instlltion de rres d oreille, le mintien de l tête été ssuré pr une fixtion en deux points : le mors à dents et un point de compression à l vnt du museu. V.2 L Séquence CEST-MSME V.2. Présenttion L un des vntges de l imgerie CEST est qu il est isé de trnsformer une séquence IRM conventionnelle en séquence d imgerie CEST. Il suffit pour cel d incorporer un module de sturtion. Dns une lrge mjorité de pulictions sur l imgerie CEST (endogène ou exogène), des séquences de type Echo de Spin ont été utilisées (Liu et l., 2011; Quesson et l., 1997; Terreno et l., 2009; vn Zijl et l., 2007). Elles présentent l vntge d être reltivement peu sensiles ux inhomogénéités de chmp B 0, ce qui est fvorle pour l imgerie in vivo à très hut chmp mgnétique. Pr illeurs, les temps de répétition sont usuellement plus longs qu vec des séquences de type Echo de Grdient, ce qui permet notmment l ppliction de module de sturtion long. Nous vons donc orienté notre choix vers une séquence MSME (pour Multi-Slices Multi-Echos). Un module de sturtion composé d un trin de trois impulsions crrées été incorporé. Le schém de l séquence CEST-MSME est représenté sur l figure F.V

91 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T Figure F.V.3 : Schém de l séquence CEST-MSME. Les prmètres de l séquence CEST-MSME sont les suivnts : Temps de répétition : TR = 5000 ms 12 échos enregistrés séprément vec TE 1 = 8 ms et un écrt inter-écho de 8 ms Résolution : 150x150x660 µm 3 Tille de l mtrice : 128x128 Nomre de coupes : n coupe = 10 Temps de sturtion : T st = 384 ms Temps d cquisition : T cq = 6 min. Dns une séquence MSME, l cquisition du signl repose sur le principe d écho de spin proposé pr Hhn en 1950 (Hhn, 1950). Après une impulsion RF de 90, les spins sont sculés dns le pln trnsverse. Ils suissent lors un déphsge en rison des inhomogénéités de chmp mgnétique. Si une impulsion de 180 est ppliquée selon l utre xe du pln trnsverse près un temps τ, les spins se refoclisent et créent un écho. Cet écho donc lieu u temps TE = 2τ. En ppliqunt une série d impulsions de 180 espcées de TE, il est lors possile de créer un trin d échos. Dns le cs de l séquence MSME, le trin d échos respecte les conditions CPMG (d près le nom des inventeurs ; Crr, Purcell, Meioom et Gill (Meioom nd Gill, 1958)). L enveloppe du trin d échos suit une décroissnce exponentielle dépendnt uniquement du T 2 (voir figure F.V.4). Dns une séquence MSME, chcun des n échos correspond à une même ligne de l espce k vec une pondértion T 2 croissnte. Il est notmment possile de sommer les différentes imges fin d ccroître le SNR. Pr illeurs, l

92 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T séquence MSME permet une couverture sptile efficce puisque plusieurs coupes peuvent être imgées successivement u cours du temps de répétition. Pour notre étude, 10 coupes de 660 µm d épisseur ont été cquises pr TR, ce qui permis d imger tout le cerveu en un temps risonnle (T cq = 6 min). Figure F.V.4 : Pondértion T 2 des échos u cours d un module CPMG. L pondértion u n- ème écho est proportionnelle à. V.2. Reconstruction Afin de mximiser le SNR, nous vons choisi d une prt de sommer les 12 imges correspondnt ux différents temps d échos en fonction de leurs SNR respectifs (Lee nd Riederer, 1987) et d utre prt d ppliquer un filtre de Tukey (Gllichn et l., 2010). L séquence MSME permet l cquisition de 12 imges dont l pondértion T 2 est croissnte. A l évidence, il n est ps fvorle de réliser une somme rute des imges. Afin d optimiser le SNR, ou le Rpport Contrste-sur-Bruit (CNR pour Contrst-to-Noise Rtio) d une imge, une somme pondérée doit être rélisée vec des poids égux ux SNR (ou CNR) reltifs de chque écho-imge. Ici, le SNR est défini pr le rpport des intensités mesurées dns 2 régions d intérêt (ROI pour Region of Interest) de 10x10 pixels prises u centre et sur le ord de l espce k. Cette somme pondérée permet de ggner 22% en SNR pr rpport à l somme rute des écho-imges. Afin d ugmenter le SNR en IRM, il est cournt de filtrer les très hutes fréquences (correspondnt notmment u ruit de l imge) sns modifier le centre de l espce k. Nous vons choisi d ppliquer un filtre de Tukey vec un prmètre lph = 0,7. L ppliction de ce filtre permet de ggner 16% en SNR u prix d une dégrdtion de 12% de l résolution sptile de l imge (voir figure F.V.5). Ainsi un gin totl de 41% en SNR été tteint pr rpport à l imge otenue pr l somme rute des écho-imges

93 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T Figure F.V.5 : Reconstruction des imges CEST. En pondérnt l somme des échos pr le SNR mesuré sur chque écho, le SNR est ugmenté de 22%. Si en plus de l somme pondérée un filtre de Tukey est ppliqué, le SNR est ugmenté de 41% u prix d une dégrdtion de 12% de l résolution sptile. V.2.c Module de sturtion Usuellement en imgerie CEST, les modules de sturtion sont constitués soit d une irrdition en onde continue (Delli Cstelli et l., 2010; Stncnello et l., 2008; Terreno et l., 2009), soit d un trin d une centine impulsions reltivement courtes typiquement gussiennes (de l ordre d une dizine de ms) (Mougin et l., 2010; Sheth et l., 2011; vn Zijl et l., 2007; Zhou et l., 2003). Dns chcun des cs, l durée du module est reltivement longue (T st > 1 s). Récemment, Dixon et collorteurs (Dixon et l., 2010) ont démontré l intérêt de modules de sturtion courts répétés à un intervlle régulier en cominison vec une séquence de type Multi-Slice Grdient-Echo. Le déli entre deux répétitions du module de sturtion étnt plus court que le T 1 de l eu, on oserve un effet cumultif de l sturtion sélective (Dixon et l., 2010). De fçon similire, nous vons opté pour un module de sturtion reltivement court de 384 ms composé de 3 impulsions crrées de 128 ms (figure F.V.6.). Le module de sturtion est répété tous les TR/n coupe soit toutes les 500 ms. Le déli inter-module de 116 ms est

94 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T nettement inférieur u T 1 de l eu à 7T (> 1600 ms), il y pr conséquent un effet cumultif de l sturtion. Etnt donné que le déli entre chque impulsion crrée (0,2 ms) est très court pr rpport à l durée d une impulsion, le trin de trois impulsions peut être ssimilé à une impulsion crrée de 384 ms insi que l illustre s trnsformée de Fourier (voir figure F.V.6.). Figure F.V.6 : Profil spectrl du module de sturtion. L lrgeur à mi-huteur de l trnsformée de Fourier d un trin de 3 impulsions crrés de 128 ms () est de 4 Hz ce qui est équivlent à ce qui urit été otenu pour une unique impulsion crré de 384 ms (). Afin de confirmer l effet cumultif de notre module de sturtion, nous vons évlué in vitro l impct du déli entre chque module de sturtion. Pour cel, nous vons fit vrier l durée du module de sturtion pour un temps de répétition fixe de 5000 ms. Les données ont été cquises vec un lipocest similire à ceux utilisés chez l souris et vec des prmètres de sturtion optimux (δ st = 8 ppm et B 1 = 7 µt). Comme l illustre l figure F.V.7, le contrste

95 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T MTRsym croit rpidement vec le temps de sturtion pour tteindre près de 95% de s vleur mximle u-delà de 100 ms. Bien que nous yons fit le choix d ppliquer notre sturtion pendnt 384 ms, le choix d un temps de sturtion plus court (T st ~ 200 ms) urit été ojectivement préférle. Cel urit notmment permis de diminuer le TR d un fcteur 2 et d ugmenter l quntité de signl pr unité de temps. Mlheureusement, cette oservtion été rélisée trop trdivement et constitue de fit une méliortion à ppliquer pour une prochine étude. Figure F.V.7 : Evolution de l intensité de l effet CEST en fonction de T st. Les données ont été cquises vec un lipocest comprle à celui utilisé pour notre étude in vivo. Les prmètres de sturtion étient : δ st = 8 ppm et B 1 = 7 µt. V.2.d Choix de l puissnce et de l fréquence de sturtion Afin de déterminer les prmètres optimux pour l oservtion d un effet CEST, nous vons simplement choisi d ppliquer les conditions de sturtion permettnt l oservtion d un contrste MTRsym mximum in vitro. Une série de Z-spectrum été systémtiquement cquise in vitro pour des fréquences de sturtion δ st vrint de -20 à 20 ppm et pour des

96 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T intensités de sturtion vriles B 1 de 0 à 8 µt pour chque lot de lipocest. L série de Z- spectr symétriques otenue peut être vntgeusement représentée en 2 dimensions. Un exemple de Z-spectrum 2D cquis sur un lot de RGD-lipoCEST est présenté sur l figure F.V.8. Figure F.V.8 : Z-spectrum 2D du RGD-lipoCEST. Les prmètres de sturtion optimux sont δ st.opt = 8 ppm et B 1opt = 7. L effet MTRsym dns ces conditions de sturtion est de 17%. L concentrtion en RGD-lipoCEST est de 14 nm. Pour ce lipocest, comme pour tous les lots de lipocest utilisés pour l étude in vivo chez l souris U87, les prmètres de sturtion optimux étient : δ st.opt = 8 ppm et B 1opt = 7µT. Dns ces conditions, l effet MTRsym est compris pproximtivement entre 17 et 20%. Ce sont ces conditions de sturtions qui ont été utilisées pour cquérir les données CEST présentées dns le chpitre VI

97 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T V.4 Acquisition des crtes de chmps B 1 et B 0 V.4. Contrôle de l homogénéité du chmp B 1 L effet CEST est dépendnt de l intensité du module de sturtion. Il est donc importnt de s ssurer de l homogénéité du chmp B 1 dns le chmp de vue. Ceci est prticulièrement pertinent lorsqu une ntenne de surfce est utilisée ou lorsque l longueur d onde de l excittion RF est de dimension comprle à l orgne imgé comme c est le cs notmment pour l imgerie cérérle chez l homme à très hut chmp mgnétique. Afin de vérifier l homogénéité du chmp RF, nous vons systémtiquement cquis une crte de B 1 préllement ux cquisitions CEST in vivo. Pour cel, nous vons utilisé l méthode de l ngle doule (Stollerger nd Wch, 1996) qui consiste à clculer l distriution du chmp B 1 à prtir de deux imges d écho de grdient cquises vec deux ngles de scule α 1 et α 2 (α 1 = 30, α 2 = 60 et TR = 3000 ms). Le TR doit être suffismment long pour que l intensité I des imges ne soit ps pondérée pr un effet de relxtion T 1. Ces deux imges permettent de clculer l ngle de scule effectif α eff dns l imge grâce à l reltion suivnte : E38 1 I 2 eff cos 2.I. 1 Le rpport eff / 1 représente lors l erreur commise sur l ngle de scule. L crte de chmp B 1 est lors extrpolée grâce à l reltion suivnte : eff E39 B1. B1th., vec B 1th. l vleur théorique de l impulsion RF. 1 Un exemple de crte B 1 est présenté figure F.V.9.. On constte que le chmp B 1 est reltivement homogène dns l ensemle du cerveu de l souris. En effet, l distriution du chmp B 1 à trvers le cerveu est représentée figure F.V.9. et l vleur moyenne est de B 1 = 7,4 ± 0.7 µt (moyenne ± écrt-type). L dispersion reltive du chmp B 1 est estimée à 9%

