Standardisation de l Antibiogramme en Médecine Vétérinaire 3 ème Edition Déjà édités

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1 RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTÈRE DE L AGRICULTURE MINISTÈRE DE LA SANTÉ, DE LA POPULATION ET DE LA REFORME HOSPITALIÈRE STANDARDISATION DE L'ANTIBIOGRAMME EN MÉDECINE VÉTÉRINAIRE A L'ECHELLE NATIONALE Selon les recommandations de l OMS 3ème Edition 2005

2 Déjà édités Fascicules de standardisation : 1 ère édition : ème édition : 2003 Fascicules d'évaluation : 1 ère édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : ème édition : 2004 CD ROM : «Standardisation de l antibiogramme à l échelle nationale selon les recommandations de l OMS»

3 Comité d organisation : Pr. K. RAHAL Pr. R. BELOUNI Dr. A. BENSLIMANI Dr. H. TALI MAAMAR Dr. M.F.K. MISSOUM Dr. A. ABOUN Dr. M. BOUDOUANE Institut Pasteur d Algérie. CHU Blida. EHS Dr Maouche Alger. EHS Dr Maouche Alger. Institut National de Santé Publique. Institut Pasteur d Algérie. Secteur Sanitaire El Oued. Comité de rédaction : A. ABOUN Laboratoire de Bactériologie Vétérinaire - Institut Pasteur Kouba Alger. S. BAIT Laboratoire Vétérinaire Régional de Laghouat. N. BELGUENDOUZ Laboratoire Vétérinaire Régional d El Taref. S. BENLKADI Laboratoire Central Vétérinaire El Harrach Alger. N. CHABANE SARI Laboratoire Vétérinaire Régional de Tlemcen. S. KECHIH Laboratoire Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda. N. KOUTCHOUKALI Laboratoire Vétérinaire Régional de Constantine. T. BELAZOUZ Groupe Avicole Centre Division Santé Animale et Environnement Alger M.N KORICHI EHS EL Hadi Flici Alger N. ZEMBRI -TAHRAT Institut Pasteur d Algérie F. ASSAOUS Institut Pasteur d Algérie. Collaboration technique : N. ZEMBRI - TAHRAT Institut Pasteur d Algérie. M. BOUHERAOUA Institut Pasteur d Algérie. M. BOUDOUANE Secteur Sanitaire El Oued. Secrétariat : H. SAKHI Institut Pasteur d Algérie. Corrigé par : K. RAHAL Institut Pasteur d Algérie. T. BELAZOUZ Groupe Avicole Centre Division Santé animale et Environnement Alger A. ABOUN Laboratoire de Bactériologie Vétérinaire - Institut Pasteur Kouba Alger A. BENSLIMANI EHS Dr Maouche Alger. H. TALI MAAMAR EHS Dr Maouche Alger. 3

4 Préambule La standardisation de l'antibiogramme selon les normes NCCLS (National Comittee for Clinical Laboratory Standards) recommandées par l'oms, a touché les laboratoires de médecine vétérinaire en 1999, plus tardivement que les laboratoires médicaux (1997). Certes le nombre des laboratoires vétérinaires est nettement inférieur au nombre de laboratoires médicaux mais leur impact sur la santé animale et humaine est non négligeable. Le contrôle de la qualité de l antibiogramme est pratiqué actuellement par tous les laboratoires qui de plus participent annuellement à l évaluation externe de la qualité. Nous nous sommes très tôt rendus compte que des bactéries multirésistantes (notamment aux quinolones) étaient isolées chez l'espèce aviaire. Il était par conséquent urgent d'inviter les microbiologistes vétérinaires à se pencher sur la standardisation des listes des antibiotiques à tester en fonction des germes isolés, de l'espèce animale à traiter, et de la nomenclature vétérinaire algérienne afin d orienter la prescription antibiotique. Dans la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques, il faut également tenir compte des antibiotiques prescrits à titre curatif, préventif et utilisés comme facteurs de croissance. C'est le troisième fascicule de standardisation de l'antibiogramme édité à l'intention des vétérinaires et qui est réactualisé tous les trois ans. Grâce à cette standardisation et à un logiciel "WHONET" actuellement version 5.3 (fourni par l'oms) de saisie des données, des résultats d'antibiorésistances sont édités chaque année. Cinq fascicules 2000, 2001, 2002, 2003 et 2004 ont déjà paru en Algérie. Ces résultats seront d'un apport certain dans l'orientation de la politique nationale en matière d'antibiothérapie. Pr. Kheira RAHAL 4

5 I. Introduction La standardisation de l antibiogramme en médecine vétérinaire a pris effet en Plusieurs séminaires d évaluation ont été organisés et ont abouti à des résultats préliminaires concernant l état de la résistance des bactéries aux antibiotiques en milieu vétérinaire. Les buts fixés par la standardisation en 2001 ont permis de dépister les souches bactériennes résistantes aux antibiotiques, d exploiter les données afin d instaurer une thérapeutique adéquate et par conséquent de surveiller l évolution de la résistance aux antibiotiques dans notre pays. Notons que l utilisation des antibiotiques chez l animal comme agents thérapeutiques, prophylactiques ou comme promoteurs de croissance peut entraîner une réduction de l efficacité de ces produits en médecine vétérinaire comme en médecine humaine, par suite du développement de souches résistantes. Il y a lieu de signaler que les antimicrobiens efficaces telles les fluoroquinolones et les céphalosporines ne devraient être délivrés que sur ordonnance et utilisés selon les recommandations d un vétérinaire. C est pourquoi il est essentiel que des mesures appropriées de protection de la santé publique soient établies afin de minimiser l apparition et le transfert aux humains de bactéries résistantes par l intermédiaire de la chaîne alimentaire. Malgré les problèmes rencontrés par les microbiologistes au niveau des différents laboratoires vétérinaires régionaux (à savoir le manque d information quant à la mise sur le marché de nouvelles molécules antibiotiques), quelques objectifs tracés ont été atteints à savoir : - La standardisation de l antibiogramme selon la technique NCCLS au niveau de tous les laboratoires vétérinaires. - Le dépistage rapide et correct des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. L utilisation d un réseau informatique qui sera mis en place au courant de l année 2005 permettra des échanges de données entre les laboratoires vétérinaires à l échelle nationale d où une meilleure surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques. 5

