Identification de Streptococcus pneumoniae

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Élise Beauchemin
il y a 7 ans
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1 Identification de Streptococcus pneumoniae L identification a été effectuée à l Unité de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de Bacteriologie-Virologie (Hôpital Aristide Le Dantec). Isolement En vue d obtenir des colonies Streptococcus pneumoniae a été ensemencé un milieu approprié Gélose Colmbia + 5% de sang de cheval + Gentamicine ou GSC + Polyvitex, incubé dans des conditions précises. Identification Examen macroscopique des colonies Streptococcus pneumoniae donne sur gélose au sang cuit de petites colonies mucoïdes ou à dépression centrale, transparentes, rondes, et développant une hémolyse de type alpha (αviridans). Examen microscopique des colonies Technique de la coloration au bleu de méthylène - verser du bleu de méthylène sur la préparation séchée et fixée - laisser agir pendant 30 secondes - laver à l eau - sécher entre deux feuilles de papier buvard - Lire au microscope, à l objectif 100 Technique de la coloration de Gram - Première phase de coloration : recouvrir la préparation de violet de gentiane, laisser agir une minute - Laver au lugol, puis recouvrir la lame de lugol et laisser agir 30 secondes et recommencer cette opération - Phase de décoloration : laver successivement à l eau et à l alcool jusqu à ce que le liquide qui s égoutte soit incolore - Deuxième phase de coloration : recouvrir la lame de fuschine et laisser agir 30 secondes - Laver à l eau et sécher entre deux feuilles de papier buvard, puis lire au microscope à l immersion à l objectif 100

2 Interprétation : Les bactéries colorées en violet sont dites à Gram positif (+) Les bactéries colorées en rouge sont dites à Gram négatif (-) Un frottis coloré au Gram à partir d une colonie a été réalisé. L observation au microscope optique à l objectif 100 avec une goutte d huile à immersion a montré des diplocoques Gram positif à forme lancéolée, en flamme de bougie. Test à la catalase La catalase est une enzyme qui décompose le peroxyde d hydrogène 3% en oxygène gazeux et en eau. Un frottis à partir des colonies isolées a été réalisé. Ensuite quelques gouttes d eau oxygénée (peroxyde d hydrogène) y sont déposées. La libération d oxygène s est matérialisée par la production de bulles ; la bactérie est alors dite catalase positive. Streptococcus pneumoniae est catalase négative. Test à l oxydase Sous l action d une cytochrome-oxydase, le di-méthyl-para-phénylène diamine, incolore, est transformé en une semi-quinone violacée qui s oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre. - Réactif (à conserver à + 4 C et à l obscurité) o Solution aqueuse à 1% de chlorhydrate ou d oxalate de di-méthylparaphénylène diamine dont on imbibera un papier buvard blanc o Ou disques de papier buvard imprégnés de cette substance dans le commerce - Placer le disque Ox sur une lame porte-objet et l imbiber avec une goutte d eau. Prélever à la pipette boutonnée une parcelle de culture et la poser sur le disque. La présence d oxydase entraînera une coloration violette. Streptococcus pneumoniae est oxydase négative. Test à la bile-esculine

3 Ce milieu est destiné à l isolement sélectif et à la différenciation des Streptocoques D pour lesquels la tolérance à la bile et à l hydrolyse de l esculine est considérée comme des caractères constants. Si le milieu ne change pas de couleur, la bile-esculine est négative. Mais si on observe un pigment noir, le test est positif. Streptococcus pneumoniae est bile-esculine négative. Test de lyse par les sels biliaires Les colonies de Streptococcus pneumoniae sont «dissoutes» ou lysées en 30 min en présence d une suspension de bile. Le rôle de la bile sur les bactéries peut être rapporté à celui des sels de sodium d acides organiques. Le desoxycholate de sodium à 10% agit comme la bile sur les bactéries. Une ou deux gouttes d une solution de desoxycholate de sodium à 10%sont déposées sur une colonie alpha hémolytique. La boîte de Pétri a été incubée à l étuve à 35 C pendant deux heures avec le couvercle légèrement entrouvert pour favoriser l évaporation du réactif. L examen de l endroit où le réactif déposé a été réalisé au bout de deux heures afin de rechercher la présence ou la lyse de colonies présumées de Streptococcus pneumoniae. L hémolyse alpha-viridans demeure mais la colonie disparaît. NB : La sensibilité à l optochine et la lyse par les sels biliaires sont spécifiques des pneumocoques. Test de sensibilité à l optochine Streptococcus pneumoniae est sensible à l optochine (chlorhydrate d ethylhydrocupreine), alors que les autres streptocoques et en particulier les streptocoques non groupables alpha hémolytiques ne le sont pas. Une suspension du germe isolé a été inondée sur une boîte de gélose au sang. Après séchage, un disque d optochine a été appliqué à l aide d une pince à la surface de la gélose. L incubation se fera à 35 C en atmosphère enrichi de CO2 pendant 18 heures au bout desquelles la présence ou non de zone d inhibition matérialisée par un halo clair a été recherchée et le diamètre a été mesuré.

