Wnt5a Potentiates TGF-ß Signaling to Promote Colonic Crypt Regeneration After Tissue Injury

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1 1 Florine FONTENEAU Nawel ZERARKA Jordan MENGIN Wnt5a Potentiates TGF-ß Signaling to Promote Colonic Crypt Regeneration After Tissue Injury 03 Octobre 2012 Licence 3 Biologie Cellulaire Biologie du Développement

2 Wnt5a Potentiates TGF-ß Signaling to promote Colonic Crypt regeneration after Tissue Injury Auteurs : H. MIYOSHI R. AJIMA C.T. LUO T.P. YAMAGUCHI T.S. STAPPENBECK 2

3 Wnt5a Potentiates TGF-ß Signaling to promote Colonic Crypt regeneration after Tissue Injury Auteurs : H. MIYOSHI R. AJIMA C.T. LUO T.P. YAMAGUCHI T.S. STAPPENBECK Department of Pathology and Immunology, Washington University, School of Medecine MO63110 Cancer and Developemental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick MD21702 Developmental Genetics Group, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, Osaka

4 Wnt5a Potentiates TGF-ß Signaling to promote Colonic Crypt regeneration after Tissue Injury Auteurs : H. MIYOSHI R. AJIMA C.T. LUO T.P. YAMAGUCHI T.S. STAPPENBECK Department of Pathology and Immunology, Washington University, School of Medecine MO63110 Cancer and Developemental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick MD21702 Developmental Genetics Group, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, Osaka Publication : 6 Septembre 2012, Science Express 2

5 Contexte de publication Régénération de tissus et rétablissement de l homéostasie dépendent des cellules souches T. S. Stappenbeck, H. Miyoshi, The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science 324, 1666 (2009) R. Lanza, Ed., Essentials of Stem Cell Biology (Elsevier, San Diego, ed. 2, 2009) 3

6 Contexte de publication Régénération de tissus et rétablissement de l homéostasie dépendent des cellules souches T. S. Stappenbeck, H. Miyoshi, The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science 324, 1666 (2009) R. Lanza, Ed., Essentials of Stem Cell Biology (Elsevier, San Diego, ed. 2, 2009) Les cryptes de Lieberkühn, seraient impliquée dans la réponse à une lésion M. R. Walker, K. K. Patel, T. S. Stappenbeck, The stem cell niche. J. Pathol. 217, 169 (2009) 3

7 Contexte de publication Régénération de tissus et rétablissement de l homéostasie dépendent des cellules souches T. S. Stappenbeck, H. Miyoshi, The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science 324, 1666 (2009) R. Lanza, Ed., Essentials of Stem Cell Biology (Elsevier, San Diego, ed. 2, 2009) Les cryptes de Lieberkühn, seraient impliquée dans la réponse à une lésion M. R. Walker, K. K. Patel, T. S. Stappenbeck, The stem cell niche. J. Pathol. 217, 169 (2009) Les cryptes de Lieberkühn se renouvellent en permanence tout au long de la vie 3

8 Problématiques Dans quelles mesures les cryptes de Lieberkühn permettraient le retour à l homéostasie? 4

9 Problématiques Dans quelles mesures les cryptes de Lieberkühn permettraient le retour à l homéostasie? Quels seraient les mécanismes impliqués dans ce retour à l homéostasie? 4

10 Rappels et définitions Cellule souche : cellule indifférenciée, capable de s'auto renouveler, de se différencier en d'autres types cellulaires et de proliférer en culture. Ce 5

11 Rappels et définitions Cellule souche : cellule indifférenciée, capable de s'auto renouveler, de se différencier en d'autres types cellulaires et de proliférer en culture. Cellule épithéliale : cellule recouvrant la surface externe et les cavités internes de l organisme. Ce 5

12 Rappels et définitions Cellule souche : cellule indifférenciée, capable de s'auto renouveler, de se différencier en d'autres types cellulaires et de proliférer en culture. Cellule épithéliale : cellule recouvrant la surface externe et les cavités internes de l organisme. Ce Cellule mésenchymateuse : cellule souche multipotente donnant naissance aux tissus conjonctifs. 5

13 Rappels et définitions Cellule souche : cellule indifférenciée, capable de s'auto renouveler, de se différencier en d'autres types cellulaires et de proliférer en culture. Cellule épithéliale : cellule recouvrant la surface externe et les cavités internes de l organisme. Ce Cellule mésenchymateuse : cellule souche multipotente donnant naissance aux tissus conjonctifs. Cellule mésothéliale : cellule épithéliale plate d origine mésenchymateuse. 5