6 II. Principales pathologies microbiennes animales rencontrées en Algérie 1. Espèce Aviaire : - Colibacilloses - Salmonelloses - Staphylococcies - Streptococcies - Mycoplasmes - Coryza infectieux (Haemophilus gallinarum) - Infections vitellines/septicémie (Pseudomonas) - Pasteurelloses - Infections à Campylobacter jejuni/coli 2. Espèce Bovine, Ovine, Caprine : - Mammites - Diarrhées néonatales - Entérites chez les ovins - Affections respiratoires - Affections podales 3. Espèce Cunicole : - Salmonelloses - Colibacilloses - Pasteurelloses - Entérotoxémies (toxémie de gestation) 4. Espèce Apicole : - Loque Américaine - Loque Européenne 5. Espèce Canine et Féline : - Entérites - Otites - Affections dermatologiques 6. Espèce Equine : - Salmonelloses - Colibacilloses - Staphylococcies - Pasteurelloses - Infections à Pseudomonas 6

7 III. Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie a- A titre curatif : Bêta-lactamines Ampicilline/Amoxicilline Amoxicilline + acide clavulanique Oxacilline Penicilline Cefalexine Aminosides Streptomycine Neomycine Gentamicine Aminocyclitols Apramycine Quinolones Acide Nalidixique Acide Oxolinique Flumequine Enrofloxacine Danofloxacine Norfloxacine Glycopeptides Vancomycine Polypeptides Colistine Bacitracine Tétracyclines Tetracycline Doxycycline Oxytétracycline Sulfamides Sulfonamides Trimethoprime + Sulfamethoxazole Phénicoles Chloramphenicol Florfenicol Macrolides Tylosine Tilmicosine Erythromycine Spiramycine b- Antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance : (voir annexes page 65) Tous les antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance ne seront plus incorporés dans l alimentation animale et seront interdits d utilisation à partir de Janvier c- Liste des antibiotiques suspendus de l homologation * : Furanes : Cette famille d antibiotique est testée au laboratoire dans le cadre de l épidémiosurveillance. Chloramphenicol. * Ces 2 antibiotiques seront testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance aux antibiotiques. 7

8 IV-Pourcentages de prélèvements reçus au laboratoire par espèces animales Espèce aviaire : Représente 80% des prélèvements reçus au laboratoire. La nature des prélèvements est représentée par : Des sujets vivants tel que des reproducteurs ponte et chair, des poulets de chair, des poulettes démarrées, pondeuses ainsi que des poussins. Des œufs embryonnés, de consommation et à couver. Des organes après autopsie tel que le foie, rate, poumons, cœur, intestins et ovaires. Aliment de croissance, aliment de finition. Des écouvillons effectués sur les surfaces de bâtiments d élevage, d équipements d élevage (couvoirs, éclosoirs, incubateurs, salles de tri poussin, etc ). De la litière et des fientes. Espèce bovine, ovine et caprine : 12% des prélèvements sont reçus au laboratoire et représentés par le lait, les urines et les selles. Espèce apicole : 5% des prélèvements sont reçus au niveau du laboratoire, et sont constitués par des prélèvements du couvain. Espèce cunicole : 2% de prélèvements de cette espèce sont reçus au laboratoire et représentés par des sujets vivants et des organes issus d animaux autopsiés. Espèce canine, féline et animaux sauvages : 1% des prélèvements sont reçus au laboratoire et représentés par des organes, écouvillons divers et matières fécales. 8

9 V. Mode opératoire (Fiches techniques) 1. Fiche technique n 1 Bactéries non exigeantes Entérobactéries, P. aeruginosa, Staphylococcus sp. Enterococcus sp. et autres. Milieu : - Gélose Mueller Hinton (MH), coulée en boîtes de Pétri sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l emploi. Inoculum : - A partir d une culture pure de 18H sur milieu d isolement, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l anse dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 38) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, ou bien de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l inoculum. NB : L inoculum est dilué au 1/100 pour les molécules cefalexine et pristinamycine. Ensemencement : - Tremper un écouvillon * stérile dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Pétri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. * L écouvillon évite les contaminations du manipulateur et de la paillasse 9

10 Application des disques d antibiotiques : - Il ne faut pas mettre plus de 6 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. Les disques d antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre. - Tester la liste des antibiotiques indiqués dans les tableaux n 1, 2, 3 et 4 (pages 11, 12 et 14), selon la bactérie isolée. - Presser chaque disque d antibiotique à l aide de pinces pour s assurer de son application. Une fois appliqué le disque ne doit pas être déplacé. Incubation : - 18 heures à 35 C **. - La durée d incubation peut être prolongée dans certains cas : oxacilline, glycopeptides et aminosides. Lecture : - Mesurer avec précision *** les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse métallique, à l extérieur de la boîte fermée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture n 1, 2, 3, 4, 5, 6 (pages 50 à 55). - Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistante. NB : Souches de contrôle de qualité : Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC ** *** Température optimale de croissance Pour Proteus sp. ne pas tenir compte de la zone d envahissement 10

11 Tableau 1 : Entérobactéries : (Salmonelles, Escherichia coli, Proteus, Shigelles, Klebsielles) Liste des antibiotiques testés par espèce animale Aviaire Ruminants Animaux domestiques - Ampicilline/Amoxicilline - Ampicilline - Ampicilline/ Amoxicilline - Amoxicilline+ Acide clavulanique* - Amoxicilline+ Acide clavulanique* - Amoxicilline+ Acide clavulanique* - Ceftiofur* - Ceftiofur* - Ceftiofur* - Neomycine - Cefalexine - Gentamicine - Gentamicine - Tetracycline - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Colistine - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Colistine - Tetracycline - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Tetracycline - Flumequine** - Acide Nalidixique - Enrofloxacine - Flumequine** - Gentamicine - Enrofloxacine - Tilmicosine - Norfloxacine - Tylosine - Furanes *** - Chloramphenicol *** NB : Ceftiofur est utilisé pour la recherche de la BLSE. * ** *** Antibiotiques testés pour la recherche des BLSE ( -lactamases à spectre élargi). Molécules ayant les valeurs critiques du CA-SFM (table de lecture 12 page 61). Antibiotiques testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance aux antibiotiques. 11