98 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T Figure F.V.9 : Crte typique de chmp B 1. L crte de chmp B 1 () été cquise vec l ntenne qudrture volumique. Comme l illustre l histogrmme (), le chmp B 1 dns le cerveu de souris est risonnlement homogène (B 1 = 7,4 ± 0.7 µt). Cette vleur est typique des ntennes volumiques de petit dimètre utilisées pour l imgerie préclinique (Doty et l., 2007). Force est de constter que l cquisition de crtes de chmp B 1 n est ps indispensle pour notre étude. Toutefois, dns l perspective de l imgerie CEST clinique ou préclinique vec une ntenne de surfce, nous vons souhité mintenir l cquisition de crtes de B 1 en prévision d une éventuelle correction pour ces inhomogénéités de B 1 en post-processing. Une telle correction d illeurs été implémentée dns l outil d nlyse quntittive présenté dns le chpitre VII. V.4. Contrôle de l homogénéité du chmp B 0 Dns notre protocole, l intensité de sturtion est de 7 µt. Nous sommes donc confrontés à un contrste MT endogène significtif, uquel s joute un effet de sturtion directe de l eu lire. Afin de s en ffrnchir, le contrste exploité en imgerie CEST correspond à l soustrction d imges cquises vec des sturtions ppliquées à +δ st et -δ st. En présence d inhomogénéités de chmp B 0, ces deux impulsions de sturtion ne sont plus ppliquées de fçon symétrique pr rpport à l fréquence de l eu en tout point de l imge

99 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T (Bguet nd Roy, 1997; Sun et l., 2005). Pr conséquent, l soustrction des effets MT et de sturtion directe génère des rtéfcts dépendnt de l intensité de ces inhomogénéités (jusqu à 10%) dns l imge MTRsym (Sun et l., 2007). Il est donc nécessire de s ssurer d une onne homogénéité du chmp B 0 dns l orgne ou à défut de corriger pour de tels rtéfcts en postprocessing. Nous vons choisi d cquérir systémtiquement des crtes de B 0 selon l méthode WASSR (pour WAter Sturtion Shift Referencing) proposée pr l équipe de Peter vn Zijl (Kim et l., 2009). Contrirement ux techniques d cquisition conventionnelles de crtes de chmp B 0 (Mudsley et l., 1984; Tropp et l., 1989) qui ne donnent ccès qu à une mesure reltive du chmp B 0, cette technique permet d otenir une crte de chmp B 0 solue grâce à l cquisition d une imge de sturtion de l eu (Kim et l., 2009). Pour cel, un Z-spectrum est cquis vec une impulsion de sturtion de file intensité et un ps fréquentiel fin utour de l fréquence de l eu. L sturtion ppliquée est file fin de limiter utnt que possile les effets endogènes de trnsfert d imnttion. En chque pixel de l imge, le Z-spectrum est justé pr une fonction super-lorentzienne fin de déterminer l fréquence de précession des protons lires. Figure F.V.10 : Imges de sturtion directe utilisées pour l méthode WASSR et crte de chmp B 0. L fréquence de l impulsion de sturtion est indiquée en hut à guche de chque imge. Le crré rouge représente l zone dns lquelle l procédure «Mpshim» été ppliquée

100 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T Après voir homogénéisé utnt que fire se peut le chmp B 0 dns une lrge zone d intérêt (crré rouge, dimension typique : 8x8x5 mm 3 ) grâce à l procédure «Mpshim» de Bruker, l technique WASSR été utilisée pour cquérir l crte de chmp B 0. Une impulsion de sturtion de 0,1 µt été ppliquée vec un ps fréquentiel de 9 Hz de -153 à 153 Hz pour cquérir un Z-spectrum. Une série d imges de sturtion directe est présentée figure F.V.10 insi que l crte de chmp B 0 correspondnte. On constte que le chmp est risonnlement homogène dns l zone visée pr l procédure de shim. Un spectre de l eu cquis dns ce volume permet d estimer l lrgeur à mi-huteur du pic d eu à ~ 20 Hz, correspondnt plus ou moins à l distriution du chmp B 0. Au-delà de ce volume, on constte des inhomogénéités significtives, llnt de -150 Hz à +150 Hz. Ces inhomogénéités sont susceptiles de générer des rtéfcts sur les ords de nos imges CEST. C est pourquoi une correction de ces rtéfcts été implémentée dns l outil d nlyse quntittive présenté dns le chpitre VII. V.5 Protocole d imgerie CEST in vivo Grâce ux différents éléments présentés dns ce chpitre, nous vons pu mettre en plce un protocole dpté à l imgerie CEST in vivo chez l souris (voir figure F.V.11). Figure F.V.11 : Protocole d imgerie CEST in vivo. Le temps totl nécessire pr niml est d environ 3,5h. Après pose du cthéter u niveu d une des veines cudles, l souris est instllée dns l imnt. L longueur du cthéter permet notmment l injection du lipocest sns déplcement de l souris. Avnt injection du lipocest, les crtes de chmps B 0 et B 1 ont été cquises systémtiquement pour s ssurer de l homogénéité des chmps et pour l correction en post

101 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T processing des effets CEST. Toutes les imges utilisées pour le clcul des effets CEST ont été cquises vec l séquence CEST-MSME. Trois imges ntomiques de références (Imge Ref ) ont été cquises u cours du protocole notmment pour s ssurer de l stilité du signl : une première vnt l injection du lipocest et deux utres ux temps t = 0 et 42 près injection du lipocest (voir figure F.V.11, rectngles noirs). Les imges cquises vec l sturtion ppliquée à δ st = 8 ppm et δ st = -8 ppm sont désignées respectivement Imge ON et Imge OFF (voir figure F.V.11, rectngles roses et leus respectivement). Les imges CEST ont été cquises vnt (t = 0 ) et près (t = 18, 30, 42, 60, 72, 84, 96, 108 ) injection du lipocest en lternnt les fréquences de sturtion positive et négtive. L intervlle moyen entre deux imges CEST est de 13,5 min. Le temps nécessire à une expérience in vivo est d environ 3,5 h pr niml. Ce protocole été utilisé pour cquérir les données présentées dns le chpitre VI. Aucune souris n est morte u cours de ce protocole

102 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T Biliogrphie du chpitre V Bguet, E., nd C. Roy, 1997, Off-resonnce irrdition effect in stedy-stte NMR sturtion trnsfer.: J Mgn Reson, v. 128, p Delli Cstelli, D., W. Dstrù, E. Terreno, E. Cittdino, F. Minini, E. Torres, M. Spdro, nd S. Aime, 2010, In vivo MRI multicontrst kinetic nlysis of the uptke nd intrcellulr trfficking of prmgneticlly leled liposomes.: J Control Relese, v. 144, p Dixon, W. T., I. Hncu, S. J. Rtnkr, A. D. Sherry, R. E. Lenkinski, nd D. C. Alsop, 2010, A multislice grdient echo pulse sequence for CEST imging.: Mgn Reson Med, v. 63, p Doty, F., G. Entzminger, J. Kulkrni, K. Pmrthy, nd J. St, 2007, Rdio frequency coil technology for smll-niml MRI: Nmr in Biomedicine, v. 20, p Gllichn, D., J. Scholz, A. Brtsch, T. E. Behrens, M. D. Roson, nd K. L. Miller, 2010, Addressing systemtic virtion rtifct in diffusion-weighted MRI.: Hum Brin Mpp, v. 31, p Hhn, E. L., 1950, Spin Echoes, Physicl Review, vol. 80, Issue 4, pp Kim, M., J. Gillen, B. Lndmn, J. Zhou, nd P. vn Zijl, 2009, Wter Sturtion Shift Referencing (WASSR) for Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer (CEST) Experiments: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 61, p Lee, J. N., nd S. J. Riederer, 1987, The contrst-to-noise in relxtion time, synthetic, nd weighted-sum MR imges.: Mgn Reson Med, v. 5, p Liu, G., Y. Li, V. R. Sheth, nd M. D. Pgel, 2011, Imging In Vivo Extrcellulr ph with Single Prmgnetic Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer Mgnetic Resonnce Imging Contrst Agent.: Mol Imging. Mudsley, A., H. Simon, nd S. Hill, 1984, Mgnetic field mesurement y NMR imging: J Phys E Sci Instrum, v. 17, p Meioom, S., nd D. Gill, 1958, Modified spin-echo method for mesuring nucler relxtion times, Rev. Sci. Instr. 29: Mougin, O., R. Coxon, A. Pitiot, nd P. Gowlnd, 2010, Mgnetiztion trnsfer phenomenon in the humn rin t 7 T.: Neuroimge, v. 49, p Quesson, B., E. Thiudière, C. Dellnde, V. Dousset, J. F. Chteil, nd P. Cnioni, 1997, Mgnetiztion trnsfer imging in vivo of the rt rin t 4.7 T: interprettion using

103 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T inry spin-th model with superlorentzin lineshpe.: Mgn Reson Med, v. 38, p Sheth, V. R., Y. Li, L. Q. Chen, C. M. Howison, C. A. Flsk, nd M. D. Pgel, 2011, Mesuring in vivo tumor phe with CEST-FISP MRI. Mgnetic Resonnce in Medicine 2011, DOI /mrm.23038: Mgn Reson Med. Stncnello, J., E. Terreno, D. D. Cstelli, C. Cell, F. Uggeri, nd S. Aime, 2008, Development nd vlidtion of smoothing-splines-sed correction method for improving the nlysis of CEST-MR imges: Contrst Medi &mp; Moleculr Imging, v. 3, p Stollerger, R., nd P. Wch, 1996, Imging of the ctive B-1 field in vivo: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 35, p Sun, P., C. Frrr, nd A. Sorensen, 2007, Correction for rtifcts induced y B(0) nd B(1) field inhomogeneities in ph-sensitive chemicl exchnge sturtion trnsfer (CEST) imging.: Mgn Reson Med, v. 58, p Sun, P., P. vn Zijl, nd J. Zhou, 2005, Optimiztion of the irrdition power in chemicl exchnge dependent sturtion trnsfer experiments: Journl of Mgnetic Resonnce, v. 175, p Terreno, E., D. D. Cstelli, E. Violnte, H. Snders, N. Sommerdijk, nd S. Aime, 2009, Osmoticlly Shrunken LIPOCEST Agents: An Innovtive Clss of Mgnetic Resonnce Imging Contrst Medi Bsed on Chemicl Exchnge Sturtion Trnsfer: Chemistry Europen Journl, v. 15, p Terreno, E., J. Stncnello, D. Longo, D. Cstelli, L. Milone, H. Snders, M. Kok, F. Uggeri, nd S. Aime, 2009, Methods for n improved detection of the MRI-CEST effect.: Contrst Medi Mol Imging, v. 4, p Tropp, J., K. Dery, C. Hwryszko, S. Sugiur, nd H. Ymgt, 1989, Automted shimming of B0 for spectroscopic imging: J Mgn Reson, v. 85, p vn Zijl, P. C. M., C. K. Jones, J. Ren, C. R. Mlloy, nd A. D. Sherry, 2007, MR1 detection of glycogen in vivo y using chemicl exchnge sturtion trnsfer imging (glycocest): Proceedings of the Ntionl Acdemy of Sciences of the United Sttes of Americ, v. 104, p Zhou, J. Y., B. Ll, D. A. Wilson, J. Lterr, nd P. C. M. vn Zijl, 2003, Amide proton trnsfer (APT) contrst for imging of rin tumors: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 50, p

104 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T

105 CHAPITRE V - Protocole d imgerie CEST in vivo à 7T

106 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés CHAPITRE VI Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.1 Introduction VI.1. Enjeux de l imgerie moléculire de l tumeur cérérle Le cncer du système nerveux centrl est une pthologie en progression constnte en Europe vec une ugmenttion de 1% pr n sur l période 1980 à 2005 (Belot et l., 2008). En Frnce, environ 4000 nouveux cs de tumeurs cérérles mlignes sont détectés chque nnée. Ce sont l pluprt du temps (50 à 60% des cs) des gliolstomes (voir figure F.VI.1). Il s git de tumeurs extrêmement gressives dont l croissnce cellulire est rpide. Elles sont de ce fit très difficilement mîtrisles et l survie des ptients près dignostic est seulement de trois mois. Même près une intervention chirurgicle pour réséquer le gliolstome et un tritement post-opértoire (chimiothérpie et rdiothérpie), le tux de survie u gliolstome reste très file, de l ordre de 10% (Lefrnc, 2011). Figure F.VI.1 : Imge RMN pondérée T 1 d un gliolstome humin près injection d gent de contrste à se de Gdolinium. Illustrtion tirée de (Deprez, 2010)