14 Rappels et définitions Cellule souche : cellule indifférenciée, capable de s'auto renouveler, de se différencier en d'autres types cellulaires et de proliférer en culture. Cellule épithéliale : cellule recouvrant la surface externe et les cavités internes de l organisme. Ce Cellule mésenchymateuse : cellule souche multipotente donnant naissance aux tissus conjonctifs. Cellule mésothéliale : cellule épithéliale plate d origine mésenchymateuse. Homéostasie : capacité que peut avoir un système quelconque à conserver son équilibre de fonctionnement en dépit des contraintes qui lui sont extérieures. 5

15 Présentation d une crypte de Lieberkühn Dessin représentatif de la partie supérieure de la paroi intestinale umontreal.ca/cabanat/bio2412/chapitre13. 6

16 Matériel d étude In vivo : - Sur un modèle murin, prélèvement d un fragment de colon de 1 mm², soit cryptes : site de blessure 7

17 Matériel d étude In vivo : - Sur un modèle murin, prélèvement d un fragment de colon de 1 mm², soit cryptes : site de blessure In vitro : - Lignage de souris - Marquages de coupe de colon prélevé - Mise en culture de cellules épithéliales - Criblage des molécules de communication cellulaire - Quantification des signaux cellulaires 7

18 Mise en évidence des cryptes de Lieberkühn Photographie d une coupe d intestin : marquage à l hématoxyline et éosine (violet) centre de la plaie canal de blessure crypte de Lieberkühn normale 8

19 Mise en évidence des cryptes de Lieberkühn Photographie d une coupe d intestin : marquage à l hématoxyline et éosine (violet) centre de la plaie canal de blessure crypte de Lieberkühn normale Observation d une première phase de régénération (0 à 4 jours) : Apparition de cellules épithéliales 8

20 D où viennent les nouvelles cellules régénérant le site de blessure?

21 Mise en évidence de la prolifération au niveau du site de blessure Hybridation in situ du marqueur de croissance Ki-67 (brun) Phase 1 : Migration de cellules épithéliales non prolifératives vers le site de blessure 9

22 Mise en évidence de la prolifération au niveau du site de blessure Hybridation in situ du marqueur de croissance Ki-67 (brun) Phase 2 : Extension de la lame basale, vers le centre de la plaie. Composée de cellules mésothéliales prolifératives. 10

23 Mise en évidence de la migration de cryptes de Lieberkühn au niveau du site de blessure Schéma de principe de la sélection Cre-Lox Chronologie de l activation Cre-Lox Seules les cellules Cre-Lox exprimeront un gène LacZ fonctionnel permettant la visualisation des cryptes de Lieberkühn 11

24 Mise en évidence de la migration de cryptes de Lieberkühn au niveau du site de blessure Photographies de l évolution d un champs microscopique de cellules Cre-Lox 12

25 Mise en évidence de la migration de cryptes de Lieberkühn au niveau du site de blessure Photographies de l évolution d un champs microscopique de cellules Cre-Lox Migration des cryptes de Lieberkühn (en bleu) vers le site de blessure, en fonction du temps 12

26 D où viennent les nouvelles cellules régénérant le site de blessure? Des cryptes de Lieberkühn adjacentes à la plaie Quels signaux permettent leurs migrations?

27 Recherche du signal cellulaire impliqué dans la migration des cryptes de Lieberkühn vers le site de blessure Criblage de différentes molécules supposées impliquées dans l activation des cryptes de Lieberkühn par RT-PCR 13

28 Recherche du signal cellulaire impliqué dans la migration des cryptes de Lieberkühn vers le site de blessure Criblage de différentes molécules supposées impliquées dans l activation des cryptes de Lieberkühn par RT-PCR Mise en évidence de la surexpression de Wnt5a au niveau du site de blessure 13

29 Recherche du signal cellulaire impliqué dans la migration des cryptes de Lieberkühn vers le site de blessure Mise en évidence de l expression de Wnt5a par RT-PCR 14

30 Recherche du signal cellulaire impliqué dans la migration des cryptes de Lieberkühn vers le site de blessure Mise en évidence de l expression de Wnt5a par RT-PCR Quantification de l expression de Wnt5a par QRT-PCR 14

31 Recherche du signal cellulaire impliqué dans la migration des cryptes de Lieberkühn vers le site de blessure Mise en évidence de l expression de Wnt5a par RT-PCR Quantification de l expression de Wnt5a par QRT-PCR Surexpression de Wnt5a au niveau du site de blessure 14

32 D où viennent les nouvelles cellules régénérant le site de blessure? Des cryptes de Lieberkühn adjacentes à la plaie Quels signaux permettent leurs migrations? La molécule impliquée est Wnt5a Quel est le mode d action de Wnta5?