12 Tableau 2 : Staphylococcus sp. Liste des antibiotiques testés par espèce animale Aviaire Ruminants Animaux domestiques - Penicilline - Penicilline - Penicilline - Oxacilline - Oxacilline - Amoxicilline+Acide clavulanique - Streptomycine - Streptomycine - Oxacilline - Neomycine - Erythromycine - Tétracycline - Gentamicine - Vancomycine - Apramycine - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Enrofloxacine - Erythromycine - Enrofloxacine - Bacitracine - Spiramycine - Tetracycline - Streptomycine - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Tétracycline - Enrofloxacine - Vancomycine - Bacitracine - Erythromycine Tableau 3 : Pseudomonas Liste des antibiotiques testés par espèce animale Aviaire Ruminants /Animaux domestiques - Colistine* - Colistine * - Amoxicilline + acide clavulanique** - Enrofloxacine - Ceftiofur** - Amoxicilline +acide clavulanique ** - Enrofloxacine - Ceftiofur ** - Gentamicine - Gentamicine * ** Molécules ayant les valeurs critiques du CA-SFM (table de lecture 12 page 61) Tous les Pseudomonas sont sensibles à la colistine. Antibiotiques testés pour la recherche des BLSE ( -lactamase à spectre élargi) 12

13 Milieu : 2. Fiche technique n 2 Streptococcus sp. - Gélose Mueller Hinton additionnée de 5% de sang de mouton, coulée en boîtes de Pétri sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l emploi. Inoculum : - A partir d une culture pure de 20 à 24H, sur gélose au sang de mouton, racler à l aide d un écouvillon * des colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l écouvillon dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 38) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15min qui suivent la préparation de l inoculum. Ensemencement : - Tremper un écouvillon stérile ** dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Pétri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. Application des disques d antibiotiques : - Il ne faut pas mettre plus de 4 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. - Les disques d antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre. - La liste des antibiotiques à tester, selon la bactérie isolée (Streptocoque), figure dans le tableau n 4 (page 14). * L utilisation de l écouvillon à la place de l anse de platine pour la préparation de la suspension bactérienne permet de prélever plus facilement les colonies ** L écouvillon évite les contaminations du manipulateur et de la paillasse 13

14 Incubation : - 20 à 24 Heures, à 35 C. - L incubation se fait sous atmosphère enrichie en CO2 (5%). - La durée d incubation peut être prolongée pour la lecture des macrolides. Lecture : - Mesurer avec précision le diamètre de la zone d inhibition de la croissance bactérienne et non pas celle de l hémolyse, à l aide d un pied à coulisse métallique, boîte ouverte et bien éclairée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture 8 page Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire, ou Résistante. La recherche des streptocoques dans les prélèvements au niveau du laboratoire repose essentiellement sur : Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae Streptococcus disgalactiae Tableau 4 : Streptococcus sp. et Enterococcus sp. Liste des antibiotiques testés par espèce animale Aviaire Ruminants Animaux domestiques - Ampicilline - Ampicilline - Ampicilline - Penicilline - Penicilline - Penicilline - Tetracycline - Erythromycine - Erythomycine - Erythromycine - Tetracycline - Tetracycline - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Trimethoprime + sulfamethoxazole - Vancomycine * - Streptomycine - Chloramphenicol ** - Enrofloxacine * Testé pour la détection de souches de sensibilité diminuée à la vancomycine ** testé dans le cadre de l epidémiosurveillance 14

15 3. Fiche d identification Haemophilus gallinarum Généralités : Haemophilus gallinarum appartient à la famille des pasteurellaceae. C est un bacille immobile non sporulé. Il est à Gram négatif et présente souvent une coloration bipolaire. A l examen microscopique on voit de petits bacilles (coccobacilles) isolés ou regroupés en courtes chaînettes. Il exige pour sa croissance le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) appelé encore facteur V. Sa culture est favorisée par une atmosphère enrichie en CO2. Caractères culturaux : Ce germe nécessite pour sa culture une gélose enrichie de facteur V.Sur gélose au sang frais : pas de culture.sur gélose au sang cuit, les colonies sont convexes, lisses et peuvent parfois être pigmentées en jaune. Il est aérobie-anaérobie facultatif. Identification biochimique : Haemophilus gallinarum possède une cytochrome oxydase, une catalase, une B- galactosidase (ONPG), une phosphatase alcaline (Pal) et il réduit les nitrates en nitrites. Fermentation des sucres : Les sucres à tester sont le galactose, maltose, mannitol, sorbitol, xylose et tréhalose. Ces sucres sont ajoutés à une concentration finale à 1% dans un millilitre d eau peptonée au rouge de phénol, enrichie avec du sérum ou de l extrait globulaire. H gallinarum fermente le galactose, le maltose, le mannitol et le tréhalose. Mise en culture des prélèvements : L isolement des Haemophilus aviaires est facilité par l envoi au laboratoire de prélèvements de poulets en pleine phase évolutive de la maladie (Coryza infectieux). Faire un écouvillonnage de l exsudat des sinus aseptiquement et ensemencer sur gélose au sang cuit incubée à 35 C pendant 24 à 48 heures sous CO 2. Liste des antibiotiques testés par espèce animale : Aviaire - Ampicilline - Tetracycline - Enrofloxacine - Cefalexine. 15

