BIO-FLASH. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n Lliçà d Amunt - Barcelona - SPAIN
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- Jules Pagé
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1 LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS BIO-FLASH anti-hbc tests BIO-FLASH anti-hbc est un immunoessai chimiluminescent en deux étapes, entièrement automatisé, destiné à la détermination qualitative des anticorps totaux contre l antigène du core de l hépatite B (anti-hbc) dans le sérum ou le plasma humain au moyen de l instrument BIO-FLASH. Sommaire L'hépatite B est une infection du foie produite par le virus de l'hépatite B (HBV) qui représente un problème majeur de santé mondiale. Il provoque un certain nombre de maladies du foie, allant de l'hépatite aiguë et chronique à la cirrhose et au cancer primitif du foie. Les maladies causées par le HBV ont une distribution mondiale. Il est estimé qu'environ un tiers de la population mondiale a été infecté par le HBV. Parmi eux, environ 350 millions de personnes sont chroniquement infectées et à risque de maladie grave et de décès, principalement de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. L infection par le HBV varie considérablement dans les différentes zones géographiques, et la prévalence du HBV chronique peut varier de 0,2 à 15%. Les principaux modes de transmission du HBV sont l'exposition périnatale par une mère infectée, horizontale, parentérale et sexuelle, et le taux relatif de ceux-ci varient à travers le monde. La transmission parentérale et sexuelle prédomine dans les pays industrialisés, tandis que la transmission horizontale et périnatale prédomine dans les pays en développement. 1, 2 Au cours de l'infection virale, plusieurs marqueurs sérologiques apparaissent. L un de ces marqueurs est l'anti-hbc. L'antigène du core de l'hépatite B (HBcAg) est un composant interne du virus, qui est antigéniquement différent de l'antigène de surface de l'hépatite B HBs Ag). Le système d antigène-anticorps HBcAg/anti-HBc a été décrit par Almeida et coll. 3 en Les anticorps anti-hbc peuvent généralement être détectés dans le sang peu après la détection de l'antigène HBs et avant l'apparition de l'hépatite cliniquement apparente. Dans l'hépatite B aiguë avec récupération, l anti-hbc est le seul marqueur sérologique de l'infection dans la période entre la disparition de l'hbsag et l'apparition des anticorps anti-hbs. Les anticorps anti-hbc peuvent persister toute la vie, tandis que les anti-hbs peuvent devenir négatifs chez certains patients. Dans l'hépatite B chronique, l'anti-hbc est détecté avec l HBsAg, mais chez certaines personnes cet antigène peut devenir indétectable. Les dons de sang prélevés lorsque l anticorps anti-hbc est le seul marqueur sérologique de l'hépatite B peuvent être infectieux 4 ; en outre, il a été suggéré que le dépistage des anticorps anti-hbc, ainsi que de l'hbsag, pourrait réduire davantage l'incidence de l'hépatite B post-transfusionnelle 5. En effet, le dépistage des anti-hbc des dons de sang est obligatoire dans plusieurs pays. La mesure des anticorps anti-hbc, HBsAg et anti-hbs est recommandée dans le cas des patients immunodéprimés, tels que les personnes séropositives du VIH et les personnes immunosupprimées, en raison de l'augmentation du risque de réactivation d'hépatite B. 6 D'autre part, le dépistage des anticorps anti-hbc doit également être effectué sur une personne avant l'administration du vaccin de l hépatite B pour connaître le statut immunitaire afin de vacciner uniquement les individus négatifs a l'anti-hbc. Principe Lorsque les microparticules paramagnétiques et le tampon d'essai BIO-FLASH anti-hbc sont mélangés et incubées avec l échantillon, si des anticorps spécifiques anti-hbc sont présents dans celui-ci, ces anticorps se lient à l'antigène HBc qui recouvre les microparticules. Après une séparation magnétique et un lavage afin d éliminer l échantillon résiduel, on ajoute un traceur consistant en un anticorps IgG anti-hbc de lapin marqué à l isoluminol qui peut rejoindre l'antigène HBc qui couvre les microparticules. Après une seconde incubation, une séparation magnétique et un autre lavage, les réactifs activant la réaction chimiluminescente sont ajoutés. Le luminomètre du BIO-FLASH mesure la lumière émise exprimée en unités relatives de lumière (URL) qui sont inversement proportionnelles à la concentration d anti-hbc de l échantillon. Le BIO-FLASH utilise une méthode de réduction de données avec un ajustement à une courbe logistique de 4 paramètres (4PLC) afin de générer une courbe maîtresse d étalonnage (CME). Cette courbe est fournie prédéfinie, dépend du lot et est enregistrée dans l instrument dans le code-barres de la cartouche. Grâce à la mesure des calibrateurs (fournis dans un kit à part), la CME prédéfinie se transforme en une nouvelle courbe d étalonnage de travail (CET) spécifique à l instrument. Les concentrations des calibrateurs sont enregistrées dans les codes-barres des tubes des calibrateurs.