4 Pour les pneumocoques, une zone d inhibition supérieure à 14 mm sera alors que les autres streptocoques ne seront pas inhibés. Si le diamètre est inférieur à 14 mm, des tests complémentaires sont effectués. Test d agglutination au latex (Slidex pneumo kit) Le Slidex pneumo-kit est un test d'identification rapide de S. pneumoniae par agglutination de particules de latex. Les antigènes capsulaires sont identifiés en utilisant des particules de latex sensibilisées par des groupes spécifiques d'anticorps anti-pneumocoque. On note la formation d'agrégats visibles lorsque les particules de latex réagissent avec les antigènes. Le latex reste en suspension en cas d'absence d'antigènes. Sur deux cercles différents d'une carte d'agglutination, une goutte d'eau physiologique a été déposée. A l'aide d'une anse de platine, quelques colonies prélevées ont été mises en suspension dans l'eau physiologique de manière à obtenir dans chaque cercle une suspension opalescente. - dans le premier cercle une goutte de latex anti-s.pneumoniae (R1) a été, déposé, et dans le second cercle une goutte de latex témoin (R2), - la carte a été soumise à un mouvement rotatif pendant deux minutes au maximum après avoir homogénéisé le contenu de chaque cercle à l'aide de deux bâtonnets différents. Une réaction positive se traduit par une agglutination visible en deux minutes dans le cercle contenant le réactif R1. Microméthode d identification Nous avons eu à utiliser des microplaques CSB streptocoques comme test de confirmation. Les galeries CSB streptocoques permettent la mise en évidence d activités enzymatiques ou d assimilation de substrats carbonés en milieu approprié (fermentation) ou hostile. Les microplaques sont ensemencées avec un inoculum qui reconstitue le milieu. Après incubation, la lecture est effectuée directement ou après addition de réactifs de révélation. La lecture des réactions est faite à l aide d un tableau de lecture microplaque CSB system. Principe

5 Il s agit d une méthode miniaturisée qui comporte 15 tests biochimiques permettant la mise en évidence d activités enzymatiques, de la fermentation des sucres et de la croissance en milieu hostile. Avec ces tests il permet de faire un diagnostic de groupe ou d espèces de Streptocoques (non groupables) Ces microplaques renfermant des substrats déshydratés qui sont ensemencées avec un inoculum qui reconstitue le milieu. Après incubation, la lecture des réactions est effectuée directement (virage de l indicateur coloré utilisé) ou après addition de réactifs de révélation. Technique o Préparation de l inoculum La suspension bactérienne est préparée en délayant des colonies bien isolées dans 1 ml d eau physiologique par écouvillonnage. La turbidité de la suspension est ajustée à l échelle 4 de l étalon standard de Mac Farland. o Ensemencement et incubation - Nous avons distribué 100 µl d inoculum bactérien par microcupule de VP à BHS. - Nous avons versé le reste de la suspension bactérienne dans 1 ml de MEVAG STREPTO. - Nous avons ensemencé les cupules de ARA à GLY avec le MEVAG STREPTO ainsi inoculé (3 à 4 gouttes). - Les cupules ADH et tous les sucres sont fermés avec 2 gouttes d huile de paraffine. - Les plaques sont incubées à 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau pendant 24H. Résultat La lecture repose sur le changement de la coloration initiale des différents milieux. Pour la plupart des milieux, la lecture s est faite directement, par contre pour d autres, elle a nécessitée l addition de réactifs. La lecture des caractères est faite sur une fiche de lecture et l identification est rendue possible grâce à l utilisation du tableau d identification.

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