16 4. Fiche technique n 3 Haemophilus gallinarum** Milieu : Gélose HTM (Haemophilus Test Medium), coulée sur une épaisseur de 4mm. Les géloses sont séchées avant l emploi. Le Mueller Hinton au sang cuit n est pas indiqué pour l antibiogramme d Haemophilus. Inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24H, sur milieu d isolement, racler à l écouvillon * quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Décharger l écouvillon dans 5 à 10ml d eau physiologique stérile à 0,9%.Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 38) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. L ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l inoculum. Ensemencement : Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne. L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. Répéter l opération deux fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Pétri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. Application des disques d antibiotiques : Il ne faut pas mettre plus de 4 disques d antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. Les disques d antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre. Le disque d ampicilline doit être appliqué à côté du disque d amoxicilline + acide clavulanique. L observation d une synergie entre les deux disques indiquerait la présence d une pénicillinase. La liste des antibiotiques à tester figure page 15. Incubation : 18 à 24 H à 35 C, sous atmosphère enrichie en CO2 (5%). * ** L utilisation de l écouvillon à la place de l'anse de platine pour la préparation de la suspension bactérienne permet de prélever plus facilement les colonies. La recherche de -lactamase est obligatoire. 16

17 Lecture : Mesurer avec précision, les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse métallique, boîte ouverte et bien éclairée. Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture 10 page 59. Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire, ou Résistante. Attention aux inoculums trop importants, induisant des erreurs de lecture. 17

18 5. Fiche technique n 4 Recherches complémentaires obligatoires 5.1. Recherche de la résistance de Staphylococcus sp. à l oxacilline : Test de diffusion du disque de cefoxitine (30µg) Technique : La résistance des staphylocoques aux isoxazolyl pénicillines (oxacilline) est recherchée à l aide d un disque de cefoxitine (30µg) dans les conditions standards. Lecture : La lecture du diamètre d inhibition doit se faire à l aide d un pied à coulisse. Pour Staphylococcus aureus : - Si le diamètre de la cefoxitine est 19mm, la souche est dite résistante à l oxacilline. - Si le diamètre de la cefoxitine est 20mm, la souche est dite sensible à l oxacilline. Devant tout problème d interprétation, faire un test de confirmation par la technique du screening à l oxacilline (Test MRSA). (technique 5.1.2). Pour staphylococcus coagulase négative : - Si le diamètre de la cefoxitine est 24mm, la souche est dite résistante à l oxacilline. Devant tout problème d interprétation faire une détermination de la CMI à l oxacilline. (Technique page 21) Test de screening à l oxacilline pour Staphylococcus aureus : Devant tout problème d intérpretation du diamètre d inhibition de la cefoxitine faire un screening test. Ce test concerne uniquement Staphylococcus aureus. Milieu : - Gélose Mueller Hinton additionnée de 4% de NaCl, (milieu disponible à l IPA) et de 6 µg/ml d oxacilline. - La préparation de la solution d oxacilline se fait de la manière suivante : Diluer 6mg d oxacilline (poudre injectable d un flacon de 1g) dans 10ml d eau distillée stérile, puis faire une dilution au dixième. Répartir la solution obtenue à raison de 2ml par tube ; ainsi conditionnées ces solutions peuvent être conservées à -20 C pendant une semaine, au bout de laquelle elles doivent être renouvelées. - Mettre 2ml de cette solution dans une boîte de 90 mm de diamètre, ajouter 18ml de gélose Mueller Hinton additionnée de 4% de NaCl. Mélanger en faisant des mouvements rotatoires. 18

19 Inoculum : - A partir d une culture pure de 18H sur milieu d isolement, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l anse dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (page 38) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. - L inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s il est trop faible, soit de l eau physiologique stérile s il est trop fort. - L ensemencement doit se faire dans les 15 min qui suivent la préparation de l inoculum. Ensemencement : - L ensemencement se fait par spot, en appliquant verticalement sur la gélose l extrémité d un écouvillon trempé dans la suspension bactérienne (ou ensemencer un cadran en entier). - Les souches de référence doivent être testées dans les mêmes conditions. S. aureus ATCC souche sensible à l oxacilline. S. aureus ATCC souche résistante à l oxacilline. Incubation : - 24 H à 35 C en atmosphère normale. Lecture : - La culture de plus d une colonie de la souche test, suffit pour indiquer une résistance à l oxacilline, impliquant une résistance à toutes les -lactamines. (Photo A). S. aureus ATCC Souche à tester : résistante à l oxacilline S. aureus ATCC Photo A : Test de recherche de la résistance à l oxacilline chez Staphylococcus aureus. 19

20 Détection de la résistance à l oxacilline des souches de Staphylococcus sp par la mise en évidence de la PLP2 a (ou PBP2 ) : - La recherche de la PLP2a doit se faire systématiquement devant toute infection sévère à Staphylocoque sp. résistant à l oxacilline (résistance à la cefoxitine au niveau de l antibiogramme). - Pour Staphylococcus aureus isolés d infections non sévères, la recherche de la PLP2a ou du gène meca ne se fera qu après le test de screening à l oxacilline. - Pour les infections non sévères à Staphylocoques à coagulase négative, la recherche de la PLP2a ne se fera qu après la détermination de la CMI à l oxacilline (5.1.4, page 21). Il existe plusieurs réactifs commercialisés : - SLIDEX MRSA detection : BioMerieux (ref : 73117) - PBP2 test : OXOÏD (ref : DR 0900A) Principe : (BioMerieux) - Les particules de latex sensibilisées par un anticorps monoclonal dirigé contre la PBP2 vont réagir après extraction spécifiquement avec S. aureus meticillino résistant (MRSA) entraînant l apparition d une agglutination visible à l œil nu. - Les souches de S. aureus sensibles à la meticilline (MSSA) n agglutinent pas les particules de latex. Technique : Extraction : - Mettre 4 gouttes du réactif d extraction 1 dans un tube pour microcentrifugeuse. - Prélever 3 öses pleines de culture (öse calibrée de 1µl). - Décharger ces öses dans le liquide d extraction 1. - Fermer le tube à l aide d un bouchon. - Mettre ce tube dans un bain-marie bouillant à température comprise entre 95 C et 100 C pendant 3 minutes. - Retirer le tube et laisser refroidir à température ambiante. - Ajouter une goutte du second réactif d extraction puis homogénéiser la suspension. - Centrifuger à 1500 g pendant 5 mn. - L agglutination se fera à partir du surnageant. Agglutination : - Ajouter une goutte de latex sensibilisé (par un anticorps monoclonal anti-pbp2 ) dans le cercle test puis déposer 50µl du surnageant (extrait de culture). - Bien mélanger le tout à l aide d un bâtonnet, en étalant le mélange sur toute la surface. - Répéter cette technique d agglutination pour le latex contrôle négatif. 20

