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1 LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES EN CANCEROLOGIE HUMAINE Dr Donatien MOUKASSA Département d histo-embryologie et d anatomie pathologique, FSS, UMNG EPU, Fondation Congolaise en Recherche Médicale, 5 Mars 2011

2 Introduction PLAN DE L EXPOSE I. Rappels historiques II. Bases fondamentales III. Outils méthodologiques IV. Applications en pathologie tumorale maligne 1. Intérêt 2. Types de description V. V- Contraintes et difficultés VI. VI- Perspectives d avenir Conclusion

3 INTRODUCTION (1) Maladie cancéreuse (a) Démarche médicale Prévention primaire / secondaire Dépistage Diagnostic de certitude Stade évolutif Pronostic Adaptation thérapeutique

4 INTRODUCTION (2) Maladie cancéreuse (b) Outils scientifiques Cliniques (observation) Para-cliniques (techniques complémentaires) Morphologiques Biologiques +++ Radiologiques

5 INTRODUCTION (3) Maladie cancéreuse (c) Outils scientifiques Techniques de biologie moléculaire 20 dernières années Approches» Prévention adaptation thérapeutique Place importante: démarche médicale Exemples:» 90%: diagnostic des LMNH» 80-90%: adaptation thérapeutique, cancers du sein» 60-75%: prévention primaire, dépistage CCU

6 RAPPELS HISTORIQUES (1) MÉDECINE DANS L ANTIQUITÉ Hippocrate V e siècle av. J.-C.. Notion de «CANCER», «TUMEUR» «doigts en baguette de tambour» = hippocratisme digital Cancer du poumon

7 RAPPELS HISTORIQUES (2) MÉDECINE EN ÉGYPTE ANTIQUE Papyrus Ebers XVI e siècle av. J.-C. 1 er document Description des tumeurs

8 RAPPELS HISTORIQUES (4) 1676 Antoni van Leeuwenhoek Découverte microscope 1865 Gregor Mendel ( ) Transmission des caractères génétiques, Lois de Mendel. Claude Bernard ( ) Introduction à l'étude de la médecine expérimentale (ouvrage)

9 +++ XX e siècle RAPPELS HISTORIQUES (5) Médecine fondée sur les preuves, Avancées technologiques Immunologie Immunohistochimie +++ Génétique Génétique moléculaire+++ Cancérologie Expérimentale +++ Biologie moléculaire.

10 RAPPELS HISTORIQUES (6) DECOUVERTES SCIENTIFIQUES ADN: Structure 1949 Enders Techniques de cultures cellulaires 1953 Crick et Watson Découverte, structure de l ADN Bases+++ Biologie moléculaire, Génétique moderne

11 1960 RAPPELS HISTORIQUES (7) Méthodes d'immunomarquage Anticorps monoclonaux 1985 Saïki RK Techniques d'amplification génomique Science 1985; 230 : Méthodes de biologie moléculaire +++ Diagnostic viral, Diagnostic des cancers.

12 BASES FONDAMENTALES (1) Génomes humains Cellules humaines: Acides nucléiques : support, information génétique Acide Désoxyribo-Nucléique (ADN) Acide Ribo-Nucléique (ARN) Génomes tumoraux Cellules tumorales Acides nucléiques: altérations moléculaires Différenciation cellulaire Maturation cellulaire Division cellulaire (apoptose) Patrimoine génétique: fonction physiologique+++

13 BASES FONDAMENTALES (2) ADN Bicaténaire Structure: Double hélice Brin = enchaînement de désoxyribonucléotides: Une base purique (Adénine: A, Guanine: G) Une base pyrimidique (Cytosine: C, Thymine: T) Les brins Dissociables par dénaturation (par la chaleur) Réassocient par hybridation = 2 phases majeures utilisées en biologie moléculaire. STRUCTURE

14 BASES FONDAMENTALES (3) ARN Monocaténaire Structure des brins Analogue à celle de l'adn Uracile à la place de la Thymine Peut être copié en ADN monobrin Une enzyme = Transcriptase inverse (reverse transcriptase ou RT)

15 OUTILS METHODOLOGIQUES (1) «Process» technique (a) Étapes: Étape 1: Extraction des ADN et ARN, Découpage, Séparation et analyse fragmentaire, Séquençage Étape 2: Mise en évidence qualitative ou quantitative de fragments soigneusement choisis