107 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Afin de mieux prendre en chrge les ptients tteints de gliolstomes, des efforts importnts sont ctuellement rélisés pour trouver des iomrqueurs d intérêt de l pthologie. Certins iomrqueurs exprimés lors de l ngiogenèse peuvent notmment se révéler être d excellents indicteurs de l évolution des gliolstomes (Chmerlin et l., 2012). C est pourquoi l imgerie de l ngiogenèse tumorle constitue un xe de recherche dynmique en imgerie iomédicle. (McDonld nd Choyke, 2003; Schmieder et l., 2005; Winter et l., 2010). L imgerie moléculire donc potentiellement un rôle cpitl à jouer cr elle permettrit de suivre de fçon non-invsive l évolution de l pthologie, permettnt insi d évluer précisément l efficcité d un tritement nti-tumorl. VI.1. Mécnisme de l ngiogenèse tumorle Consécutivement à une muttion ou à un perturteur endocrinien, une cellule glile v se développer de fçon normle et nrchique pr division cellulire pour donner lieu à un gliolstome. Lorsqu il est encore de petite tille (< 2 mm) les ressources énergétiques du milieu environnnt sont suffisntes à s croissnce. Cependnt, u-delà de cette tille, le gliolstome esoin d un pport plus importnt en oxygène et nutriments (Folkmn, 1971). En effet, les cellules les plus nciennes de l tumeur (le cœur de l tumeur) se retrouvent progressivement en hypoxie ce qui pour conséquence de déclencher le processus d ngiogenèse tumorle. L liértion mssive de fcteurs de croissnce pro-ngiogéniques ppelés VEGF (Vsculr Endothelil Growth Fctor) (Plte et l., 1992) constitue l élément principl de ce mécnisme. Sous l effet des VEGF, des visseux snguins sont néoformés à prtir des visseux existnts. Le mécnisme de l ngiogenèse est schémtisé dns l figure F.VI.2. L orgnistion des visseux snguins néoformés pour irriguer l tumeur est très différente de celle dns les tissus sins. En effet, les cpillires se développent de fçon nrchique principlement en périphérie de l tumeur. Ceci peut être visulisé pr IRM près injection d un gent de contrste à se de Gdolinium (voir figure F.VI.1)

108 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Figure F.VI.2 : Mécnisme de l néo-ngiogenèse tumorle. Dns un premier temps, des cellules gliles mutées vont croître de fçon nrchique et incontrôlée. Lorsque le gliolstome tteint un dimètre supérieur à 2 mm, son cœur souffre d hypoxie et des fcteurs de croissnce VEGF sont liérés pour fvoriser le développement de nouveux cpillires et ssurer l pport en oxygène et nutriments. VI.1.c Détection de l ngiogenèse tumorle Lors du processus néo-ngiogénique, un grnd nomre de néovisseux sont recrutés pour irriguer l tumeur en expnsion. L lumière de ces néovisseux est constituée de cellules endothéliles surexprimnt des protéines de surfce ppelées intégrines. L une d entre elles, l intégrine α ν β 3 été identifiée comme étnt un mrqueur de l ngiogenèse (Brooks et l., 1994). Elle est donc potentiellement un on indicteur de l croissnce tumorle. Cette intégrine est constituée de deux domines trnsmemrnires, les intégrines α ν et β 3 (voir figure F.VI.3). Le tux d expression de l sous-unité α ν vrie entre 3 x 10 3 et 1,4 x 10 4 sous-unités/cellule lors que celui de l sous-unité β 3 est compris entre 5,3 x 10 2 et 1,1 x 10 4 sous-unités/cellule (Benedetto et l., 2006). L vntge de cette intégrine est qu elle est surexprimée en grnde quntité pr les cellules nouvellement formées mis ps pr les cellules mtures (Akers et l., 2010). De plus, un utre intérêt de ce iomrqueur de l ngiogenèse tumorle est son ccessiilité. En effet, l intégrine est exprimée à l surfce des visseux snguins ce qui en fit une cile vsculire. Pr conséquent, elle est ccessile vi l circultion snguine à des gents de contrste présentnt un dimètre hydrodynmique importnt (> 100 nm) (Koyshi nd Lin, 2006; Meyer et l., 2006). Pr illeurs, l ssocition des deux intégrines crée u milieu un site de

109 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés liison qui peut être reconnu de fçon spécifique pr un peptide RGD correspondnt à l séquence d cides minés rginine, glycine et cide sprtique (Smith nd Cheresh, 1990). Ce peptide une très onne ffinité vec le site de liison de l intégrine α ν β 3 (de l ordre du nnomolire (Ye et l., 2006)). Une strtégie d imgerie moléculire reltivement commune pour l détection de l ngiogenèse tumorle consiste donc à ciler l intégrine α ν β 3 à l ide d gents de contrste fonctionnlisés présentnt le peptide RGD greffé à l surfce (Schmieder et l., 2008). Figure F.VI.3 : Schém d une intégrine α ν β 3. Elle est exprimée à l surfce des cpillires néoformés lors de l ngiogenèse tumorle. Le site de liison des protéines α ν et β 3 est reconnu vec une onne ffinité pr le peptide RGD. Dns cette étude, nous vons dopté l même strtégie pour évluer l imgerie moléculire pr IRM-CEST de l néo-ngiogenèse à l ide de lipocest fonctionnlisés chez l souris U87. Nos oservtions ont pr l suite été vlidées pr des données d immunohistochimie et d imgerie de fluorescence

110 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.2 Mtériels et Méthodes VI.2. Modèle niml Les expériences de cette étude ont été menées sur des souris uxquelles des cellules mlignes de gliolstomes humins (U87MG, ATCC, Rockville, Etts-Unis) ont été implntées u niveu du noyu cudé selon un protocole conforme ux réglementtions européennes (86/609) et frnçises (87/848). Les cellules U87MG ont été cultivées dns un milieu clssique pour l culture cellulire (milieu Egle modifié de Dulecco vec 10% de sérum de veu fœtl, 1% de glutmine et 1% de gentmicine). Les tumeurs ont ensuite été induites pr injection de 1,2 x 10 5 cellules directement dns le prenchyme cérérle des souris. Nous vons utilisé des souris immunodéprimées (nude NU/NU, Jnvier, Frnce) fin de fvoriser l croissnce tumorle. Une imge ntomique de référence permet de visuliser clirement l tumeur (voir figure F.VI.4). Figure F.VI.4 : Imge ntomique de référence d une souris vec un gliolstome U87. L tumeur cérérle est délimitée pr les flèches lnches. Le dimètre typique des tumeurs étit compris entre 2 et 5 mm. L imge été cquise vec l séquence MSME présentée dns le chpitre V. Le modèle de tumeur U87 est courmment utilisé pour l évlution d gents de contrste fonctionnlisés vec un peptide RGD (Kiessling et l., 2009; Li et l., 2011)

111 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Cependnt, ce modèle est reltivement peu documenté et il y peu d informtions sur l croissnce des tumeurs, sur le potentiel ngiogénique de ces gliolstomes ou encore sur le tux d expression de l intégrine α ν β 3. Certins rticles mentionnent simplement un volume tumorl minimum d environ 30 mm 3 (dimètre > 2 mm) à prtir duquel l ngiogenèse tumorle est déclenchée (Khemtong et l., 2009; Morwski et l., 2004; Schmieder et l., 2005). Pour notre étude, cette tille critique étit tteinte u out de 2 semines environ insi que l illustre l figure F.VI.5. On voit que l tumeur commence à se développer environ 7 jours près l implnttion des cellules U87MG puis croît de fçon linéire les 3 semines suivntes. Dns cette étude, les dimètres des tumeurs étient compris entre 2 et 5 mm. Il étit donc risonnle de penser que le processus ngiogénique étit enclenché pour l ensemle des souris. Figure F.VI.5 : Evolution de l tille de l tumeur en fonction du nomre de jours près implnttion. A postériori, nous vons compilé les dimètres moyens des tumeurs oservées à l occsion d exmens IRM de contrôle sur l ensemle des souris utilisées

112 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.2. Protocole d imgerie Vingt-qutre souris implntées vec une tumeur cérérle U87 ont été utilisées. Elles ont été létoirement réprties en deux groupes de 12 souris ; un groupe injecté vec le lipocest fonctionnlisé (RGD-lipoCEST) et un groupe injecté vec le lipocest sns peptide RGD (Ctrl-lipoCEST). Un cthéter été posé dns une des veines cudles pour pouvoir dministrer l gent de contrste pr voie intrveineuse (IV) sns sortir l niml de l imnt. Un olus de 200 µl d gent de contrste est injecté en 1 minute ce qui correspond à une dose en nnoprticules de 0,32 nmol/kg ou 87 µmol/kg de complexes de Tm(III). Le protocole d imgerie est détillé dns le chpitre V (voir figure F.V.11). Pr illeurs, à l occsion d une expérience préliminire, un Z-spectrum in vivo été cquis dns un cerveu de souris fin d estimer l contriution endogène du contrste MT et APT. VI.2.c Anlyse pr région d intérêt du contrste CEST L effet MTRsym est clculé pour chcune des souris des deux groupes (RGD- et CtrllipoCEST) et dns deux ROI : l «tumeur» et l zone «controltérle». Les ROI ont été trcées mnuellement sur les imges ntomiques de référence en évitnt les ords du cerveu. Les ROI leue et rouge délimitent respectivement l tumeur et l zone controltérle (voir figure F.VI.6). Afin de ne ps introduire un iis entre les deux groupes (tumeur et controltérle), nous vons, dns l mesure du possile, trcé des ROI inclunt un nomre comprle de pixels. En conséquence, nous comprons les contrstes CEST moyens dns chcune de ces zones entre chque groupe. Nous vons donc 4 sous-groupes correspondnt à : RGD-lipoCEST dns l tumeur RGD-lipoCEST dns l zone controltérle Ctrl-lipoCEST dns l tumeur Ctrl-lipoCEST dns l zone controltérle. Dns les grphes présentés dns ce chpitre, les rres d erreur correspondent à l vriilité inter-individuelle. L significtivité sttistique (p-vlue) des différences de contrste CEST entre chcun des groupes été évluée à l ide d un test de Student non-pprié. Le seuil de significtivité été fixé à p 0,

113 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Figure F.VI.6 : Délimittion mnuelle des ROI. L tille typique des ROI étit d environ 500 pixels. VI.2.d Histologie et microscopie de fluorescence Afin de vlider les résultts otenus pr IRM-CEST, nous vons prélevé le cerveu de deux souris de chcun des groupes (RGD- et Ctrl-lipoCEST) pour les nlyser pr histologie. Deux méthodes de scrifice de l niml ont été comprées. Dns un cs, les souris ont été scrifiées pr perfusion intrcrdique vec une solution de prformldehyde (PFA) à 4% fin de rincer tout le sng présent dns le cerveu (condition «perfusée»). Dns l utre cs, les nimux ont été scrifiés pr ponction intrcrdique pour enlever une mjorité de sng circulnt mis sns rincer le sng présent dns les petits cpillires (condition «non-perfusée»). Après des ins successifs dns des solutions de PFA pour fixer les tissus et dns des solutions de sucrose pour cryoprotéger les tissus, les cerveux ont été coupés vec une épisseur de coupe de 20 µm à l ide d un microtome. Les coupes ont ensuite été mrquées vec un nticorps primire reconnissnt α ν β 3 et un nticorps secondire couplé u fluorochrome FITC pour voir l expression de l cile pr microscopie de fluorescence (λ excittion = 495 nm et λ emission = 517 nm). Les lipocest sont visulisés directement pr fluorescence grâce à l rhodmine incorporée dns leur memrne (λ excittion = 557 nm et λ emission = 571 nm). L loclistion de l

114 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés tumeur sur les coupes histologiques été rélisée grâce à un mrquge hémtoxyline et érythrosine qui colore les protéines du cytoplsme et les noyux cellulires. VI.3 Résultts VI.3. Crctéristion des lipocest et du contrste MT Les RGD- et Ctrl-lipoCEST ont été crctérisés u chpitre IV et les prmètres de sturtion optimux ont été déterminés à l ide de leur Z-spectrum 2D (δ st.opt = 8 ppm nd B 1opt = 7 µt, voir figure F.IV.5). Afin d estimer le contrste MT endogène, un Z-spectrum été cquis in vivo dns le cerveu de souris (voir figure F.VI.7). Dns des conditions de sturtion optimles pour les lipocest, l effet MT est lrge et symétrique (ON : 71,74 ± 0,25% ; OFF : 71,64 ± 0,31%), ce qui implique un effet MTRsym reltivement petit (0,10 ± 0,31%). Figure F.VI.7 : Z-spectr in vivo cquis dns un cerveu de souris. L effet MTRsym est de 0,10 ± 0,31% vec des conditions de sturtion δ st = 8 ppm et B 1 = 7 µt