21 - Donner à la carte, un léger mouvement de rotation manuellement ou à l aide d un agitateur rotatif pendant 3mn. - Observation : l apparition éventuelle d une agglutination. Lecture : - Présence d agglutination : le test est positif : présence de PBP2 (MRSA+). - Absence d agglutination : le test est négatif : absence de PBP2 (MSRA-) Détermination de la concentration minimale inhibitrice vis à vis de l oxacilline : La CMI à l oxacilline doit être faite pour toutes les souches de Staphylocoque à coagulase négative présentant une résistance à l oxacilline (diamètre de la cefoxitine 24mm). Conditions de manipulation : - La technique se fera sur gélose MH additionnée de 2% NaCl. - L inoculum : une suspension bactérienne de 0,5 Mc Farland sera préparée à partir d une culture pure. - Incubation : 24H à 35 C en atmosphère normale. - La souche de référence Staphylococcus aureus ATCC doit être testée dans les mêmes conditions. Détermination de la concentration minimale inhibitrice en milieu solide : 1. Préparation de la solution mère : - On prépare une solution mère à 1600 µg/ml = 16mg de poudre diluée par 10ml de solvant. - Dans le cas où la poudre d antibiotique est titrée, le volume de solvant à rajouter est calculé comme suit : V = 16mg x titre 1600 µg/ml = ml H2O distillée 21

22 2. Préparation de la gamme d antibiotiques : Solution mère d antibiotiques Solution mère (ml) Eau distillée (ml) Concentration en tubes (µg/ml) Concentration en boîtes (µg/ml) 1600 µg/ml 1 ml 0,5 ml 9 ml 9,5 ml pipette Changer de pipette 80µg/mL 2 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 2 ml 3 ml 3,5 ml 7,5 ml ,5 Une seule Changer de pipette 5 µg /ml 2 ml 1 ml 0,5 ml 2 ml 3 ml 3,5 ml 2,5 1,25 0,63 0,25 0,125 0,063 0,5 ml 7,5 ml 0,32 0,032 Changer de pipette 0,32µg/mL 2 ml 2 ml 0,16 0,016 Matériel : - Série de 11 tubes à essai, numérotés de 160µg/ml à 0,16µg/ml. - Série de boîtes de Pétri rondes, numérotées de 16 µg/ml à 0,016µg/ml. - Culture de 18h de la souche à tester, ainsi que la souche témoin Staphylococcus aureus ATCC Poudre d antibiotique (oxacilline) titrée ou non titrée. - Pipette graduée jetable ou en verre stérile. - Milieu Mueller Hinton + 2% de NaCl gelosé. - Eau distillée. Méthode : 1. Préparation de la gamme d antibiotiques comme décrit précédemment (tableau ci-dessus). - Commencer par la distribution d eau distillée dans chaque tube. - A partir de la solution mère, procéder à la distribution de l antibiotique en changeant de pipette chaque fois que c est nécessaire. - Prendre 2ml de chaque concentration en tube d oxacilline (160 µg/ml, 80 µg/ml à 0,16µg/ml) et la mettre dans les boîtes de Pétri correspondantes à la concentration (16 µg/ml à.0,016µg/m ). 22

23 Pour éviter de gaspiller des pipettes, il est conseillé d utiliser une seule pipette, en allant de la plus faible concentration à la plus élevée. - Une boîte témoin est obligatoire pour chaque série de CMI avec 2ml d eau distillée sans antibiotique afin de controler l inoculum. - Ajouter 18ml de Mueller Hinton + 2% de NaCl fondu et ramené à 45 C. - Homogénéiser par mouvements rotatoires et laisser solidifier. - Faire sécher les boîtes. 2. Inoculum : Préparer les suspensions des souches à tester et des souches témoins, de la même manière que pour l antibiogramme (0,5 Mac farland), faire une dilution au 1/10 ème. 3. Application : Appliquer 3 µl des différentes suspensions sur la gélose à l aide d une anse de platine calibrée (F interne de la boucle égale à 3mm), ou à l aide d une micropipette. 4. Incubation : 18h à 24h à 35 C. 5. Interprétation : S R - S.aureus = 2 = 4 - S.coagulase - = 0,25 = 4 Pour S.aureus ATCC 29213, les valeurs critiques pour l oxacilline sont : 0,125 0,5. Tableau récapitulatif 5 : Recherche de la résistance des Staphylococcus sp à l oxacilline. S. aureus S. coagulase négative Antibiogramme Cefoxitine (30µg) 19 mm Résistant 24 mm Résistant Test de confirmation Test rapide de confirmation Screening test à l oxacilline (MH+4% NaCl+6µg d oxacilline) Test de détection de la PLP2a CMI à l oxacilline sur MH + 2% NaCl 23