16 OUTILS METHODOLOGIQUES (2) «Process» technique (b) L'extraction Moyens: Biochimique: Mini-colonnes chargées négativement» Fixation-élution ADN (Quiagen, HC2). Suspension de poudre de verre Phénol + chloroforme ou éther + alcool concentré. Lyse enzymatique Chauffage

17 OUTILS METHODOLOGIQUES (3) «Process» technique (c) Le découpage Les enzymes-outils = Enzymes de restriction Endonucléases d'origine bactérienne:» Dnases,» Et, RNases Coupure au niveau de séquences spécifiques. Fragments obtenus: Petite taille, Analyse facile.

18 OUTILS METHODOLOGIQUES (4) «Process» technique (d) La séparation et analyse fragmentaire Mises en œuvre par électrophorèse : En gel de polyacrylamide de 3,5 à 15 % Fragments de 20 à pb En gel d'agarose de 0,6 à 1,5 % Fragments de 0,2 à 20 kb. Variante: électrophorèse en champ pulsé Fragments d'adn supérieurs à 50 kb.

19 OUTILS METHODOLOGIQUES (5) «Process» technique (e) Les sondes spécifiques ou amorces Oligonucléotides de synthèse = Fragments d'adn de moins de 100 bases Marquage: repérage et sa quantification. Marquage au 32 P Marquage à la biotine

20 OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Les différentes techniques L'hybridation moléculaire Hybridation in situ L amplification génique ou enzymatique PCR in situ, nichée ou multiplex La quantification des acides nucléiques PCR, RT-PCR quantitative Le génotypage

21 OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Prétraitements techniques (a) Types d échantillons biologiques Prélèvements cellulaires Suspensions cellulaires Frottis (cytobrosse cervico-utérine) Cytoponction l aiguille fine Écoulement mammaire Prélèvements tissulaires Biopsies Pièces opératoires Pièces autopsiques

22 OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Prétraitements techniques (b) Conditionnement des échantillons biologiques Mode de fixation État frais +++ Cryoconservation (-20 C, -80 C) Azote liquide Formol tamponné à 10% + inclusion en paraffine Glutaraldéhyde Milieu de transport: STM, EasyPrep Choix des sondes, des amorces et/ou de la technique

23 CASSETTE D INCLUSION, FIXATION, F10%

24 CANCER DU SEIN: CRYOCONSERVATION, CRYOSTAT

25 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques L'hybridation moléculaire Complémentarité des bases nucléotidiques ADN / ARN Techniques : Hybridation sur tâche ou dot-blot Directement sur l'échantillon déposé sur un filtre Southern-blot (ADN) Northern-blot (ARN) L'hybridation en milieu liquide FISH (fluorescence +++)

26 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques L'hybridation moléculaire L'hybridation in situ +++ Sur coupes tissulaires ou sur cellules fixées+++ Morphologie + localisation, Sonde de 50 bases environ.

27 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques L'amplification enzymatique ou génique La Polymerase Chain Reaction (PCR) Technique la plus utilisée Types: Nested-PCR (PCR nichée) Semi-nested PCR, PCR multiplex Autres

28 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques L'amplification enzymatique ou génique La technique de l'adn branché Concept différent : Au lieu d'amplifier la cible, c'est le signal qui est amplifié

29 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques La quantification des acides nucléiques PCR quantitative Compétition avec standard interne pour les ARN consiste à amplifier simultanément avec les mêmes amorces.

30 Le génotypage OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques Fragment génomique isolé par PCR ou RT-PCR. Protocoles utilisables : PCR spécifique de type Une région choisie + amorce universelle + amorce typespécifique PCR universelle Amplification avec des amorces universelles

31 OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques Les techniques des biopuces à ADN (microarrays) Technique nouvelle +++ Déterminer les profils d expression de groupes tumoraux homogènes / tissus contrôles Indication: But: Tumeurs malignes+++ Classification tumorale / profils d expression

32 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (1) Schématiquement: La pathogénie tumorale ou oncogenèse Les marqueurs génétiques de susceptibilité et de clonalité Les classifications moléculaires Le pronostic clinique La prédiction thérapeutique

33 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (2) La pathogénie tumorale ou oncogenèse Utilisation de la technique de microarray Identification de gènes Tissus tumoraux/tissus normaux Processus tumoral (bases) Intégration virale HPV CCU LNH à GC B VIH CHC VHB (P Wattré et al., 1997) Altérations génomiques Oncogènes / anti-oncogènes Évaluation de la progression tumorale.