2 Schéma de la réaction : Activateurs (Triggers) URL Particule magnétique Échantillon Traceur Émission de lumière Composants Cartouche de réactifs Le kit BIO-FLASH anti-hbc contient une cartouche de réactifs pour 100 déterminations (REF ). Remarque : la conception de la cartouche est protégée par un brevet (US D565,741 / Conception CE ) Composition de la cartouche de réactifs : La cartouche comprend 4 fioles contenant : A. 1 fiole cylindrique de suspension de microparticules recouvertes avec antigène HBc recombinant. Contient < 0,1 % d azide de sodium. B. 1 fiole de tampon d essai. C. 1 fiole opaque d un traceur consistant en un anticorps IgG de lapin anti-hbc marqué à l isoluminol. Contient < 0,1 % d azide de sodium. D. 1 fiole vide. Préparation Voir la figure ci-dessous. Cartouche : les microparticules sédimentent pendant leur transport et leur stockage, par conséquent, il convient de les mélanger afin de les remettre en suspension. Lors de la première utilisation de la cartouche, retournez-la doucement 30 fois en veillant à éviter la formation de mousse (les bulles d air peuvent altérer la lecture des capteurs de liquide de l instrument). Vérifiez que les microparticules soient complètement remises en suspension. Si ce n est pas le cas, continuez à retourner la cartouche jusqu à la remise en suspension complète. NE PAS UTILISER LA CARTOUCHE si les microparticules ne sont pas remises en suspension ou en cas de rupture de la bande qui scelle les réactifs. Une fois les microparticules remises en suspension, placez la cartouche sur une surface solide et retirez avec prudence la languette rouge de sécurité pour le transport. Tout en maintenant la cartouche sur la surface solide, appuyez sur les deux languettes situées de part et d autre du bouchon perforateur (partie grise) et appuyez sur la partie supérieure de la cartouche jusqu à atteindre la position de blocage. Une fois la cartouche en position de blocage, les languettes doivent rester invisibles. Ne retournez pas la cartouche ouverte. Laissez reposer la cartouche pendant 5 minutes avant de l insérer dans l instrument. Une fois la cartouche insérée, l instrument mélange son contenu de façon automatique à des intervalles réguliers.
3 Précautions Les réactifs BIO-FLASH sont destinés à un usage diagnostique IN VITRO. Utilisation réservée aux professionnels. L azide de sodium peut réagir avec les canalisations et les tuyaux d écoulement en plomb ou en cuivre, provoquant la formation d azides métalliques fortement explosifs. Lors de l élimination des restes de réactifs, laissez couler l eau abondamment. ATTENTION : MATIÈRE PRÉSENTANT UN RISQUE BIOLOGIQUE. Jetez toutes les matières utilisées dans des récipients destinés aux biocontaminants. Veuillez ne pas réutiliser ou réintroduire des réactifs dans les cartouches ou fioles. Prélèvement et conservation des échantillons Utilisez du sérum frais (des tubes contenant du gel séparateur de sérum peuvent aussi être utilisés) ou du plasma (EDTA, Li-héparine, Na-héparine, Na-Citrate et ACD). D autres anticoagulants doivent être vérifiés avant utilisation. Les échantillons ne doivent pas être inactivés par la chaleur. Les particules en suspension doivent être retirées par centrifugation. Les directives CLSI H18-A3 et H21-A5 offrent des informations supplémentaires sur la manipulation, le transport, le traitement et la conservation des échantillons. Sérum Les échantillons de sérum peuvent être stockés à une température comprise entre 2 et 8 C pendant 8 jours. Pour une période de temps plus longue, ils doivent être congelés à une température égale ou inférieure à -20 C. Les échantillons ne peuvent pas être congelés/décongelés plus de 3 fois. Bien mélanger après décongélation. Assurezvous de l absence de bulles d air dans les échantillons et, dans le cas contraire, retirez-les totalement avant de procéder à l analyse. Plasma Les échantillons de plasma peuvent être stockés à une température comprise entre 2 et 8 C pendant 8 jours. Pour une période de temps plus longue, ils doivent être congelés à une température