24 5.2. Recherche de la -lactamase : - La recherche de la sécrétion de la -lactamase est obligatoire pour toute souche d Haemophilus sp Enteroccocus sp. Pour ce faire, plusieurs techniques existent : chromogéniques, microbiologiques et iodométriques. Ces tests doivent être effectués précocément, en raison des implications thérapeutiques évidentes. La technique chromogénique permet de donner les résultats le jour même, mais à défaut de pouvoir la pratiquer, les techniques microbiologiques doivent être utilisées. a. Technique chromogénique : Basée sur l utilisation de disques imprégnés de céphalosporine chromogène, commercialisés et prêts à l emploi. La réaction est instantanée. b. Technique microbiologique : (test du trèfle) Matériel : Souches de référence : Staphylococcus aureus ATCC sensible à la pénicilline Staphylococcus aureus ATCC résistant à la pénicilline Souches à tester Gélose Mueller Hinton Disque de penicilline G ou ampicilline Technique : Ensemencer une souche de S. aureus ATCC sur une gélose Mueller Hinton pour Staphylococcus sp. ou MH au sang cuit pour Haemophilus sp.. Appliquer un disque de penicilline G au centre de la boîte dans le cas d un Staphylococcus sp. ou un disque d ampicilline dans le cas d Haemophilus sp. Ensemencer en stries radiales (du centre de la boîte à la périphérie) la souche à tester, une souche témoin négatif (S. aureus ATCC 25923), une souche témoin positif (S. aureus ATCC 43300). Incuber la boîte 18h à 35 C en atmosphère normale ou 24h en atmosphère enrichie en CO 2 pour Haemophilus sp. Lecture et interprétation : La production de ß-lactamase (penicillinase) par la souche à étudier et la souche témoin positif induit la culture de la souche témoin négatif (sensible à la pénicilline) jusqu au contact du disque d ampicilline ou de pénicilline (Photo B). 24

25 S. aureus ATCC Disque de Penicilline S. aureus ATCC S. aureus ATCC Souche de Staphylococcus à tester : productrice de ß- lactamase Photo B : Production de ß-lactamase (pénicillinase) chez Staphylococcus sp. (mise en évidence de la production de pénicillinase par la technique du trèfle) 5.3. Recherche de la -lactamase à spectre élargi (BLSE) chez les Entérobactéries et Pseudomonas aeruginosa : Définition d une BLSE : Les β-lactamases à spectre élargi ou étendu désignent les enzymes «β-lactamases» produites par les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter sp. Ces enzymes codent pour la résistance aux céphalosporines de 3 ème génération (cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime) et aux monobactam (aztreonam), mais n ont aucune activité vis-à-vis des céphamycines (cefoxitine, moxalactam) ni des carbapenemes (imipeneme). 25

26 Méthode de détection de la BLSE : Test de synergie : (selon Jarlier et coll) Principe : Les BLSE dérivées des enzymes de classe A (Ambler) sont inhibées par les inhibiteurs de β-lactamases (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam). Technique : Entérobactérie : (Photo C) : La recherche de la β-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standard de l antibiogramme (Fiche technique n 1 page 9) en déposant le disque d amoxicilline + acide clavulanique (AMC 20/10µg) à 30mm (centre à centre) d un disque de céphalosporine de 3 eme génération cefotaxime (CTX 30µg) ou ceftriaxone (CRO 30µg). Incuber 18 heures à 35 C. Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter sp : (Photo D) La recherche de la β-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standard de l antibiogramme (Fiche technique n 1 page 9) en déposant un disque de ticarcilline + acide clavulanique (TCC 75/10 µg) à 30 mm (centre à centre) d un disque de céphalosporine de 3 ème génération ceftazidime (CAZ 30µg) et aztreonam (ATM 30µg). Incuber 18 heures à 35 C. Lecture : La production d enzyme peut se traduire sur l antibiogramme classique par l apparition d une image de synergie ou bouchon de champagne entre les disques : - Pour les Entérobactéries : Amoxicilline + acide clavulanique et le cefotaxime (Photo C). - Pour Pseudomonas aeruginosa (Photo D) et Acinetobacter sp : Ticarcilline + acide clavulanique et la ceftazidime. Ticarcilline + acide clavulanique et l aztreonam. En l absence d une image de synergie, la production de BLSE sera suspectée devant toute diminution du diamètre autour des disques de céphalosporines de 3 eme génération ou de monobactam. 26

27 CTX CAZ AMC ATM CRO Photo C : Souche de Klebsiella pneumoniae productrice de ß-lactamase à spectre élargi CRO : ceftriaxone ; ATM : aztreonam ; CAZ : ceftazidime ; CTX : cefotaxime ; AMC : amoxicilline+ acide clavulanique ; CPO CAZ TCC ATM CTX Photo D : Souche de Pseudomonas aeruginosa productrice de ß-lactamase à spectre élargi. ATM : aztreonam ; CAZ : ceftazidime ; CTX : cefotaxime ; CPO : cefpirome ; TCC : ticarcilline+ acide clavulanique. 27

28 Interprétation : Pour les Entérobactéries - On recherchera une BLSE devant un diamètre inférieur aux valeurs suivantes : cefotaxime (CTX = 27mm), ceftazidime (CAZ = 22mm), ceftriaxone (CRO = 25 mm) et aztreonam (ATM = 27 mm). - La détection des BLSE chez les souches également hyper productrices de céphalosporinase (Enterobacter,.) est facilitée par la recherche d une synergie entre amoxicilline + acide clavulanique et cefepime (CFP 30µg) ou cefpirome (CPO 30µg SFM) selon le communiqué CA-SFM Chez Proteus mirabilis, P.vulgaris, P.penneri, Morganella morganii, Providencia stuartii, P.rettgeri, les BLSE s expriment à bas niveau, dans ce cas, le test de synergie est optimisé en disposant les disques à une distance de 40 à 45mm au lieu de 30 mm. Remarque : Certains auteurs recommandent de rapprocher la distance entre les deux disques à 15mm au lieu de 30 mm (selon Courdon PE et coll, 1997). Risque d erreur d interprétation : Chez Klebsiella oxytoca, P.vulgaris, P.penneri, Citrobacter koseri, le test de synergie est positif avec aztreonam et/ou ceftriaxone, mais reste négatif avec ceftazidime dont l activité est conservée signe d hyperproduction de ß lactamase naturelle chromosomique ou Aztreonamase. Pour Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter sp Une synergie entre ticarcilline + acide clavulanique et aztreonam ou ticarcilline + acide clavulanique et ceftazidime ou ticarcilline + acide clavulanique et cefepime et enfin entre ticarcilline + acide clavulanique et cefpirome permet la détection de certaines β lactamases a spectre étendu (BLSE). Exemple PER Test de confirmation du double disque (Photo E) : Description de la technique : A partir d une culture de 18H préparer une suspension d une opacité égale à 0.5 McF selon la technique de l antibiogramme (Technique n 1 page 9). Application des disques : Pour les Entérobactéries : - On dépose un disque d AMC (20/10 µg) et un disque de céphalosporine de 3 ème génération (cefotaxime 30 µg ou ceftriaxone 30µg) à une distance de 25mm (centre à centre). - Laisser diffuser les antibiotiques. - La boîte gélosée ensemencée sera déposée le couvercle vers le haut à la température ambiante pendant 1 heure. 28