34 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (3) Marqueurs génétiques de susceptibilité et de clonalité Exemples: Cancer du sein 2 gènes majeurs de susceptibilité au cancer :» BRCA1,» BRCA2 Syndromes Prédisposition Héréditaire» %: Lymphome folliculaire Translocation (14;18) = marqueur de clonalité (PCR)

35 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (4) Les classifications moléculaires Utilisation des biopuces (microarrays) Les cancers du sein : 4 classes tumorales statut RH, Her2, grade histologique Tumeurs du sein basal-like, Tumeurs amplifiées pour le gène ERBB2 (HER2), Tumeurs luminales A, Tumeurs luminales B. Les lymphomes non hodgkiniens Lymphomes folliculaires LMH EBV induits: Burkitt +++

36 HER2 +, HIS CARCINOME CANALAIRE INVASIF: RO+, RP+, Her2+

37 CANCER DU SEIN, FISH: DOUBLE MARQUAGE, RP, RO

38 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (4) Les classifications moléculaires Sarcomes (JM Coindre et al., 2010) Hétérogènes Classification complexe et peu reproductible. Classification moléculaire: Sarcomes avec translocation spécifique Sarcomes avec un profil génomique simple Liposarcomes bien différenciés, Liposarcomes dédifférenciés Sarcomes intimaux (gènes MDM2, CDK4) Sarcomes avec une mutation activatrice Environ 90 %: GIST,» Mutation d'un gène codant pour un récepteur à activité tyrosinekinase (c-kit, CD117).

39 Sarcome d Ewing Humérus Sarcome synovial Cubitus

40 Deux sarcomes à morphologie similaire Lequel est le Sarcome d Ewing? JM Coindre et al. Sarcome de Ewing Sarcome synovial peu différencié translocation (11,22) (q24;q12) translocation (X;18) (p11;q11)

41 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (5) Le pronostic clinique Biopuces d expression+++ HIS, PCR Signatures moléculaires Évolution clinique précise Parfois > critères habituellement utilisés Lymphomes non hodgkiniens Détection de la maladie résiduelle / PCR» Lymphomes folliculaires (G Delsol et al., 1998) Réarrangement du gène TCR: lymphomes T

42 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (6) Le pronostic clinique Utilisation des techniques d hybridation Signatures moléculaires: expression protéique (IHC) Cancer du col de l utérus HPV HR 16 et/ou 33 et/ou 45 (D Moukassa et al., 2010, en cours)» Hybrid Capture 2 Cancer colorectal Gène MUC4/MUC2 (D Moukassa et al., 2011)

43 CARCINOME DU COL UTÉRIN, HIS, HPV 16 +

44 APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (7) La prédiction thérapeutique Signature d expression génique de prédiction Exemple: Réponse à la chimiothérapie Restrictif Cancer du sein (hormono-sensibles) Cancer de la prostate (hormono-sensibles) Environnement tumoral Cellulaire (stroma entourant la tumeur), Organique (caractéristiques de la cellule hôte) Études de la sensibilité des tumeurs Chimiothérapie préopératoire (néo-adjuvante)

45 CONTRAINTES ET DIFFICULTES Compétence technique Réactualisation des connaissances Appropriation du procédé technique Plateau technique Lourd Cher Maintenance Approvisionnement Réactifs Fournisseurs

46 PERSPECTIVES D AVENIR Intégration des techniques de biologie moléculaire dans la pratique quotidienne en milieu hospitalier Diagnostic de certitude des cancers, Pronostic et suivi de la maladie cancéreuse, Adaptation et orientation thérapeutiques Intégration dans les curricula universitaires Formation traditionnelle (CM, ED, TP) Diplôme complémentaire (DU, CU )

47 CONCLUSION Avancées technologiques: PEC globale de la maladie cancéreuse Biologie moléculaire+++ Caractérisation du profil moléculaire Techniques adaptées Hybridation, amplification génomique, génotypage Coûts élevés = frein modernisation des plateaux techniques, PEV Réactualisation des connaissances

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