115 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.3. Détection in vivo des lipocest Dns un premier temps, nous vons évlué le contrste endogène dns le cerveu de toutes les souris. Pour cel, nous vons clculé l effet MTRsym sur tous les pixels présents dns le cerveu de toutes les souris utilisées (correspondnt à 1,7 x 10 6 pixels). Le MTRsym moyen étit lors de 0,1 ± 0,4%, ce qui est en ccord vec l effet MTRsym déterminé sur le Z- spectrum. Afin de mieux visuliser le contrste CEST provennt des lipocest, nous vons déterminé un seuil à prtir de l moyenne et de l écrt type de l effet MT (0,1 + 0,4 = 0,5%). Ce seuil été ppliqué ux imges CEST présentées dns ce chpitre. L figure F.VI.8 présente deux séries d imges CEST correspondnt à l injection du RGD- ou Ctrl-lipoCEST. Pour les deux lipocest, les imges démontrent une prise de contrste dns tout le cerveu. On remrque églement que les pixels les plus intenses sont situés à l périphérie de l tumeur. On peut noter que le contrste CEST diminue glolement u cours du temps dns le cs de l injection du Ctrl-lipoCEST (voir figure F.VI.8.). En revnche, il semle que le signl persiste dns l tumeur près injection du RGD-lipoCEST (voir figure F.VI.8.). Bien que des études précédentes ient étli l possiilité de détecter des lipocest in vivo (Terreno et l., 2008), ce résultt constitue l première visulistion d un lipocest in vivo à l suite d une injection IV (Flment et l., 2012)

116 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Figure F.VI.8 : Visulistion in vivo des lipocest. Deux souris U87 ont été injectées vec le RGD-lipoCEST () ou le Ctrl-lipoCEST (). Les imges CEST ont été cquises vnt (0 ) et pendnt 2 heures près injection vec un intervlle temporel de 13,5 min. Les zones tumeur et controltérle sont délimitées pr les ROI leue et rouge respectivement. VI.3.c Sensiilité et persistnce du contrste CEST Du fit des inhomogénéités importntes consttées sur les imges CEST à trvers les deux cohortes, il nous est difficile d étlir ce résultt pour chque série de données CEST individuelle. Aussi, pour contourner cette limittion de sensiilité, nous vons opté pour une nlyse de groupe de nos résultts. Les vleurs de MTRsym moyennes clculées dns chque

117 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés ROI ont donc été moyennées à leur tour pour chque cohorte (n = 12). L figure F.VI.9 montre les décours temporels du MTRsym moyen pour chcun des sous-groupes. Figure F.VI.9 : Décours temporels du contrste CEST. L vleur moyenne de l effet MTRsym été clculée pour chque ps temporel et pour chque sous-groupe (n = 12). Un stérisque indique l significtivité sttistique (p 0,01) entre l condition RGD-lipoCEST dns l tumeur et chcune des trois utres conditions. De l oservtion de ces coures, on constte que : les effets MTRsym moyens clculés dns les ROI «tumeur» (points gris) et «controltérle» (losnges gris) près injection de Ctrl-lipoCEST et dns l ROI «controltérle» (losnges noirs) près injection de RGD-lipoCEST sont similires, l effet MTRsym moyen clculé dns l tumeur près injection de RGDlipoCEST (points noirs) est supérieur ux utres conditions. En effet, dns les trois premières conditions, le contrste CEST croît jusqu à un mximum de 0,95 ± 0,35% pendnt l première heure puis décroît pour tteindre une vleur

118 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés moyenne de 0,24 ± 0,15% près 108 minutes. A contrrio, vec le RGD-lipoCEST, le contrste dns l tumeur se stilise utour de 1,4% près l première heure. En dépit des vritions interindividuelles (les écrts-types vrint de 0,15% à 0,38%), l ppliction d un test de Student permet de confirmer que le contrste dns l tumeur près injection de RGD-lipoCEST est sttistiquement différent des utres conditions une heure près injection. Le tleu T.VI.1 résume les vleurs de significtivité sttistique clculées pour chque ps temporel entre les effets MTRsym dns l tumeur vec le RGD-lipoCEST et les trois utres conditions. Tleu T.VI.1 : P-vlues clculées à l ide d un test de Student. Pour chque ps temporel, les effets MTRsym clculés dns l tumeur vec le RGD-lipoCEST ont été comprés vec les trois utres conditions. Bien que l exmen des décours temporels moyens permette d étlir l prise de contrste prticulière du RGD-lipoCEST u niveu de l tumeur, cel ne suffit ps à discriminer les trois utres conditions. C est pourquoi les effets MTRsym ont été moyennés pour l 1 ère et l 2 ème heure post-injection. Comme l indique l figure F.VI.10., les tests sttistiques entre les trois conditions contrôle ne révèlent ucune différence significtive, même près moyenne (pvlues u minimum de 0,19). En revnche, cette moyenne temporelle permet notmment de confirmer l significtivité de l prise de contrste CEST dns l tumeur vec le RGDlipoCEST pendnt l 1 ère heure (p < 0,05). Cette moyenne temporelle églement été effectuée sur les imges présentées figure F.VI.8. Désormis, l persistnce du contrste CEST dns l tumeur vec le RGD-lipoCEST est plus évidente, notmment pour l 2 ème heure (voir figure F.VI.10.)

119 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Figure F.VI.10 : Persistnce du contrste CEST. Les effets MTRsym cquis pendnt l première (T < 60 min) et l deuxième (T > 60 min) heure ont été moyennés pour chcun des 4 sous-groupes (). L même opértion été ppliquée ux imges présentées sur l figure F.VI.8 ()

120 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.3.d Vlidtion histologique Afin de vlider les oservtions fites pr IRM-CEST, les imges de fluorescence ont été cquises dns une zone à chevl entre l tumeur et les tissus sins, mtérilisée pr le crré noir (figure F.VI.11, 1 ère colonne). Comme l indiquent les imges de mrquge de l intégrine α ν β 3 (figure F.VI.11, 2 ème colonne), il y une onne expression de l cile pour chcune des souris utilisées pour l vlidtion histologique. On remrque que l expression de α ν β 3 est plus intense à l périphérie de l tumeur, là où l densité de néovisseux est l plus importnte. Pr illeurs, on remrque des formes en ellipse correspondnt à des sections de visseux snguins (figure F.VI.11, 2 ème colonne, encrt lnc). Ceci confirme que l intégrine endothélile est surexprimée et qu elle est ccessile pour notre gent lipocest. L exmen des imges de rhodmine (figure F.VI.11, 3 ème colonne) chez les souris «non-perfusées» révèle l présence des lipocest dns le cerveu (figure F.VI.11, 1 ère et 3 ème lignes). Pr illeurs, l correspondnce des imges d immunohistochimie et de rhodmine (figure F.VI.11, 4 ème colonne) permet d pprécier l loclistion des lipocest mjoritirement à l intérieur des visseux (figure F.VI.11, 4 ème colonne, encrt lnc). En revnche, il n y plus de signl rhodmine visile dns le cerveu perfusé ynt reçu le Ctrl-lipoCEST (figure F.VI.11, 2 ème ligne). A contrrio, le signl rhodmine persiste, même près perfusion, dns le cs du cerveu ynt reçu le RGD-lipoCEST (figure F.VI.11, 4 ème ligne). Enfin, l superposition des deux imges de mrquge immunohistochimique et de rhodmine permet d pprécier l coloclistion du RGD-lipoCEST et de s cile α ν β 3 (figure F.VI.11, 4 ème ligne, 4 ème colonne). Cette oservtion constitue un rgument fort en fveur d une ssocition spécifique du RGDlipoCEST vec l intégrine α ν β

121 Figure F.VI.11 : Coloclistion du RGD-lipoCEST vec l cile α ν β 3 dns l tumeur. Après cquisition des imges CEST, qutre souris ont été scrifiées soit pr ponction intrcrdique («non-perfusée»), soit pr perfusion vec du PFA 4% («perfusée»). Le cerveu été prélevé et coupé pour visuliser l tumeur (mrquge hémtoxyline et érythrosine, 1 ère colonne). Les récepteurs α ν β 3 sont visulisés grâce à un mrquge immunohistochimique et un nticorps secondire couplé u FITC (fluorescence verte, 2 ème colonne). Les lipocest sont directement visulisés grâce à l rhodmine incorporée dns leur memrne (fluorescence rouge, 3 ème colonne). L superposition des deux imges montre une onne coloclistion du RGD-lipoCEST vec l intégrine α ν β 3 (4 ème colonne). Pour chque cerveu, un zoom sur un visseu est montré dns l encrt lnc.

122 VI.4 Discussion VI.4. Tille des tumeurs U87 L exmen des MTRsym nous permet d identifier une reltion entre les plus petites vleurs de contrste CEST et les plus petites tumeurs consttées à trvers les deux cohortes. En effet, 4 nimux dont les dimètres moyens des tumeurs étient compris entre 2,0 et 2,2 mm présentient les effets MTRsym les plus files. Ceci n est ps étonnnt cr l ngiogenèse est un phénomène qui se mnifeste à un stde vncé du développement tumorl (Schmieder et l., 2008). Toutefois, cette vriilité de tille de tumeurs est ojectivement l même entre les deux cohortes. En effet, le dimètre moyen des tumeurs à trvers chque cohorte étit de 3,7 ± 1,1 mm pour le groupe RGD-lipoCEST et de 4,0 ± 1,0 mm pour le groupe Ctrl-lipoCEST. Il est donc peu prole que les différences de MTRsym consttées entre les 2 groupes soient imputles u modèle en lui-même. VI.4. Significtivité sttistique des contrstes CEST oservés Nous venons de voir que mlgré des imges CEST reltivement ruitées et des effets MTRsym vriles u sein des cohortes, une nlyse de groupe permet de mettre en évidence des différences sttistiques entre les effets CEST provennt des RGD- et Ctrl-lipoCEST dns l tumeur à prtir d une heure post-injection. Cependnt, on peut se demnder si l effet MTRsym mesuré à l intérieur de chque ROI provient ien d un «vri» effet CEST. Dns une puliction prue en 2009 (Liu et l., 2009), les uteurs ont défini un seuil u-delà duquel l significtivité sttistique du contrste CEST mesuré dns une ROI est démontrée. Ce seuil repose sur le clcul du CNR entre les imges CEST pré- et post-injection. Ce CNR est défini insi : E40 CNR contrste / 2.SD. post pre Le terme contrste post-pre correspond à l différence de signl entre les imges CEST pré- et post-injection dns l ROI. Le ruit est estimé en multiplint l écrt-type (SD) mesuré dns une ROI dns l ir pr 2 (Hcke et l., 1999). En considérnt une distriution gussienne du

123 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés ruit, Liu et collorteurs ont démontré que le CNR devit être supérieur à 2 2 pour voir une proilité de 95% d oserver un contrste CEST entre les imges pré-injection et postinjection. Figure F.VI.12 : Significtivité sttistique en fonction du CNR. Les CNR mximums clculés dns l tumeur pour chque cohorte sont de 2,2 et 1,3 pour le RGD- et Ctrl-lipoCEST respectivement. Cel correspond à des proilités d oservtion d un effet CEST de 90% et 65% respectivement. Dns notre cs, les vleurs mximles de CNR otenues près moyenne sur l ensemle de chque cohorte (n = 12) étient de 2,2 vec le RGD-lipoCEST (voir figure F.VI.12, ligne rouge) et 1,3 vec le Ctrl-lipoCEST (voir figure F.VI.12, ligne leue). Ces vleurs de CNR correspondent donc respectivement à des proilités de 90% et 65% que le contrste soit dû à l présence de lipocest. L significtivité sttistique de visuliser un contrste dû u CtrllipoCEST dns le cerveu est reltivement file. Ceci prît logique cr le Ctrl-lipoCEST injecté pr voie IV se distriue dns l circultion snguine et se retrouve trop dilué pour être visulisé dns le cerveu. A contrrio, le RGD-lipoCEST qui une ffinité prticulière pour les récepteurs α ν β 3 surexprimés u niveu de l tumeur, se concentre dns l zone tumorle. Pr conséquent, ceci permet de détecter un effet CEST vec une significtivité stisfisnte