33 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Site de blessure Bord de la blessure Photographie d un champs microscopique avant et après migration de cellules mésothéliales 15

34 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Site de blessure Bord de la blessure Photographie d un champs microscopique avant et après migration de cellules mésothéliales Migration de cellules mésothéliales provenant de la lame basale 15

35 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Photographies de la mise en contacte d organites cellulaire épithéliaux avec une bille imbibée de Wnt5a 16

36 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Photographies de la mise en contacte d organites cellulaire épithéliaux avec une bille imbibée de Wnt5a Wnt5a permet la formation d invaginations dans des organoïdes de cellules épithéliales 16

37 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Evaluation des invaginations intestinales avec ou sans Wnt5a 17

38 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Evaluation des invaginations intestinales avec ou sans Wnt5a Schéma de l influence de Wnt5a sur le site de blessure Phénotype normal Phénotype muté 17

39 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la régénération des cryptes de Lieberkühn Evaluation des invaginations intestinales avec ou sans Wnt5a Schéma de l influence de Wnt5a sur le site de blessure Phénotype normal Phénotype muté Wnt5a permettrait la formation d invaginations pour régénérer les cryptes de Lieberkühn 17

40 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la prolifération des cellules épithéliales 0 ng/ml 100 ng/ml 400 ng/ml 1200 ng/ml Wnt3a/Rspo1 Suivie de la croissance des organoïdes épithéliaux en fonction de la concentration en Wnt5a 18

41 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la prolifération des cellules épithéliales 0 ng/ml 100 ng/ml 400 ng/ml 1200 ng/ml Wnt3a/Rspo1 Suivie de la croissance des organoïdes épithéliaux en fonction de la concentration en Wnt5a Wnt5a inhibe la croissance des oraganoïdes épithéliaux 18

42 Mise en évidence de l action de Wnt5a sur la prolifération des cellules épithéliales 0 ng/ml 100 ng/ml 400 ng/ml 1200 ng/ml Wnt3a/Rspo1 Suivie de la croissance des organoïdes épithéliaux en fonction de la concentration en Wnt5a Wnt5a inhibe la croissance des oraganoïdes épithéliaux Action dose dépendante 18

43 D où viennent les nouvelles cellules régénérant le site de blessure? Des cryptes de Lieberkühn adjacentes à la plaie Quels signaux permettent leurs migrations? La molécule impliquée est Wnt5a Quel est le mode d action de Wnta5? Migration de cellules mésothéliales de la lame basale Formation d invaginations Inhibition de la croissance cellulaire Comment Wnt5a permet l inhibition de la prolifération?

44 Présentation de la protéine P 15INK4b P 15INK4b : - Appartient à la famille des Cdk (Kinase Cycline Dependant) 19

45 Présentation de la protéine P 15INK4b P 15INK4b : - Appartient à la famille des Cdk (Kinase Cycline Dependant) - Codée par le gène CDKN2A 19

46 Présentation de la protéine P 15INK4b P 15INK4b : - Appartient à la famille des Cdk (Kinase Cycline Dependant) - Codée par le gène CDKN2A - Expression induite par TGF-ß 19

47 Présentation de la protéine P 15INK4b P 15INK4b : - Appartient à la famille des Cdk (Kinase Cycline Dependant) - Codée par le gène CDKN2A - Expression induite par TGF-ß - Surexpression via Wnt5a 19

48 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß 20

49 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire 20

50 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire - contrôle la proliféraion et la différentciation cellulaire 20

51 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire - contrôle la proliféraion et la différentciation cellulaire - système de signalisation autocrine 20

52 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire - contrôle la proliféraion et la différentciation cellulaire - système de signalisation autocrine - 3 isoformes TGF-ß1, TGF-ß2 et TGF-ß3 20

53 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire - contrôle la proliféraion et la différentciation cellulaire - système de signalisation autocrine - 3 isoformes TGF-ß1, TGF-ß2 et TGF-ß3 - utilisation de la voie Smad 20