29 - Après 1 H d incubation sur la paillasse (T ambiante), ôter le disque d AMC et le remplacer par un disque de cefotaxime ou ceftriaxone. - Incuber la boîte 18 H à 35 C. Pour Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter sp : - On pratique la même technique en appliquant un disque de TCC (75/10 µg) avec un disque de céphalosporine de 3 eme génération (ceftazidime 30µg) ou monobactam (aztreonam 30µg) à une distance de 25 mm. - En routine, nous avons constaté une meilleure détection des BLSE en testant un disque de cefoperazone (75µg) avec un disque de TCC (75/10 µg). Lecture et interprétation : Le test du double disque est positif quand le diamètre d inhibition du disque de céphalosporine de 3 ème génération appliqué après pré diffusion du disque de l AMC ou TCC est supérieur ou égal à 5mm par rapport au diamètre d inhibition du disque de céphalosporine de 3 ème génération. Exp : BLSE, diamètre de la CAZ = 16 mm ; diamètre de l AMC + CAZ = 21mm. Pour Pseudomonas et Acinetobacter l interprétation du test consiste à répondre résistant pour toutes les ß lactamines sauf pour l imipeneme. Contrôle de qualité : Les mêmes techniques seront réalisées an parallèle pour les souches : - E. coli ATCC non productrice de BLSE. - K. pneumoniae ATCC productrice de β lactamase à spectre élargi BLSE. NB : E. coli ATCC donne un diamètre de la zone d inhibition avec CTX et AMC supérieur de 2mm par rapport à celui avec CTX. CTX AMC puis CTX Photo E : K. pneumoniae productrice de BLSE (Test positif : mise en évidence d une BLSE) 29

30 5.4. Recherche de Staphylococcus sp. et Enterococcus sp. ayant une sensibilité réduite à la vancomycine ou résistants à la vancomycine : Des souches de Staphylococcus à coagulase négative ayant une sensibilité réduite à la vancomycine, ont été rapportées aux Japon puis aux USA et en France. Deux souches ayant une résistance à la vancomycine, ont été signalées au USA, une en juillet 2002 et l autre en octobre de la même année. Ces souches portent le gène vana similaire à celui retrouvé chez les Enterococcus. La recherche de ces résistances est recommandée lorsque l on observe sur l antibiogramme par la méthode de diffusion : - Un diamètre de la zone d inhibition autour des disques de glycopeptides inférieur à 17mm. - Un diamètre de la zone d inhibition autour du disque de teicoplanine inférieur d au moins 3mm de celui de vancomycine. - La présence de quelques colonies à l intérieur de la zone d inhibition de l un des deux disques de glycopeptides testés. - La présence d interaction de type antagonisme ou synergie entre l un des deux glycopeptides testés et le disque d oxacilline. La catégorisation de ces souches doit être confirmée par la détermination de la concentration minimale inhibitrice : CMI à vancomycine et teicoplanine par la méthode de dilution en milieu liquides (méthode de référence) ou par la technique E test. Détermination des CMI pour les glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) : Milieu : Gélose Mueller Hinton Inoculum : 0,5 McFarland en bouillon Mueller Hinton ou en solution de NaCl 0,85%. Ensemencement : Plonger un écouvillon stérile dans la suspension, le sortir du tube en l essorant doucement sur les parois. Ensemencer la boîte en frottant l écouvillon sur sa surface et en tournant la boîte 3 fois de 60 afin d assurer une bonne distribution de l inoculum. Laisser sécher les boîtes minutes à C. Déposer les bandelettes E test à l aide d une pince. Contrôle de qualité : Il est réalisé dans les mêmes conditions que les souches à tester. Les souches de référence utilisées sont : S. aureus ATCC sensible à la vancomycine. E. faecalis ATCC sensible à la vancomycine. S. epidermidis WHO 6 souche connue résistante aux glycopeptides. 30

31 Incubation : 24 heures à 35 C Lecture : Lire la valeur de la CMI correspondant à l intersection des 2 ellipses (Photo F). Interprétation : CMI (mg/l) Staphylococcus sp S I R Teicoplanine > 16 Vancomycine > 16 Enterococcus sp S I R Teicoplanine > 16 Vancomycine > 16 Contrôle de qualité : CMI (mg/l) pour les souches de référence. Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Vancomycine 0,5 2 Teicoplanine 0,25 1 Vancomycine 1 4 Teicoplanine 0,064 0,25 Photo F Technique E test : CMI vancomycine 31

32 6. Autres bactéries 6.1. Brucella sp. : La Brucellose appartient au groupe à risque III considéré comme une menace pour le personnel de laboratoire. Les causes essentielles de contamination au laboratoire sont : - L habitude des microbiologistes à sentir les cultures bactériennes (sniffing). - La génération d aérosols en grand nombre, lors des manipulations (préparation des suspensions bactériennes pour antibiogramme). La dose infectieuse de la brucelle est de 10 à 100 microorganismes, les aérosols générés lors de toute manipulation sont fortement infectieux. De ce fait l antibiogramme n est pas réalisé de manière courante, sachant que la sensibilité de Brucella aux antibiotiques est assez constante. Le E test est conseillé dans certains cas afin de tester les molécules suivantes : doxycycline, rifampicine, streptomycine, gentamicine et trimethoprime/ sulfamethoxazole. Cependant, cette manipulation doit se faire dans des conditions de securité rigoureuses. Précautions au laboratoire : Toute culture étant très contagieuse par voie aérienne, conjonctivale et cutanéo muqueuse, différentes précautions doivent êtres prises : - La manipulation de culture suspecte doit se faire sous une hotte à flux laminaire vertical (type Biological Safety Cabinet class III) car il y a augmentation du risque de contamination par la production en grand nombre d'aérosols. - La présence dans la hotte d un incinérateur d anse est indispensable. - Protection du manipulateur par le port de blouse, masque, lunettes et gants Corynebacterium sp. : - Le milieu utilisé est la gélose Mueller Hinton, additionnée de 5% de sang de mouton. - L inoculum de 0,5 Mc Farland est ensemencé par écouvillonnage. - L incubation se fait à 35 C en atmosphère ordinaire. Pour Corynebacterium sp. les antibiotiques testés sont : penicilline, ampicilline, erythromycine, gentamicine. 32