124 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés VI.4.c Justifiction du contrste CEST Les résultts CEST présentés précédemment ttestient d un contrste CEST dns l tumeur vec le RGD-lipoCEST significtivement différent des trois utres conditions. De plus, l expérience d immunohistochimie nous permis de nous ssurer de l vlidité de notre modèle tumorl cr les qutre souris testées exprimient ien l intégrine α ν β 3, notmment à l surfce des visseux en périphérie de l tumeur (Akers et l., 2010; Eliceiri nd Cheresh, 2000; Schmieder et l., 2005). Cette expérience nous ussi permis de montrer qu près perfusion, seul le signl provennt du RGD-lipoCEST persiste et coloclise vec le signl α ν β 3. Tous ces résultts rgumentent donc en fveur d une ssocition spécifique entre le RGD-lipoCEST et s cile α ν β 3. Pour utnt, cette ssocition ne justifie ps le contrste CEST oservé dns les 3 utres conditions. Ainsi, une prtie non négligele du contrste CEST oservé correspond à une ccumultion non spécifique des lipocest dns les cpillires. En effet, étnt donné que l imgerie CEST est peu sensile ux gents circulnt rpidement, les lipocest qui sont dns les gros visseux snguins et les rtères contriuent peu u contrste CEST. Comme le montrent les imges de microscopie électronique tirées de l rticle de McDonld et collorteurs (McDonld nd Choyke, 2003), les tissus tumorux (voir figure F.VI.13.) ont une vsculristion eucoup plus dense et nrchique que celle des tissus sins (voir figure F.VI.13.). Figure F.VI.13 : Vsculristion des tissus tumorux et sins. Les imges de microscopie électronique montrent l différence de vsculristion en les tissus tumorux () et sins () dns un modèle souris de tumeur cérérle. Les imges sont tirées de (McDonld nd Choyke, 2003)

125 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Ainsi, l proilité que les lipocest stgnent u niveu de l tumeur est donc plus importnte que dns les tissus sins. De plus, les lipocest peuvent églement s ccumuler de fçon non spécifique dns l tumeur à cuse de l effet de rétention et de perméilité (Bn nd Seymour, 1998; Seymour, 1992). Ces deux phénomènes permettent lors d expliquer que l effet MTRsym soit légèrement supérieur dns l tumeur que dns l zone controltérle vec le Ctrl-lipoCEST. VI.4.d Avntges et limittions des lipocest Des études ont déjà montré qu il étit possile de visuliser des prcest in vivo, même près une injection IV (Ali et l., 2009; Ci et l., 2011; Jones et l., 2010; Li et l., 2011; Liu et l., 2009). Cependnt, pour otenir une sensiilité de détection suffisnte, l pluprt des études sont menées vec des prmètres de sturtion optimux pour l détection des prcest. Etnt donné que ces complexes prmgnétiques ont un tux d échnge reltivement rpide, ils nécessitent l utilistion d impulsions de sturtion intenses (jusqu à 30 µt). Une telle sturtion peut engendrer un dépôt d énergie importnt et donc un échuffement des tissus. Pr conséquent, le recours à de telles impulsions de sturtion constitue sns doute une limittion à l utilistion des prcest pour l IRM-CEST clinique. Un des vntges des lipocest réside dns l présence d une icouche lipidique qui rlentit les échnges de protons. En conséquence, les lipocest nécessitent des conditions de sturtions plus modestes (voir l éqution E34). En termes de sensiilité de détection églement, les lipocest présentent un net vntge pr rpport ux prcest. En effet, l équipe de Silvio Aime montré qu il étit possile d tteindre une limite de détection de 90 pm in vitro vec des lipocest (Aime et l., 2005). In vivo, cette limite est plus modeste (nous l estimons à 1 nm) en rison des effets de trnsfert d imnttion endogènes et des inhomogénéités de chmps B 0 et B 1. Cependnt dns le cs des prcest, cette limite de détection est environ 10 5 fois plus sse (Wu et l., 2008). Les lipocest sont donc des gents CEST compétitifs pr rpport ux prcest, et ojectivement de meilleurs cndidts pour l imgerie moléculire pr IRM-CEST. En termes de toxicité, on peut comprer l toxicité des lipocest et notmment des complexes encpsulés à celle de complexes prmgnétiques de Gdolinium. Dns l mesure où l stilité thermodynmique des complexes de Tm(III) est comprle à celle des complexes de Gd(III) et que l toxicité du Tm(III) est similire ux utres Lnthnides (Hutcheson et l., 1975), on peut espérer une file toxicité des gents lipocest à dose équivlente. C est le cs

126 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés pour notre étude puisque l dose de complexes de Tm(III) injectée étit en moyenne de 87 µmol/kg, ce qui est inférieur à l dose mximle de 100 µmol/kg recommndée pour l injection clinique des gents de contrste à se de Gdolinium. Comme nous l vons déjà illustré dns le chpitre IV, ien que les RGD- et CtrllipoCEST soient identiques (u peptide RGD près), leurs Z-spectr sont légèrement différents. Cette différence pourrit être liée à l incorportion de peptide RGD dns l memrne. Une modifiction du tux d échnge trnsmemrnire pourrit lors en découler. Toutefois, à notre connissnce, un tel effet n été rpporté pr ucune équipe trvillnt sur l fonctionnlistion d gents liposomux. L hypothèse que nous retenons pour expliquer cette différence concerne l synthèse reltivement complexe des lipocest. En effet, des vritions sutiles sur l concentrtion en complexes de Tm(III) internlisés ou sur l distriution en tille des liposomes pourrient se mnifester pr une modultion du déplcement chimique des molécules d eu internes u lipocest insi que de l effet MTRsym mximl. VI.5 Conclusion Grâce à l collortion vec notre prtenire industriel Gueret, nous vons pu mettre u point un lipocest comptile vec une utilistion in vivo. Les résultts présentés dns ce chpitre constituent à notre connissnce, l première visulistion d un lipocest in vivo dns un cerveu de souris consécutivement à une injection IV (Flment et l., 2012). De plus, grâce à l fonctionnlistion d un lipocest pr greffge d un peptide RGD à s surfce, nous vons pu pporter une première preuve de concept de l détection pr IRM-CEST de l intégrine α ν β 3 impliquée dns le processus de l ngiogenèse tumorle. En effet, des différences significtives ont été oservées entre l zone tumorle vec le RGD-lipoCEST et l zone controltérle vec le même lipocest insi qu vec le Ctrl-lipoCEST. Ces oservtions ont été confortées pr des résultts d immunohistochimie et de microcopie de fluorescence. L ensemle tend à démontrer une ssocition spécifique du RGD-lipoCEST vec l intégrine α ν β

127 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Biliogrphie du chpitre VI Aime, S., D. D. Cstelli, nd E. Terreno, 2005, Highly sensitive MRI chemicl exchnge sturtion trnsfer gents using liposomes: Angewndte Chemie-Interntionl Edition, v. 44, p Akers, W., Z. Zhng, M. Berezin, Y. Ye, A. Agee, K. Guo, R. Fuhrhop, S. Wickline, G. Lnz, nd S. Achilefu, 2010, Trgeting of lph(v)et(3)-integrins expressed on tumor tissue nd neovsculture using fluorescent smll molecules nd nnoprticles: Nnomedicine, v. 5, p Ali, M. M., G. Liu, T. Shh, C. A. Flsk, nd M. D. Pgel, 2009, Using two chemicl exchnge sturtion trnsfer mgnetic resonnce imging contrst gents for moleculr imging studies.: Acc Chem Res, v. 42, p Bn, D. F., nd L. W. Seymour, 1998, Control of tumour vsculr permeility.: Adv Drug Deliv Rev, v. 34, p Belot, A., P. Grosclude, N. Bossrd, E. Jougl, E. Benhmou, P. Delfosse, A. V. Guizrd, F. Molinié, A. Dnzon, S. Br, A. M. Bouvier, B. Trétrre, F. Binder-Foucrd, M. Colonn, L. Duisse, G. Hédelin, G. Lunoy, N. Le Stng, M. Myndié, A. Monnereu, X. Troussrd, J. Fivre, A. Collignon, I. Jnory, P. Arveux, A. Buemi, N. Rverdy, C. Schvrtz, M. Bovet, L. Chérié-Chlline, J. Estève, L. Remontet, nd M. Velten, 2008, Cncer incidence nd mortlity in Frnce over the period : Rev Epidemiol Snte Pulique, v. 56, p Benedetto, S., R. Pulito, S. G. Crich, G. Trone, S. Aime, L. Silengo, nd J. Hmm, 2006, Quntifiction of the expression level of integrin receptor lph(v)et3 in cell lines nd MR imging with ntiody-coted iron oxide prticles.: Mgn Reson Med, v. 56, p Brooks, P. C., R. A. Clrk, nd D. A. Cheresh, 1994, Requirement of vsculr integrin lph v et 3 for ngiogenesis.: Science, v. 264, p Ci, K., G. E. Kiefer, S. D. Cruthers, S. A. Wickline, G. M. Lnz, nd P. M. Winter, 2011, Quntifiction of wter exchnge kinetics for trgeted PARACEST perfluorocron nnoprticles.: NMR Biomed. Chmerlin, M. C., T. Cloughsey, D. A. Rerdon, nd P. Y. Wen, 2012, A novel tretment for gliolstom: integrin inhiition.: Expert Rev Neurother, v. 12, p

128 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Deprez, M., 2010, Eliceiri, B., nd D. Cheresh, 2000, Role of lph nu integrins during ngiogenesis: Cncer Journl, v. 6, p. S245-S249. Flment, J., F. Geffroy, C. Medin, C. Roic, J. F. Myer, S. Mériux, J. Vlette, P. Roert, M. Port, D. Le Bihn, F. Lethimonnier, nd F. Boumezeur, 2012, In vivo CEST MR imging of U87 mice rin tumor ngiogenesis using trgeted LipoCEST contrst gent t 7 T.: Mgn Reson Med. Folkmn, J., 1971, Tumor ngiogenesis: therpeutic implictions.: N Engl J Med, v. 285, p Hcke, E., R. Brown, M. Thompson, nd R. Venkteson, 1999, Mgnetic resonnce imging: physicl principles nd sequence design: New York, p 349. Hutcheson, D. P., D. H. Gry, B. Venugopl, nd T. D. Luckey, 1975, Studies of nutritionl sfety of some hevy metls in mice.: J Nutr, v. 105, p Jones, C., A. Li, M. Suchy, R. Hudson, R. Menon, nd R. Brth, 2010, In Vivo Detection of PARACEST Agents With Relxtion Correction: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 63, p Khemtong, C., C. Kessinger, J. Ren, E. Bey, S. Yng, J. Guthi, D. Boothmn, A. Sherry, nd J. Go, 2009, In vivo Off-Resonnce Sturtion Mgnetic Resonnce Imging of lph(v)et(3)-trgeted Superprmgnetic Nnoprticles: Cncer Reserch, v. 69, p Kiessling, F., J. Huppert, C. Zhng, J. Jypul, S. Zwick, E. Woenne, M. Mueller, H. Zentgrf, M. Eisenhut, Y. Adddi, M. Neemn, nd W. Semmler, 2009, RGD-leled USPIO Inhiits Adhesion nd Endocytotic Activity of lph(v)et(3)-integrin-expressing Gliom Cells nd Only Accumultes in the Vsculr Tumor Comprtment: Rdiology, v. 253, p Koyshi, H., nd P. C. Lin, 2006, Nnotechnology for ntingiogenic cncer therpy.: Nnomedicine (Lond), v. 1, p Lefrnc, F., 2011, Tritement des gliolstomes en Li, A., M. Suchy, C. Li, J. Gti, S. Mekin, R. Hudson, R. Menon, nd R. Brth, 2011, In Vivo Detection of MRI-PARACEST Agents in Mouse Brin Tumors t 9.4 T: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 66, p Liu, G., M. M. Ali, B. Yoo, M. A. Griswold, J. A. Tkch, nd M. D. Pgel, 2009, PARACEST MRI with improved temporl resolution.: Mgn Reson Med, v. 61, p