égale ou inférieure à -20 C. Décongelez le plasma à 37 C. Ne décongelez les échantillons qu une seule fois. Bien mélanger après décongélation. Assurez-vous de l absence de bulles d air dans les échantillons et, dans le cas contraire, retirez-les totalement avant de procéder à l analyse. Volume d échantillon Le volume d échantillon nécessaire pour réaliser un seul test avec BIO-FLASH anti-hbc varie en fonction du type de récipient utilisé. Un essai nécessite au moins 100 µl plus le volume mort, qui correspond à 200 µl si la coupelle à échantillon recommandée est utilisée (REF ). Autres matériels Les matériels suivants ne sont pas fournis avec la cartouche de réactifs et doivent être achetés séparément. REF REF BIO-FLASH anti-hbc Calibrators (Calibrateurs) BIO-FLASH anti-hbc Controls (Contrôles) Pour de plus amples informations, veuillez lire attentivement les instructions correspondantes.
4 N utilisez pas d autres calibrateurs. Les informations requises par l instrument BIO-FLASH pour étalonner l essai BIO-FLASH anti-hbc sont enregistrées dans les codes-barres des fioles. L utilisation de contrôles d autres fabricants peut provoquer des résultats inattendus. Assurez-vous que l instrument BIO-FLASH possède une quantité suffisante des consommables suivants, avant le traitement des échantillons, calibrateurs ou contrôles : REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvettes) Remarque : la conception des cuvettes est protégée par un brevet (US D560,816/Conception CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Activateurs) REF BIO-FLASH System Rinse (Solution du système) Instrument / réalisation de l essai Vous trouverez les instructions complètes pour réaliser l essai dans le manuel d utilisation du BIO-FLASH. Étalonnage Le code-barres de la cartouche contient une courbe maîtresse d étalonnage (CME) valable pour le lot de réactifs. Néanmoins, tous les réactifs requièrent une courbe d étalonnage de travail (CET), qui est spécifique à chaque lot et valable jusqu à la date de péremption de celui-ci. Une nouvelle CET doit être obtenue lorsque les résultats des contrôles sont en dehors des limites de l intervalle d acceptabilité ou lorsque des ajustements de l instrument ont été réalisés. Veuillez lire attentivement le manuel d utilisation du BIO-FLASH afin de configurer une CET. Contrôle de qualité Afin de réaliser un programme complet de contrôle de la qualité, deux niveaux de contrôle sont recommandés. Les contrôles BIO-FLASH anti-hbc négatif et positif ont été conçus pour ce programme. Les contrôles doivent être analysés au moins toutes les 24 heures par jour d utilisation. Assurez-vous que les résultats des contrôles sont dans les limites de l intervalle d acceptabilité car, si ce n est pas le cas, il peut s agir de résultats non valables, face auxquels l utilisateur devra prendre des mesures correctives. Dans ce cas, vérifiez tous les résultats obtenus depuis la dernière vérification de contrôle de qualité acceptable de l analyte concerné. Il peut être nécessaire de réétalonner l instrument. Vous trouverez de plus amples informations dans le manuel d utilisation de l instrument. Afin d identifier et de résoudre des situations de contrôle de qualité anormales, consultez Westgard et al. 7 Conservation et stabilité Les réactifs n ayant pas été ouverts restent stables jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette de la cartouche à condition qu ils soient stockés à une température comprise entre 2 et 8 C en position verticale. Après ouverture, la stabilité de la cartouche chargée dans l instrument BIO-FLASH ou stockée à une température comprise entre 2 et 8 C est de 8 semaines. Traçabilité des calibrateurs et des contrôles Les valeurs sont exprimées en UA/mL et ont été assignées par de multiples essais au moyen de l instrument BIO-FLASH en utilisant des lots spécifiques de réactifs et contre un étalon interne référencé à l étalon anti-hbc IgG de l Institut Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc). Interprétation des résultats La quantité d analyte dans