METHODES D ISOLEMENT DES CELLULES

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1 METHODES D ISOLEMENT DES CELLULES Isolement à partir des tissus Cultures cellulaires Clonage cellulaire

2 1) Isolement à partir d un tissu Etapes communes à toutes les méthodes: - dissociation mécanique des tisus - dissociation enzymatique => cellules isolées - identification Différentes méthodes d identification - basées sur des différences de propriétés physiques centrifugation sur gradient de densité, cytométrie en flux - basées sur la reconnaissance spécifique d Ac Ac spécifique couplé à un support, couplé à colorant fluo - Microdissection LASER

3 Méthodes basées sur propriétés physiques Centrifugation sur gradient de densité Séparation des cellules selon leur DENSITE plasma < leucocytes et plaquettes < Ficoll < granulocytes et hématies

4 Méthodes basées sur propriétés physiques Cytométrie en flux (FACS) Séparation des cellules selon leurs propriétés optiques (utilisation liquides vecteurs et faisceau LASER) Analyse individuelle, tri cellulaire, complexité interne AVANTAGES Rapidité Applicable aux C vivantes Haut débit (milliers/min) Plusieurs paramètres étudiés Marquages multiples C peuvent être remises en culture Applications: -Etude cycle cellulaire (quantification ADN) -Isolement de sous pop s -Quantification et répartitions des sous pop s

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6 Méthodes basées sur reconnaissance spécifique d Ac Ac spécifiques couplés à un support Ac reconnaît la C d intérêt et s y fixe Ac fixé sur support => C adhère indirectement support -> Regroupement des C d intérêt sur un support Ac spécifiques couplés à un colorant fluorescent Ac marqué reconnaît C d intérêt et la fixe -> Repérer les C d intérêt grâce à la fluorescence

7 Microdissection LASER Prélèvement de qq C dans une coupe de tissu Permet étude d un seul type cellulaire

8 2) Cultures cellulaires = Maintien in vitro de C vivantes pendant une durée variable Milieux de culture classiques (sb nutritives de base, suppléments pr divisions) OU Milieux chimiquement définis sans sérum Stérilité 37 C CO2 (5%) Incubateur Hotte

9 Définitions Culture primaire Cellules provenant directement du tissu Culture secondaire = repiquage Utilisation des C issues de la culture primaire pour reproduire d autres cultures

10 Comportement des C in vitro C expriment les ppiétés de leur tissu d origine (****) C normales : - contrôle prolifération Caire (taille, environnement, ADN) - nb limité de divisions (perte de nucléotide à chaque ) C cancéreuses - ø de contrôle de la prolifération - immortalité en culture (ø perte nucléotides) - in vivo tumeurs

11 Utilité de la culture cellulaire Obtenir des C en grand nombre Etudier influence milieu et interactions Caires Possibilité obtention colonie provenant d 1 seule C => COMPOSITION GENETIQUE HOMOGENE

12 3) Clonage cellulaire Réalisé à partir d une C primitive unique => UNIFORMITE GENETIQUE Clonage de C mutantes Production d Ac monoclonaux Clonage de mammifères

13 Clonage de C mutantes But = étude contrôle cycle Caire Modèles utilisés : - levures - xénopes

14 Production d Ac monoclonaux Intérêt médical : biologie, imagerie, thérapeutique Ac monoclonal = fusion de plasmocytome de souris et C sécrétrice d Ac (LB)

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16 Clonage de mammifères Intérêt : reproduction

17 EXPLORATION MOLECULAIRE Fractionnement subcaire -homogénéisation -centrifugation et ultracentrifugation Analyse Caire des Ac. Nucléiques -hybridation des ac. Nucléiques -technique d analyse de l ADN, des ARN et protéines

18 1) Fractionnement subcaire Homogénéisation = rupture de la MP (choc osmotique, ultrasons ou choc mécanique) Centrifugation Constituants de grande taille sédimentent en 1er (noyau>mt/lysosome/peroxysome>re fragmenté>ribosomes/virus) Ultracentrifugation avec sédimentat à l equilibre Séparation «finale» des organites

19 Ultracentrifugation Lyse Caire (broyage, ultra-sons, choc osmotique) Dépôt du lysat sur gradient de sucrose Centrifugation à très haute vitesse Séparation des différentes structures selon densité

20 Notion de coefficient de sédimentation vitesse à laquelle le cstituant sédimente Traduite par loi de Stockes, et exprimée en Unité Svedberg (S) (unité non additive ****) Caractéristique de la taille et de la forme du constituant

21 2) Analyse Caire des Ac. nucléiques ADN = nucléotides / pdb / 1,80m dans une seule C

22 Hybridation des Ac. nucléiques Liaisons H2 entre 2 séq. nucléotidiques complémentaires Présence d un gène ADN Expression d un gène ARNm Caractériser les séquences ADN ou ARN Sonde d ADN couplée à radio-isotope/marqueur chimique Hybridation qu avec des séquences complémentaires (T appariement Seq au moins 20 nucléotides)

23 Hybridation des Ac. nucléiques Hybridation In Situ (dans le tissu) ø extraction d ADN ARN -> C entière ou tissu ADN -> N interphasiques ou chromosomes Utilisation complémentaire aux caryotypes FISH Sondes centromériques (trisomie 21) Sondes painting (cassures, réarrangement) Sondes locus (délétions > 100pb)

24 Hybridation des Ac. nucléiques HIS et FISH Détection d ARN ou d ADN à l aide de sondes complémentaires Très utilisé en génétique médicale

25 Techniques d analyse ADN ARN et Protéines Southern/Northern/Western Blot Chromatographie (partage, affinité) Electrophorèse sur gel polyacrylamide Séquençage des protéines

26 Techniques d analyse ADN ARN et Protéines Southern ADN Northern ARN Western Protéines 1ère étape : électrophorèse PM 2ème étape : transfert Capillarité 3ème étape: hybridation Sonde spécifique 4ème étape : révélation ****

27 ETUDE DES CELLULES VIVANTES Protéines chimères fluorescentes (GFP) Utilisation de précurseurs Le flux des ions à travers les membranes

28 1) Protéines chimères fluorescentes Construction gène codant pour P d intérêt + GFP (fluorescence) Introduction dans la C : utilisation VECTEUR Visualisation Caire (GFP ++) Souvent en microscopie confocale

29 2) Utilisation de précurseurs Etude cinétique Marqueurs radioactifs ++: Thymidine tritiée ADN Uridine tritiée ARN Leucine tritiée Protéine Autres marqueurs

30 3) Flux des ions à travers les mb =Méthode du patch clamp Pipette de verre à la surface d une C Isolement d un «patch» (canal) Electrodes Variations de U imposées et potentiels de membrane => Conditions électrophysio d ouverture/fermeture des canaux ioniques