129 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés McDonld, D. M., nd P. L. Choyke, 2003, Imging of ngiogenesis: from microscope to clinic.: Nt Med, v. 9, p Meyer, A., J. Auernheimer, A. Modlinger, nd H. Kessler, 2006, Trgeting RGD recognizing integrins: drug development, iomteril reserch, tumor imging nd trgeting.: Curr Phrm Des, v. 12, p Morwski, A., P. Winter, X. Yu, R. Fuhrhop, M. Scott, F. Hockett, J. Roertson, P. Gffney, G. Lnz, nd S. Wickline, 2004, Quntittive "mgnetic resonnce immunohistochemistry" with lignd-trgeted F-19 nnoprticles: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 52, p Plte, K. H., G. Breier, H. A. Weich, nd W. Risu, 1992, Vsculr endothelil growth fctor is potentil tumour ngiogenesis fctor in humn glioms in vivo.: Nture, v. 359, p Schmieder, A., S. Cruthers, H. Zhng, T. Willims, J. Roertson, S. Wickline, nd G. Lnz, 2008, Three-dimensionl MR mpping of ngiogenesis with lph(5)et(1)(lph(v)et(3))-trgeted thernostic nnoprticles in the MDA-MB- 435 xenogrft mouse model: Fse Journl, v. 22, p Schmieder, A., P. Winter, S. Cruthers, T. Hrris, T. Willims, J. Allen, E. Lcy, H. Zhng, M. Scott, G. Hu, J. Roertson, S. Wickline, nd G. Lnz, 2005, Moleculr MR imging of melnom ngiogenesis with lph(nu)et(3)-trgeted prmgnetic nnoprticles: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 53, p Seymour, L. W., 1992, Pssive tumor trgeting of solule mcromolecules nd drug conjugtes.: Crit Rev Ther Drug Crrier Syst, v. 9, p Smith, J. W., nd D. A. Cheresh, 1990, Integrin (lph v et 3)-lignd interction. Identifiction of heterodimeric RGD inding site on the vitronectin receptor.: J Biol Chem, v. 265, p Terreno, E., D. D. Cstelli, L. Milone, S. Rollet, J. Stncnello, E. Violnte, nd S. Aime, 2008, First ex-vivo MRI co-locliztion of two LIPOCEST gents: Contrst Medi nd mp; Moleculr Imging, v. 3, p Winter, P., S. Cruthers, J. Allen, K. Ci, T. Willims, G. Lnz, nd S. Wickline, 2010, Moleculr Imging of Angiogenic Therpy in Peripherl Vsculr Disese With lph(v)et(3)-integrin-trgeted Nnoprticles: Mgnetic Resonnce in Medicine, v. 64, p

130 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés Ye, Y., S. Bloch, B. Xu, nd S. Achilefu, 2006, Design, synthesis, nd evlution of ner infrred fluorescent multimeric RGD peptides for trgeting tumors.: J Med Chem, v. 49, p

131 CHAPITRE VI - Imgerie CEST de l ngiogenèse tumorle dns un modèle rongeur de tumeur cérérle U87 à l ide de lipocest fonctionnlisés

132 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo CHAPITRE VII Semi-quntifiction des lipocest in vivo L finlité de l imgerie moléculire est l quntifiction d une cile ou d un processus iologique in vivo. Mlheureusement, cette informtion ne peut que rrement être extrite directement des imges que ce soit en imgerie optique, en imgerie nucléire ou en IRM. Il est toutefois possile de remonter à l informtion iologique vi une chîne de tritements des données d imgerie moléculire qui peut schémtiquement se décomposer en deux étpes (voir figure F.II.1). Tout d ord une modélistion physico-chimique permet de lier une intensité de signl ou de contrste à une quntité d gent d imgerie. Ensuite, une modélistion comprtimentle permet d estimer à prtir des vritions temporelles de concentrtion en gent d imgerie l concentrtion de l cile iologique ou un flux d intérêt. Comme toute modélistion, chcune de ces étpes ne peut espérer être plus qu une pproximtion svnte de l rélité. Nénmoins, cette démrche demeure nécessire à l mturtion d une pproche d imgerie moléculire. Dns le chpitre précédent, nous vons démontré l possiilité de détecter in vivo un lipocest injecté pr voie intrveineuse dns un modèle souris de tumeur cérérle. Nous vons églement montré que le lipocest fonctionnlisé s ssociit préférentiellement vec s cile, l intégrine α ν β 3, surexprimée lors de l ngiogenèse tumorle. Au cours de ce chpitre, nous nous enggeons sur le chemin restnt à prcourir pour fire de l imgerie des gents lipocest fonctionnlisés une modlité d imgerie moléculire à prt entière. Pour cel, nous proposons un outil d nlyse quntittive permettnt d estimer l concentrtion de nos gents lipocest in vivo. Cet outil repose sur l modélistion des processus d échnge de protons in vivo. Les effets CEST endogènes sont pris en compte fin de déterminer l contriution spécifique des lipocest u contrste et insi en déduire leur concentrtion. Dns un premier temps, cet outil été vlidé in vitro. Puis, nous vons nlysé les données CEST présentées dns le chpitre VI fin d estimer l quntité de lipocest spécifiquement liés à l intégrine α ν β

133 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo VII.1 Modélistion des échnges de protons in vivo en présence d gents CEST VII.1. Modèle à 4 comprtiments Il déjà été montré que les échnges entre deux groupes de protons à l origine du contrste MT endogène, à svoir les protons de l eu lire (protons A) et les protons liés ux mcromolécules (protons B), peuvent être décrits pr un modèle à 2 comprtiments (Edzes nd Smulski, 1977; Grd et l., 1991; Morrison nd Henkelmn, 1995). Ce modèle est décrit pr les équtions de Bloch-McConnell présentées dns le chpitre III (McConnell, 1958; Woessner, 1961; Woessner et l., 2005). Cependnt, ce modèle ne permet ps de décrire tous les échnges de protons in vivo, notmment ceux reltifs ux protons mides à l origine du contrste APT (Goffeney et l., 2001). Pr conséquent, un troisième groupe de protons (protons C) été jouté u modèle pour décrire le contrste APT. Bien qu il existe une grnde vriété de protons NH in vivo, ce groupe peut être modélisé comme un ensemle de protons équivlents de fréquence de précession moyenne à -3,5 ppm de l eu lire (Zhou et l., 2004). Enfin, l ojectif de notre modélistion étnt l quntifiction des lipocest, nous vons jouté un 4 ème groupe de protons, les protons D. Ces protons correspondent ux protons déplcés fréquentiellement pr les lipocest. Le modèle utilisé dns ce chpitre est donc un modèle à 4 comprtiments qui est très similire à celui développé pr l équipe de Roert Brth pour modéliser les processus d échnges de protons dns un milieu iologique vec des gents prcest (Li et l., 2008). Etnt donné que les groupes B, C et D sont reltivement peu concentrés, nous fisons l hypothèse que les échnges entre ces 3 groupes sont négligeles. L figure F.VII.1 présente une vue schémtique de notre modèle d échnge de protons à 4 comprtiments

134 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Figure F.VI.1 : Schém du modèle d échnge de protons à 4 comprtiments. Les protons de l eu lire (H A ) sont en échnge vec les protons liés ux mcromolécules (H B ), vec les protons mides (H C ) et vec les protons déplcés pr le lipocest (H D ). Les tux d échnges entre les protons H A et les protons H B, H C et H D sont notés respectivement,,. Ce modèle à 4 comprtiments est décrit pr un système de 12 équtions différentielles : E41 dm dt x x 2 M T k ex M x k c ex M x k d ex M x k ex M x k c ex M c x k d ex M d x 2 ( st )M y, E42 E43 E44 dm dt dm dt dm dt x c x d x x 2 M kex M x kex M x 2 ( st )M y, T c x c 2 M c c c c kex M x kex M x 2 ( c st )M y, T d x d 2 M d d d d kex M x kex M x 2 ( d st )M y, T E45 dm dt y 2 ( st )M x y 2 M T k ex M y k c ex M y k d ex M y k ex M y k c ex M c y k d ex M d y M 1 z,

135 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo E46 E47 E48 dm dt dm dt dm dt y c y d y M 2 ( st )M x kex M y kex M y 1M z, T M c c c c c 2 ( c st )M x kex M y kex M y 1M z, T M d d d d d 2 ( d st )M x kex M y kex M y 1M z, T y 2 c y c 2 d y d 2 E49 dm dt z 0 1 M T ω M 1 y z 1 M T k ex M z k c ex M z k d ex M z k ex M z k c ex M c z k d ex M d z, E50 E51 E52 dm dt dm dt dm dt z c z d z 0 1 z 1 M M ω1m y kex M z kex M z, T T c 0 c 1 c z c 1 M c c M c c ω1m y kex M z kex M z, T T d 0 d 1 d z d 1 M d d M d d ω1m y kex M z kex M z, T T uxquelles s joutent les reltions suivntes, correspondntes ux équtions de conservtion de l msse pour chcun des groupes de protons : E53 dm dt z ss ex 0 ex 0 0 k M k M, E54 dm dt c z ss c ex c 0 c ex 0 0 k M k M, E55 dm dt d z ss d ex d 0 d ex 0 0 k M k M. Les prmètres utilisés dns ce modèle pour crctériser le processus d échnge de protons reltifs u groupe de protons i sont : i M 0 : l imnttion initile, i M x,y,z : l imnttion selon les directions x, y ou z, i T 1 : le temps de relxtion longitudinl,

136 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo i T 2 : le temps de relxtion trnsversl, ij k ex : le tux d échnge vec le groupe de protons j, i : l fréquence de Lrmor, st : l fréquence de l impulsion de sturtion, 1 : l intensité de l impulsion de sturtion. Les frctions de chque groupe de protons B, C et D pr rpport u groupe de proton A correspondent u rpport des imnttions à l équilire tel que : E56 i 0 0 M f i, vec i =, c et d. M On d illeurs, en rison des équtions E53, E54 et E55, les reltions suivntes : E57 E58 k k ex c ex 0 0 M kex kex. f, M c 0 0 c M c kex kex. fc, M E59 k d ex d 0 0 d M d kex kex. f d. M Dns le cs des lipocest, l grndeur d intérêt est l concentrtion en lipocest et non l concentrtion en protons déplcés pr le lipocest. De ce fit, le rpport f d correspond à : E60 f d M ClipoCEST.n lipocest. M C d 0 0 H O 2 vec C lipocest l concentrtion en nnoprticules, n lipocest le nomre de molécules d eu déplcées pr lipocest et C H 2 O l concentrtion en molécules d eu lires du milieu

137 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Dns une expérience CEST, l impulsion de sturtion est ppliquée reltivement longtemps. L imnttion peut lors être décrite pr les solutions à l étt d équilire ce qui permet de simplifier le système d équtions. Une utre simplifiction consiste à éliminer les termes d échnge pour les composntes trnsverses du groupe B (Ceckler et l., 2001; Henkelmn et l., 1993). Sous ces conditions, l cominison des équtions E42 et E46 donne : E61 M y 1 2 ω T M 2 2 z. 1 ( 2 ( )) (T ) st 2 En remplçnt cette expression dns l éqution E50, on otient : dm dt M M ex z ex z 1 st 2 z, vec T T z 0 z 2 E62 k M k M g ( ),T M 1 2 E63 st T 1 g ( ),T. 1 ( 2 ( )) (T ) st ),T2 st g ( représente l distriution du groupe de protons B. Elle est en théorie décrite pr une fonction lorentzienne mis des études précédentes ont montré que l distriution des protons liés ux mcromolécules étit mieux modélisée pr une fonction super-lorentzienne (Ceckler et l., 2001; Li et l., 2008; Morrison nd Henkelmn, 1995) dont l éqution est : 2 2 π / 2 2 st 2 E64 g ( st ),T2 exp π 3cos 1 0 3cos 1 T 2 ( )T 2 sin d. Il est en théorie possile de résoudre numériquement ce système de 12 équtions différentielles à l ide de Mtl. Cependnt, cette résolution serit coûteuse en temps et peu prtique pour juster nos données expérimentles. L strtégie doptée pr Li et collorteurs est de réécrire ce système sous forme mtricielle (Li et l., 2008) : E65 dm AM B. dt