chaque échantillon est déterminée à partir de la lumière émise (URL), par interpolation sur la courbe d étalonnage de travail mémorisée. Les résultats de BIO-FLASH anti-hbc sont exprimés en UA/mL. Ceci est un test qualitatif, la valeur numérique du résultat n'a qu'une valeur indicative de la quantité d'anticorps. La détermination des anti-hbc avec BIO-FLASH anti-hbc est interprétée comme suit : Les échantillons avec un résultat < 0,90 UA/mL sont considérés comme non réactifs (négatifs). Les échantillons avec un résultat 0,90 et < 1,00 UA/mL sont considérés comme non interprétables (douteux). Les échantillons avec un résultat 1,00 UA/mL sont considérés comme réactifs (positifs). Les échantillons avec un résultat initialement réactif non interprétables doivent être réanalysés deux fois. Si les deux valeurs réévaluées sont inférieures à 0,9, l essai sera finalement considéré comme négatif pour les anticorps anti-hbc. Si aucun des résultats de la seconde analyse est positif ou non interprétable, l échantillon doit être examiné de plus près avec un test supplémentaire et afin de confirmer les résultats, il convient de tenir compte d autres données, telles que, par exemple, la symptomatologie et l histoire clinique. Un résultat positif répété indique une infection par le HBV. Les échantillons ayant une concentration d anticorps anti-hbc dépasse 12,00 UA/mL sont signalés comme > 12,00.
5 Limitations Le résultat d un seul échantillon s avère insuffisant pour diagnostiquer une infection par HBV. Par conséquent, outre les résultats du BIO-FLASH anti-hbc, il convient de tenir compte d autres données, telles que, par exemple, la symptomatologie, l histoire clinique, les résultats d autres tests et toutes autres informations importantes. Un résultat négatif n'exclut pas la possibilité d'une infection par HBV. Comme dans tous les immunoessais sensibles, il est possible que des résultats positifs non reproductibles se produisent. Résultats attendus L anticorps anti-hbc est le marqueur le plus fréquent d infection par HBV et il est détecté aussi bien en infection aiguë, qu en infection chronique et infection passée avec guérison. La prévalence de l anti-hbc et d autres marqueurs de l hépatite B varie largement dans le monde, de haute (70-95%, par ex.: Afrique, Asie et Pacifique de l Ouest) à moyenne (20-55%, par ex.: Europe du Sud et de l Est) et basse (4-6%, par ex.: Europe occidentale, Amérique du Nord et parties de l Amérique du Sud). 2 La mise en œuvre des programmes de vaccination devrait réduire l'incidence de l'infection par le HBV. Caractéristiques fonctionnelles REMARQUE : les données suivantes sont représentatives ; les résultats obtenus dans des expériences isolées peuvent varier par rapport à ces données. Spécificité L évaluation de la spécificité était basée sur des tests d échantillons non choisis de sérum issus de donneurs de sang, y compris de nouveaux donneurs, et de patients hospitalisés. Un total de échantillons de sérum non choisis issus de deux Blood Bank ont été testés frais, issus de l EFS Centre Atlantique site de Tours (France) et issus de l EFS Centre EFS Nord de France de Lille (France). Les échantillons «réactifs de façon répétée» ont été réexaminés à l aide d un test supplémentaire. Ensuite, la spécificité a été calculée. Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Échantillons testés Initialement réactif (IR) Réactifs de façon répétée (RR) RR qui étaient non interprétables RR qui ont été confirmés positifs Spécificité n n n n n % Donneurs de sang ,9 Patients hospitalisés Sensibilité Un panel d'échantillons avec une positivité des anticorps anti-hbc vérifiée, provenant de différentes sources, a été testé avec BIO-FLASH anti-hbc par comparaison avec les méthodes commerciales d'eia et CLIA disponibles pour anti-hbc. Ce panel comprenait 28 échantillons frais de la même journée ( 1 jour après le prélèvement). Les résultats et la sensibilité sont présentés dans le tableau suivant : Échantillons Échantillons Méthode de référence testés réactifs Sensibilité n n % Méthode EIA