54 TGF-ß : - transforming growth factor Présentation de TFG-ß - cytokine poplypeptidique impliquée dans le développement cellulaire - contrôle la proliféraion et la différentciation cellulaire - système de signalisation autocrine - 3 isoformes TGF-ß1, TGF-ß2 et TGF-ß3 - utilisation de la voie Smad Schéma simplifié de l action de TGF-ß 20

55 Action de Wnt5a synchrone à celle de TGF-ß Mise en évidence de la présence de P-Smad3 avec Wnt5a et TGF-ß par fluorescence 21

56 Action de Wnt5a synchrone à celle de TGF-ß Mise en évidence de la présence de P-Smad3 avec Wnt5a et TGF-ß par fluorescence Wnt5a et TGF-ß sont liés l un à l autre 21

57 Action de Wnt5a synchrone à celle de TGF-ß Distribution de p-smad3 dans les souris Wnt5a et celles Wnt5aKO Perte de l'expression de Wnt5a et donc pas de p-smad3, chez lignée Wnt5a Ko 22

58 Action de Wnt5a synchrone à celle de TGF-ß Distribution de p-smad3 dans les souris Wnt5a et celles Wnt5aKO Perte de l'expression de Wnt5a et donc pas de p-smad3, chez lignée Wnt5a Ko p-smad3 est impliqué dans la voie de signalisation de TGFß 22

59 Action de Wnt5a synchrone à celle de TGF-ß Distribution de p-smad3 dans les souris Wnt5a et celles Wnt5aKO Perte de l'expression de Wnt5a et donc pas de p-smad3, chez lignée Wnt5a Ko p-smad3 est impliqué dans la voie de signalisation de TGFß TGF-ß est nécessaire à l'expression de Wnt5a 22

60 D où viennent les nouvelles cellules régénérant le site de blessure? Des cryptes de Lieberkühn adjacentes à la plaie Quels signaux permettent leurs migrations? La molécule impliquée est Wnt5a Quel est le mode d action de Wnta5? Migration de cellules mésothéliales de la lame basale Formation d invaginations Inhibition de la croissance cellulaire Comment Wnt5a permet l inhibition de la prolifération? Contrôle de la prolifération cellulaire par TGF-ß

61 Bilan de la réponse à une lésion intestinale Lésion de l épithélium activation d une crypte de Lieberkühn 23

62 Bilan de la réponse à une lésion intestinale Lésion de l épithélium activation d une crypte de Lieberkühn Comblement du site de blessure par des cellules épithéliales. 23

63 Bilan de la réponse à une lésion intestinale Lésion de l épithélium activation d une crypte de Lieberkühn Comblement du site de blessure par des cellules épithéliales. Convergence des cryptes de Lieberkühn voisines vers le site de blessure par migration, par l action de Wnt5a et TGFβ 23

64 Bilan de la réponse à une lésion intestinale Lésion de l épithélium activation d une crypte de Lieberkühn Comblement du site de blessure par des cellules épithéliales Convergence des cryptes de Lieberkühn voisines vers le site de blessure par migration, par l action de Wnt5a et TGFβ Prolifération de néocryptes de Lieberkühn et invagination de la membrane intestinale 23

65 Bilan de la réponse à une lésion intestinale Lésion de l épithélium activation d une crypte de Lieberkühn Comblement du site de blessure par des cellules épithéliales Convergence des cryptes de Lieberkühn voisines vers le site de blessure par migration, par l action de Wnt5a et TGFβ Prolifération de néocryptes de Lieberkühn et invagination de la membrane intestinale Comblement de la blessure 23

66 Ouverture et limite de l article Ouvertures : - Mécanisme de réparation présent dans d autres tissus de l organisme (ex: follicule pileux qui utilisent des membres de la famille Wnt) Merci de votre attention 24

67 Ouverture et limite de l article Ouvertures : - Mécanisme de réparation présent dans d autres tissus de l organisme (ex: follicule pileux qui utilisent des membres de la famille Wnt) Merci de votre attention - Mécanisme impliqué dans le développement fœtal 24

68 Ouverture et limite de l article Ouvertures : - Mécanisme de réparation présent dans d autres tissus de l organisme (ex: follicule pileux qui utilisent des membres de la famille Wnt) Merci de votre attention - Mécanisme impliqué dans le développement fœtal Limite : - Les mécanismes des liens entre TFG-ß et Wnt5a ne sont pas encore très clairs. 24

69 Merci de votre attention 25