138 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo L solution à l éqution E65 peut être estimée à l ide de Mtl et correspond u clcul numérique de l expression E66 : B B M 0. A A E66 M exp At VII.1. Détermintion des prmètres du modèle pour les contrstes APT et MT Afin de déterminer les prmètres d échnge de protons pour les contrstes endogènes MT et APT, nous vons considéré un modèle à 3 comprtiments comportnt les protons A (eu lire), B (protons liés ux mcromolécules) et C (protons NH). Les protons D reltifs ux lipocest ont donc été exclus pour ce modèle. Ce modèle à 3 comprtiments déjà été décrit dns l littérture pour déterminer de fçon quntittive les échnges de protons endogènes à l origine des contrstes MT et APT (Li et l., 2008; Woessner et l., 2005). Afin de déterminer ces prmètres d échnge, nous vons cquis des Z-spectr in vivo sur des cerveux de trois souris sines. L impulsion de sturtion été ppliquée à une fréquence llnt de -20 ppm à +20 ppm vec un ps de 1 ppm et 5 intensités de B 1 ont été utilisées (B 1 = 0,5 / 1 / 2 / 5 / 7 µt). Pr illeurs, deux Z-spectr ont été cquis in vivo dns une tumeur cérérle de souris U87 vec 2 intensités de sturtion (B 1 = 0,5 et 1 µt). Nous vons choisi de distinguer 3 types tissulires différents, à svoir l mtière grise (MG), l mtière lnche (MB) et l tumeur (Tu). Les ROI ont été segmentées mnuellement sur une imge ntomique de référence. Les ROI utilisées sont présentées sur l figure F.VII.2. Les Z-spectr moyens de chque ROI ont ensuite été justé à l ide de notre modèle à 3 comprtiments (protons A, B et C). Afin de réduire le nomre de vriles et pour fciliter l justement des données pr le modèle, nous vons fit les hypothèses suivntes : Les temps de relxtion T 1 et T 2 de chque ROI sont égux ux temps de relxtion pprents T 1 et T 2 moyens (moyenne ± écrt-type) estimés à 7T à l ide respectivement d une séquence d écho de grdient précédée d un module d inversion-récupértion (Deichmnn nd Hse, 1992) et de l séquence MSME. Les vleurs moyennes de T 1 / T 2 ont été estimées égles à 1890 / 53 ms, 1673 / 41 ms et 2318 / 62 ms pour les types tissulires MG, MB et Tu respectivement

139 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Bien que segmentés, les Z-spectr cquis dns le liquide céphlorchidien (LCR) n ont ps été exploités. En effet, le LCR est un comprtiment ne comportnt ps ou peu de mcromolécules (Felgenhuer, 1974). Pr conséquent, nous vons ssimilé le LCR à de l eu. Les vleurs initiles des prmètres pour l justement ont été considérées égles à l moyenne des vleurs trouvées dns l littérture lorsque celles-ci étient disponiles. Toutes ces vleurs sont reportées dns l colonne «Vleurs de l littérture» du tleu T.VII.1. Bien que l tumeur ne soit ps un tissu homogène, nous vons considéré des prmètres moyens pour décrire les échnges de protons dns l tumeur. Figure F.VII.2 : Régions d intérêt des Z-spectr. Les ROI utilisées pour l justement des Z- spectr sont l mtière grise (MG, ROI leue), l mtière lnche (MB, ROI june) et l tumeur (Tu, ROI verte). Le liquide céphlo-rchidien (LCR, ROI rouge) été segmenté mis les Z- spectr n ont ps été nlysés. Les Z-spectr moyens de chque ROI cquis vec les différentes intensités de sturtion sont présentés sur l figure F.VII.3. L justement de chque Z-spectrum pr le modèle à 3 comprtiments est représenté pr une ligne continue et les prmètres déterminés sont reportés dns le tleu T.VII

140 Figure F.VII.3 : Ajustement des Z-spectr in vivo. Les Z-spectr in vivo cquis dns chcune des 3 ROI étudiées sont présentés ; MG (), MB (), Tu (c). Les justements rélisés grâce u modèle sont représentés pr une ligne continue.

141 Tleu T.VII.1 : Prmètres d échnge endogènes. Les prmètres correspondnt ux types tissulires MG, MB et Tu sont présentés insi que les vleurs de références trouvées dns l littérture. 1 (Sled nd Pike, 2001) ; 2 (Mougin et l., 2010) ; 3 (Smith nd Cheresh, 1990) ; 4 (Underhill et l., 2011) ; 5 (Zhou et l., 2004); 6 (Zhou et l., 2003).

142 Ainsi que l illustre l figure F.VII.3, notre modèle permet d juster correctement nos données expérimentles. Pr illeurs, les prmètres d échnges de protons estimés et résumés dns le tleu T.VII.1 sont glolement en ccord vec ceux rpportés dns l littérture. On peut donc risonnlement considérer que notre modèle décrit correctement les processus d échnges endogènes. Nénmoins, nous pouvons fire quelques commentires sur l pertinence de ces prmètres : Les tux d échnge k ex et c k ex sont comprles entre les différents types tissulires y compris pour l tumeur. Ce résultt prît cohérent cr l moilité des protons dns l couche d hydrttion des mcromolécules dns les différents tissus est reltivement stle. et c sont comprles dns les 3 types tissulires à l exception de dns l tumeur. Ceci semle pointer une distriution des mcromolécules plus symétrique dns l tumeur que dns les tissus sins. Toutefois, nous n vons ps trouvé de données dns l littérture étynt cette oservtion. Les écrt-types consttés pour certins prmètres d échnge sont importnts. C est notmment le cs des T 1 des protons H B et H C. Cette grnde vriilité est liée u peu d influence que ces prmètres ont sur le tux de sturtion des molécules d eu lires (Tyler nd Gowlnd, 2005). Pr exemple, une vrition de n entrine une ugmenttion du PTR que de 0,01%. T 1 de 500 à 1000 ms L frction f est le prmètre qui vrie le plus entre les différentes ROI (~4%, ~8% et ~14% pour les types tissulires Tu, MG et MB). Ceci est logique puisque f un impct presque proportionnel sur le PTR telle que l illustre l éqution E32 présentée u chpitre III. Les vleurs déterminées pr illeurs sont en ccord vec l littérture. De fçon similire, l frction de protons f c est ssez ien estimée. Ce prmètre vrie peu dns les tissus sins (0,10% dns MG et 0,13% dns MB) mis est plus importnt dns l tumeur (0,19%). En considérnt une concentrtion en eu respective de 43,3 M, 35,8 M et 45,0 M pour les types tissulires MG, MB et Tu (Kiricut nd Simplcenu, 1975; Lentner, 1981), ces vleurs de f c correspondent à des concentrtions en protons mides de 86,6 mm, 93,1 mm et 171 mm respectivement. Ces vleurs sont en ccord vec les vleurs reportées pour le cerveu de rt (Zhou et l., 2003). Glolement, on remrque un impct plus importnt des prmètres d échnge des protons B, reltivement ux protons C. Cette différence de sensiilité est liée non seulement à l plus grnde concentrtion de mcromolécules, mis ussi ux intensités

143 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo de sturtion (> 1 µt), pour lesquelles le tux de sturtion des protons A liés à l échnge chimique vec les protons C est déjà mximum. Il été démontré que des prmètres physiologiques comme le ph (Gregory et l., 1983; McMhon et l., 2006; Zhou et l., 2003) ou l tempérture (Ceckler et l., 2001; Gregory et l., 1983) pouvient influencer de fçon significtive l moilité de ces protons. Or notre modèle ne considère ps ces vriles. On ne peut donc exclure des erreurs d estimtion du MT et APT pour nos données in vivo en cs de vritions significtives de ph ou de tempérture. VII.1.c Détermintion des prmètres du modèle pour les lipocest Afin de déterminer les prmètres d échnge de protons reltifs u lipocest, nous vons considéré un modèle à 2 comprtiments comportnt les protons A (eu lire) et les protons D (protons déplcés pr le lipocest). Des Z-spectr ont été cquis sur un fntôme de lipocest vec 10 intensités de B 1 différentes (1 / 2 / 3 / 4 / 5 / 6 / 7 / 8 / 9 / 10 µt) et une fréquence de sturtion δ st vrint de -25 à 25 ppm vec un ps de 1 ppm. L concentrtion en nnoprticules dns le fntôme utilisé étit C lipocest = 14 nm. Ces Z-spectr ont ensuite été justés et les prmètres d échnge estimés (moyenne ± écrt-type, n=10). L figure F.VII.4. présente les Z-spectr expérimentux (points) insi que l justement grâce u modèle à 2 comprtiments (ligne continue). Seuls les Z-spectr cquis vec une intensité de sturtion impire sont présentés pour lléger l figure. Comme défini précédemment (voir chpitre V), ces Z-spectr sont représentés en tnt que Z-spectrum 2D en figure F.VII ms, d T 2 Les prmètres déterminés grâce à ces justements sont : d d k ex = 327 ± 13 Hz, T 1 = 45 ± = 2,0 ± 0,7 ms et f d = 1,49 ± 0,03 %. Bien que l rélité des échnges de protons dns les lipocest soit plus complexe, l qulité des justements confirme l vlidité phénoménologique de notre modèle. L frction de protons H D correspond ien à l concentrtion connue en C lipocest = 14,0 ± 0,3 nm. Cette concentrtion en lipocest été dérivée de l éqution E60 vec C H 2 O = 55 M et n lipocest = 5,8 x 10 7 molécules d eu pr lipocest en considérnt un dimètre hydrodynmique du lipocest d H = 170 nm et une épisseur de l icouche lipidique e = 10 nm, soit un ryon interne r i = 75 nm (voir figure F.VII.5). Il est importnt de noter que cette estimtion de f d implique l interction de chque molécule d eu intr-liposomle vec u moins un complexe prmgnétique

144 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Figure F.VII.4 : Détermintion des prmètres d échnge exogènes. () : Z-spectr cquis sur un tue de lipocest à une concentrtion C lipocest = 14 nm vec cinq vleurs de B 1 (1 µt (points noirs) / 3 µt (points lncs) / 5 µt (crrés noirs) / 7 µt (crrés lncs) / 9 µt (losnges noirs)) et leurs justements rélisés grâce u modèle à 2 comprtiments (ligne continue) ; () : Z-spectrum 2D correspondnt. Figure F.VII.5 : Schém d un lipocest vec les dimensions utilisées pour le clcul du nomre de molécules d eu internes n lipocest. Les prmètres de sturtion optimux pour ce lipocest sont δ st.opt = 11 ppm, B 1opt = 7 µt et l effet MTRsym correspondnt est de 27%. D près l reltion E34, le B 1 optimum permet de renseigner sur l vleur du tux d échnge. Pr conséquent, nous pouvons vérifier que le tux d échnge estimé pr justement des Z-spectr ( d k ex = 327 ± 13 Hz,) correspond

145 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo pproximtivement à 2π.γ.B 1opt ( = 298 Hz). Ceci permet de confirmer l vlidité de l reltion E34 pour nos lipocest. VII.2 Outil d Anlyse Quntittive (OAQ) VII.2. Architecture de l Outil d Anlyse Quntittive Comme nous l vons présenté dns le chpitre II, l chîne de tritements pour l quntifiction en imgerie moléculire se décompose en 3 étpes, à svoir l cquisition des données, l quntifiction de l gent de contrste puis l quntifiction de l cile iologique (voir figure F.II.1). Ici, nous détillons l Outil d Anlyse Quntittive (noté OAQ) que nous vons développé durnt cette thèse fin de stisfire l deuxième étpe et de quntifier les gents lipocest in vivo dns des tissus iologiques. L rchitecture de l OAQ est représentée de fçon schémtique sur l figure F.VII.6. L première étpe de l OAQ consiste à définir les msques correspondnt ux trois types tissulires considérés pr segmenttion mnuelle sur le jeu de données à nlyser. Cette étpe est rélisée sur une imge ntomique de référence. Pour chque pixel r de l imge, on ffecte un indice s (vec s = MG, MB ou Tu) permettnt de clssifier l nture du pixel. Le jeu de prmètre d échnge pour chque clsse est noté {P} s. L deuxième étpe consiste à simuler à l ide de notre modèle à 4 comprtiments le trnsfert de sturtion dns le pixel r : MTRsym sim (C lipocest, {P} s, B 0 (r), B 1 (r)) en fonction des prmètres d échnge {P} s et des vleurs expérimentles des chmps B 0 (r) et B 1 (r) en ce pixel. Ce clcul est rélisé pour une gmme de concentrtions en lipocest comprise entre 0 et 50 nm vec un ps de 0,01 nm. On étlit insi pour chque pixel un que lint le contrste MTRsym à l concentrtion en lipocest. L comprison de l vleur expérimentle de l effet CEST MTRsym exp (r) vec l que permet d estimer l concentrtion en lipocest en ce pixel. Ce processus est répété en chque pixel fin d étlir l crte de concentrtion en lipocest C lipocest (r)