33 6.3. Listeria sp. Milieu : Gélose Mueller Hinton, additionnée de 5% de sang de mouton. Inoculum : Il est à 0,5 Mc Farland. Ensemencement : Se fait par écouvillonnage. Incubation : 16 à 20h à 35 C en atmosphère ordinaire. - Les antibiotiques testés sont: ampicilline, gentamicine, chloramphenicol, tetracyclines et trimethoprime/sulfamethoxazole. - Listeria monocytogenes est naturellement résistante aux céphalosporines. - Le NCCLS préconise pour l Ampicilline et la Pénicilline la détermination des concentrations minimales inhibitrices par la méthode de micro dilution en milieu liquide : - Bouillon Mueller Hinton + 2 à 5% de sang de cheval hémolysé incubé à 35 C ; pendant 16 à 20 h. L interprétation des résultats est : Ampicilline = 2µg/ml : souche sensible Campylobacter sp : Actuellement, il n'existe pas de techniques standardisées NCCLS pour l'étude de la sensibilité de Campylobacter spp. Cependant les recommandations du NCCLS de Janvier 2005 concernant les conditions d'étude des isolats cliniques et du contrôle de qualité préconisent pour l'instant la détermination de la CMI des antibiotiques à tester. Milieu : Gélose Mueller Hinton additionnée de 5% de sang de mouton. Inoculum : A partir d'une culture de 18 à 24h sur milieu d'isolement, préparer une suspension en eau physiologique stérile de 0,9% d'une turbidité équivalente au standard Mc Farland 0,5. Ensemencement : L ensemencement se fait directement à partir de la suspension 0,5 Mc Farland par la technique d écouvillonnage. La souche témoin Campylobacter ATCC doit être testée parallèlement dans les mêmes conditions. Incubation : 24h à 42 C ou 48h à 36 C en microaerobiose (10% de CO2 + 5% H % N2), car certains Campylobacter comme C. jejuni spp. doylei, C. fetus et C. lari ne poussent pas à 42 C. La température d'incubation pour ces espèces est de 36 C. 33

34 Lecture : Limites acceptables des CMI (µg/ml) pour les souches de CQ Antibiotiques Souche témoin C. jejuni ATCC C / 48h 42 C / 24h Gentamicine ,5-4 Erythromycine Doxycycline 0,5-2 0,25-2 Ciprofloxacine 0,12-1 0,06-0,5 Meropeneme 0,004 0,015 0,008-0,03 Remarque : L édition de janvier 2005 du comité de l antibiogramme du CA-SFM préconise les recommandations suivantes pour la réalisation et l interprétation de l antibiogramme. Milieu : Utilisation de MH + 5% de sang de mouton ou de cheval. Ensemencement : Se fait par la technique d écouvillonnage de la suspension 0,5Mc Farland après dilution au 1/100 ème. Les disques à tester sont en nombre plus important : ß lactamines : ampicilline, amoxicilline, cefalexine, cefotaxime. Aminosides : streptomycine, gentamicine, kanamycine, tobramycine. Erythromycine Quinolones : acide nalidixique, ciprofloxacine Tetracyclines : tetracycline Phénicolés : chloramphénicol 34

35 Valeurs critiques définies pour toutes ces molécules : Antibiotiques Charges du disque Concentrations critiques (µg/ml) Diamètres critiques (mm) S R S R Remarques Ampicilline Amox./Ac clav Cefalotine Cefotaxime 10 µg 20/10 µg 30 µg 30 µg 4 4/ / (1) (1) (1) (1) Streptomycine Gentamicine Kanamycine Tobramycine 10 UI 15µg (10 UI) 30 UI 10 µg (1) (2) (1) (2) (1) (2) (1) (2) Erythromycine 15 UI (1) Ac. nalidixique Ciprofloxacine* 30 µg 5 µg 8 0, (1) (1) Tetracycline 30 UI Chloramphenicol 30 µg Lecture et interprétation : Remarques : Selon les antibiotiques, la corrélation entre CMI et diamètres est parfois difficile à établir. En cas de doute sur les résultats obtenus par diffusion en milieu gélosé, il y a lieu de déterminer les CMI par une méthode de référence ou toute méthode ayant montré, pour les antibiotiques concernés, son équivalence avec la méthode de référence. (1) : Pour Campylobacter spp., une absence de zone d'inhibition autour des disques de ß -lactamines, aminosides, macrolides ou quinolones traduit une résistance de haut niveau (2) : Compte tenu des conditions d'incubation (anaérobiose ou microaérobiose), les diamètres des zones d'inhibition autour des disques d'aminosides sont toujours réduits. 35

36 VI. Contrôle de qualité 1- Objectifs : - Le contrôle de qualité a pour but d assurer : La précision et la fiabilité de la technique des tests de sensibilité. La performance des réactifs utilisés dans les tests. La performance du personnel qui effectue les tests et la lecture. - Afin de se conformer à ces exigences, plusieurs souches de référence peuvent être utilisées : Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Haemophilus influenzae ATCC Procédure de contrôle : - Le contrôle de qualité doit se faire à chaque nouveau lot de Mueller Hinton et ou d antibiotiques. Ce travail (du biologiste) de contrôle doit être permanent. Il est conseillé de désigner dans chaque laboratoire une personne chargée de la supervision du contrôle de qualité. - Les souches de référence devant être obligatoirement testées sont : E. coli ATCC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC H. influenzae ATCC Une fois par semaine, ces souches seront testées, dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites pour les bactéries isolées. 36