Méthode CLIA Dans le cas des 403 échantillons évalués par rapport à la méthode EIA, deux échantillons se situaient dans la zone grise pour BIO-FLASH et un autre pour la méthode de référence. Pour cette raison, ces échantillons n'ont pas été pris en compte pour le calcul de la sensibilité. Sensibilité pour séroconversion Des études supplémentaires de sensibilité ont été effectuées en testant les échantillons de 3 panneaux commerciaux de séroconversion pour l hépatite B. Les résultats du BIO-FLASH anti-hbc étaient en accord avec les résultats d'autres méthodes commerciales pour tous les échantillons. Précision Conformément aux directives CLSI EP05-A2, la précision intra-essai et totale (pour chaque essai et jour après jour) a été évaluée lors de multiples essais. Le tableau ci-dessous affiche le résumé des résultats :
6 Moyenne (UA/mL) Intra-essai Totale Contrôle négatif 0,28 0,077 SD 0,094 SD Contrôle positif 2,12 4,3 % CV 5,8 % CV Proche de la valeur seuil 1,09 5,0 % CV 7,3 % CV Reproductibilité La reproductibilité a été évaluée entre les réplicats, entre les lots et entre les instruments en utilisant 50 échantillons. Le tableau ci-dessous affiche les résultats : N Co-négativité Co-positivité Réplicat 2 vs. réplicat % 100% Lot 2 vs. lot % 100% Instrument 2 vs. instrument % 100% Interférences Conformément aux directives CLSI EP7-A2, des études ont démontré que les substances suivantes potentiellement interférentes n altèrent pas les résultats du BIO-FLASH anti-hbc : Substance potentiellement interférente Concentration % Interférence Hémoglobine 500 mg/dl 10 Bilirubine indirecte 18 mg/dl 10 Bilirubine directe 18 mg/dl 10 Triglycérides 1300 mg/dl 10 Facteur rhumatoïde 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Réactivité croisée Un total de 111 échantillons positifs pour une gamme de potentiels croix-réactifs et d échantillons issus de femmes enceintes a été analysé avec BIO-FLASH anti-hbc. On considère qu un potentiel croix-réactif provoque une réactivité croisée lorsque le diagnostic passe de négatif à positif ou vice versa. Les échantillons réactifs ont été comparés à un essai de référence pour évaluer la concordance entre les tests. Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Réaction croisée potentielle Concordance ANA (anticorps antinucléaires) 5/5 anti-cmv (anticorps contre le cytomégalovirus) 6/6 anti-e. coli 12/12 anti-ebv (anticorps contre le virus Epstein-Barr) 4/4 anti-hav-igg (anticorps contre le virus de l Hépatite A) 6/6 anti-hav-igm (anticorps contre le virus de l Hépatite A) 5/5 anti-hdv IgG (anticorps contre le virus de l Hépatite D) 5/5 anti-hev (anticorps contre le virus de l Hépatite E) 4/4 anti-hiv (anticorps contre le virus de l immunodéficience humaine) 7/7 anti-hsv (anticorps contre le virus herpès simplex) 5/5 anti-rubella 10/10 anti-toxoplasma 4/4 anti-vzv (anticorps contre le virus varicelle-zona) 5/5 Concentration élevée d IgG 5/5 Concentration élevée d IgM 4/4 Mononucléose 4/4 Femme enceinte 7/7 Femme enceinte (multipare) 5/5 RF (facteur rhumatoïde) 5/5 RPR (test rapide à la réagine) 3/3
7 Limite de détection et sensibilité analytique La limite de détection (LD), déterminée conformément aux directives du CLSI EP17-A, se situe à 0,39 UA/mL. La sensibilité analytique obtenue était de 0,74 PEI U/mL. Elle a été déterminée par interpolation de la valeur seuil sur la ligne de régression obtenue par les tests de dilutions en série de l étalon anti-hbc de l'institut Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc). Selon des études internes avec BIO-FLASH anti-hbc, 1,00 PEI-U / ml est équivalente à environ 1,4 UI / ml du premier étalon international de l'oms pour l'anti-hbc (code NIBSC 95/522). Effet de prozone Le BIO-FLASH anti-hbc est un essai d inhibition de deux étapes. Le protocole d'essai comprend une étape de lavage après incubation de l'échantillon, ce qui élimine l'effet de prozone. Sur le plan expérimental, aucun effet prozone n a été observé avec un échantillon aussi élevé que 160,00 UA/mL.
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