146 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Figure F.VII.6 : Quntifiction des données CEST pr l Outil d Anlyse Quntittive. En chque pixel r, les prmètres d échnge {P} s estimés précédemment pour le type tissulire considéré s sont utilisés en cominison vec les vleurs des chmps B 0 (r) et B 1 (r) fin de clculer le contrste MTRsym sim (C lipocest, {P} s, B 0 (r), B 1 (r)) en fonction de l concentrtion en lipocest pour une gmme de 0 à 50 nm. L concentrtion en lipocest est lors estimée pr comprison vec le contrste MTRsym exp (r) expérimentl. Cette opértion est répétée pour chque point de l imge fin de définir l crte de concentrtion en lipocest C lipocest (r)

147 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Conformément à nos remrques concernnt l impct des inhomogénéités de chmps B 0 et B 1 (voir Chpitre V) sur le clcul de l effet MTRsym, nous vons grâce à l OAQ l opportunité de considérer les véritles vleurs des chmps B 0 et B 1. Ces vleurs permettent de réctuliser en chque point r, les fréquences de Lrmor i et l intensité ω 1 de l impulsion de sturtion. Ainsi, les inhomogénéités de chmps B 0 et B 1 sont prises en compte dns le clcul de C lipocest (r). L crte de concentrtion est donc théoriquement exempte d rtefcts liés à ces inhomogénéités. VII.2. Vlidtion in vitro de l OAQ Afin de vlider notre OAQ, nous vons testé son efficcité sur un fntôme contennt des lipocest à une concentrtion vrile. Une glerie de 5 tues vec une concentrtion en lipocest de 0 / 0,1 / 0,5 / 1 / 10 nm été utilisée (voir figure F.VII.7.). Les solutions ont été otenues pr dilutions successives de l solution mère à C lipocest = 25 nm. L concentrtion de l solution mère été déterminée pr une technique de spectrométrie d émission tomique à plsm à couplge inductif (ou ICP-AES pour Inductively Coupled Plsm Atomic Emission Spectroscopy) vec une précision de 10%. Des crtes de chmps B 0 et B 1 (voir figures F.VII.7.c et.d respectivement) ont été cquises selon les méthodes décrites dns le chpitre V. Une imge CEST été cquise grâce à l séquence CEST-MSME vec une impulsion de sturtion ppliquée à δ st = 11 ppm et B 1 = 7 µt (voir figure F.VII.7.). Tleu T.VII.2 : Vlidtion in vitro de l OAQ. L concentrtion en lipocest (moyenne ± écrt-type) été clculée dns chque tue vec et sns correction des chmps B 0 et B

148 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Figure F.VII.7 : Vlidtion in vitro de l OAQ. () : glerie de fntômes utilisée (C lipocest = 0 / 0,1 / 0,5 / 1 / 10 nm) ; () : imge CEST cquise vec δ st = 11 ppm et B 1 = 7 µt ; (c) : crte de chmp B 0 et (d) : crte de chmp B 1 ; (e) : crte quntittive et (f) : crte quntittive sns prise en compte des chmps B 0 et B 1. Etnt donné que l gmme des concentrtions étit lrge, deux échelles de couleurs ont été utilisées pour fficher chque tue vec une dynmique dptée. Les tues vec une concentrtion comprise entre 0 et 1 nm sont ffichés vec l échelle de couleur «jet» de Mtl sur une gmme de concentrtions de 0 à 2 nm. Le tue à 10 nm est ffiché vec l échelle de couleur «cool» de Mtl sur une gmme de concentrtions de 9 à 11 nm

149 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Le tleu T.VII.2 résume les concentrtions (moyenne ± écrt-type dns le tue) estimées vec l OAQ vec ou sns prise en compte des vleurs expérimentles des chmps B 0 et B 1. On constte que les concentrtions estimées sont en ccord vec l concentrtion théorique pour l ensemle de l gmme de concentrtions. L écrt mximl vec correction de B 0 et B 1 est de 0,12 nm tndis qu il est de 1,31 nm sns correction. Ceci démontre l importnce d cquérir et de considérer les chmps B 0 et B 1 dns le clcul de l concentrtion. Pr illeurs, nous estimons que l limite de détectilité in vitro de nos gents lipocest est de l ordre de 100 pm, ce qui est comptile vec les résultts puliés pr l équipe de Silvio Aime (Aime et l., 2005). Bien que nos fntômes soient homogènes, nous oservons des écrttypes llnt jusqu à 0,27 nm. Ceci nous permet d estimer l précision de notre OAQ à environ 300 pm. VII.3 Appliction in vivo de l OAQ chez l souris U87 VII.3. Quntifiction des lipocest in vivo Afin d évluer l OAQ in vivo, nous l vons ppliqué ux données d imgerie CEST présentées u chpitre précédent. Compte tenu du temps importnt nécessire à l nlyse quntittive de l ensemle des données in vivo, nous vons choisi d illustrer l quntifiction sur les imges CEST présentées figures F.VI.8 et F.VI.9. Les données quntifiées à l ide de l OAQ sont présentées figures F.VII.8 et F.VII.9. A l exmen des crtes quntittives présentées sur l figure F.VII.8, on constte que les concentrtions en lipocest les plus importntes sont détectées dns le cerveu de l souris injectée vec le RGD-lipoCEST à l périphérie de l tumeur (C lipocest ~ 4,2 nm). Nénmoins, du fit de l sensiilité modeste des imges CEST, les crtes quntittives présentent des inhomogénéités importntes. Pr conséquent, nous vons dopté l même pproche d nlyse de groupe que celle présentée u chpitre VI pour contourner cette limittion. Nous rppelons que les 24 souris ont été réprties en deux groupes de 12 souris (injectées vec le RGD ou le CtrllipoCEST) et l concentrtion moyenne en lipocest été clculée dns deux ROI (l tumeur et l zone controltérle). Les rres d erreur correspondent donc à l vriilité inter-individuelle. Les décours temporels de l concentrtion pour les 4 sous-groupes sont présentés sur l figure F.VII.9. Les p-vlues ont été clculées pour chque ps temporel entre l concentrtion en

150 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo RGD-lipoCEST dns l tumeur et les trois utres conditions (voir tleu T.VII.3). Un stérisque indique qu un seuil de significtivité sttistique inférieur à 0,01 est tteint (p 0,01) entre l condition RGD-lipoCEST dns l tumeur et une des trois utres conditions. Figure F.V.8 : Crtes de concentrtion en lipocest. Les crtes quntittives en RGD- () et Ctrl-lipoCEST () ont été clculées à prtir des imges CEST présentées figures F.VI.8. et

151 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Figure F.VII.9 : Décours temporels de l concentrtion en lipocest. L vleur moyenne de C lipocest été clculée pour chque ROI et pour chque sous-groupe (n =12) à l ide de l OAQ. Tleu T.VII.3 : P-vlues clculées à l ide d un test de Student. Pour chque ps temporel, les concentrtions moyennes clculées dns l tumeur vec le RGD-lipoCEST ont été comprées vec celles des trois utres conditions. De fçon générle, les oservtions rélisées sur le contrste CEST restent vlident pour les vritions de concentrtion en fonction du temps. On remrque que dès 18 minutes postinjection, l concentrtion de RGD-lipoCEST dns l tumeur est significtivement différente des concentrtions dns l zone controltérle vec les RGD- et Ctrl-lipoCEST. Au-delà, cette différence se confirme vec les trois conditions contrôle. L concentrtion de RGD-lipoCEST dns l tumeur est en moyenne de 2,79 ± 0,21 nm sur les 2 heures d cquisition post-injection

152 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Dns les trois utres conditions, les concentrtions sont plus files et l concentrtion mximle tteinte prmi ces trois conditions contrôle est de 1,71 ± 0,46 nm. Conformément ux conclusions de l étude présentée u chpitre VI, il est risonnle de considérer u moins deux contriutions u contrste CEST oservé. Une première prtie provient d gents lipocest (Ctrl- et RGD-lipoCEST) liés de fçon non spécifique ou circulnt lentement dns les cpillires. Une seconde prtie correspond ux gents RGD-lipoCEST liés spécifiquement à leur cile α ν β 3. Des données d immunohistochimie et d imgerie de fluorescence nous vient d illeurs permis de conforter ces résultts. D près les coures de concentrtion, on peut insi estimer l quntité de RGD-lipoCEST spécifiquement ssociée à s cile. Au out de 2 heures post-injection, l concentrtion en RGD-lipoCEST dns l tumeur est de 2,79 ± 0,21 nm lors qu elle est en moyenne de 0,94 ± 0,23 nm pour les trois utres conditions. Ainsi, nous pouvons estimer que l concentrtion mximle de RGD-lipoCEST spécifiquement lié à l intégrine α ν β 3 est d pproximtivement 1,8 nm. Evidemment, il est nécessire de considérer vec prudence cette vleur pour plusieurs risons. D une prt, cette vleur été estimée sns effort de modélistion comprtimentle. D utre prt, les prmètres utilisés dns l OAQ pour décrire les échnges entre les groupes de protons A et D ont été déterminés in vitro et nous vons fit l hypothèse qu ils restent vlident in vivo. Or nous ne connissons ps l influence du milieu iologique sur les prmètres d échnge et il est difficile d envisger une estimtion de ces prmètres in vivo. Cel constitue donc une limittion importnte à notre pproche. Pr conséquent, nous jugeons plus risonnle de prler de semi-quntifiction des lipocest in vivo. VII.4. Vers l modélistion comprtimentle Si l chîne de tritements que nous venons de présenter ne permet ps encore de déterminer l concentrtion en intégrines α ν β 3, elle permet nénmoins de quntifier, ou plus justement d estimer l quntité d gents lipocest ssociés spécifiquement à ce iomrqueur. Dns le chpitre II, nous vions défini l imgerie moléculire comme une modlité d imgerie non invsive permettnt de quntifier in vivo une cile iologique grâce à l quntifiction d un gent de contrste et à l modélistion de l dynmique de prise de contrste. Pour tendre vers notre ojectif initil qui étit de mettre en plce un protocole d imgerie moléculire pr IRM- CEST, il nous reste donc à frnchir l dernière étpe qu est l modélistion comprtimentle

153 CHAPITRE VII - Semi-quntifiction des lipocest in vivo Pour cel, il fut définir un modèle ussi réliste que possile permettnt de décrire l dynmique de prise de contrste. L nlyse des données CEST, des résultts d immunohistochimie et de microscopie de fluorescence nous permet d interpréter l prise de contrste. Il semlerit que l distriution des lipocest près une injection IV puisse être vue comme un modèle simple à 3 comprtiments (voir figure F.VII.10). Figure F.VII.10 : Modèle à 3 comprtiments pour décrire l dynmique de prise de contrste CEST. Le premier comprtiment représente le plsm snguin et l concentrtion en lipocest circulnt C plsm (t) correspond à l fonction d entrée plsmtique de ce modèle. Les lipocest s ccumulent dns deux comprtiments tissulires et sont éliminés pr le S.R.E à un tux k 3. Le premier comprtiment tissulire correspond ux lipocest non spécifiquement liés à leur cile et leur concentrtion est notée C non-spé (t). Les tux k 1 et k -1 correspondent à l entrée et à l sortie des lipocest du premier comprtiment tissulire. Enfin, le second comprtiment tissulire représente les lipocest liés spécifiquement à leur cile α ν β 3. Leur concentrtion est notée C spé (t). Les constntes k 2 et k -2 reflètent les constntes d ssocition et de dissocition du RGDlipoCEST vec α ν β 3. Afin d exploiter nos coures à l ide de ce modèle, il nous mnque de nomreuses informtions. Tout d ord, il est très délict de mesurer notre fonction d entrée directement en imgerie CEST. Ceci est dû à l sturtion inefficce des spins circulnt dns les rtères et les veines en IRM-CEST. Une lterntive (que nous n vons ps mise en plce) urit pu consister à doser l concentrtion en lipocest u cours de nos expériences à prtir de prélèvements snguins. Nous ne disposons donc ps de fonction d entrée plsmtique. Une seconde lcune tient à notre ignornce des constntes d ssocition et de dissocition du RGD-lipoCEST vec