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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE «Santé, Sciences, Technologies» INRA Station de Recherches avicoles THÈSE présentée par : Hélène SAINT-DIZIER soutenue le : 19 Mars 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l université François Rabelais de Tours Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie Les réponses de peur chez la caille japonaise : approches neurobiologique et comportementale THÈSE dirigée par : Mme RICHARD Sabine Mme LETERRIER Christine Chargée de Recherches, INRA de Tours Chargée de Recherches, INRA de Tours RAPPORTEURS : M. BALTHAZART Jacques Professeur, Université de Liège (Belgique) M. CHICHERY Raymond Professeur Émérite, Université de Caen JURY : M. BALTHAZART Jacques Professeur, Université de Liège (Belgique) M. BOISSY Alain Directeur de Recherches, INRA de Clermont-Ferrand M. CHICHERY Raymond Professeur Émérite, Université de Caen M. LEMAN Samuel Maître de Conférences, Université de Tours Mme LETERRIER Christine Chargée de Recherches, INRA de Tours Mme RICHARD Sabine Chargée de Recherches, INRA de Tours

2 Remerciements La thèse a été pour moi une expérience riche en émotions où j ai fréquemment partagé rires et larmes. Toutes les personnes que j ai rencontrées durant ces trois années m ont aidée à m épanouir, et mener à bien des projets à la fois scientifiques et personnels. Cette thèse n aurait pu aboutir sans la participation de ces personnes. Pour ces raisons je tiens à remercier chaleureusement et sincèrement : Sabine Richard, pour son encadrement exceptionnel à toutes les étapes de cette thèse. J ai bénéficié de conseils, de connaissances théoriques, de corrections constructives et d aides pratiques sur le plan scientifique. J ai aussi reçu des encouragements, un soutien et une écoute attentive sur le plan moral et personnel. Cette thèse est le fruit de ce partage et de ces échanges qui m ont permis d évoluer. Un grand merci donc! Christine Leterrier et Frédéric Lévy pour avoir co-encadré cette thèse avec complémentarité. Merci à tous les deux pour votre soutien, la transmission de vos connaissances, les encouragements, le partage d émotions, les discussions parfois philosophiques voire même teintées de psychologie. Je dois avouer que j ai adoré avoir la possibilité de rentrer dans l un de vos bureaux aussi bien pour analyser mes nouveaux résultats que pour digresser sur les valeurs de la vie, mon avenir et bien d autres sujets. J espère ne rien oublier de ces conversations qui m ont permis de construire ce projet et de préparer mon avenir. Une dédicace particulière à Christine pour son aide admirable avec mes bestioles et sa force qu elle transmet si bien. Philippe Chemineau, Chef de département (département PHASE), pour m avoir apportée d excellentes conditions de travail jusque dans les derniers mois et avoir suivi avec intérêt l évolution de cette thèse. Benoît Malpaux et Yves Nys, respectivement Directeur de l unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements et Directeur de l Unité de Recherches Avicoles, pour m avoir accueillie dans leurs unités. Messieurs Jacques Balthazart, Alain Boissy, Raymond Chichery et Samuel Leman qui me font l honneur d examiner mes travaux de thèse et d en discuter lors de la soutenance. Un merci particulier à Jacques Balthazart pour m avoir accueillie dans son laboratoire et m avoir offert d excellentes recommandations. Madame Catherine Belzung et Messieurs Yves Tillet et Henrique Sequeira, pour leur participation active lors des réunions du comité de thèse. Un merci particulier à Yves pour avoir suivi la thèse depuis ces débuts et pour y avoir apporté ses conseils judicieux. Paul Constantin pour son savoir-faire dans la plupart des expériences de la thèse, ses compétences graphiques pour les figures, ses talents de dessinateur, sa bonne humeur quotidienne, son humour, et ses jeux de mots (mon préféré : la contrepèterie de groupe de cailles). Nathaële Wacrenier-Ceré, pour toutes les heures passées auprès des cerveaux (sans toi les cerveaux seraient encore congelés!), pour son aide incommensurable en immuno, sa joie de vivre et sa gentillesse. Ceri Davies, pour avoir partagé ses opinions sur l ensemble des travaux, ses connaissances innombrables sur le cerveau d oiseau, son aide précieuse dans la manip lésion, ses corrections fabuleuses sur l article. Jean-Claude Thiery, pour son aide dynamique, la transmission de ses connaissances pratiques et théoriques et son intérêt au cours de l étude lésionnelle. L ensemble de l équipe "Comportement, Neurobiologie et Adaptation" qui m a accueillie pour la première fois il y a plus de 5 ans, pour l excellente formation que

3 j ai reçue auprès d elle. Soit Guillaume Ferreira, pour son enthousiasme, ses connaissances en neurobiologie, sa passion pour la science qu il m a communiquée en maîtrise et en DEA. Guigui, j espère t avoir déjà remercié en DEA de la possibilité que tu m as offerte de devenir "une grande dame doctoresse". Matthieu Keller, pour sa sympathie, son expérience de jeune chercheur, son point de vue sur le monde de la recherche et quelques fois sur l univers. Cécile Arnoud, pour ses connaissances du monde des poulettes. Raymond Nowak, pour sa sagesse de grand chef. Elodie Chaillou et Léa Lansade, pour leurs connaissances, leurs expériences et les échanges ; Maryse Meurisse et Nicole Jouaneau pour leur aide pratique sur les cerveaux et leur gentillesse ; Pascal Poindron, pour ses compétences en statistiques et ses connaissances innombrables ; sous oublier les anciens, Dick Porter et Pierre Orgeur avec qui j ai de bons souvenirs. Jean-Marie Brigant et Jean-Marie Hervouet, pour leur aide et leur savoir faire dans l élevage des cailles. L ensemble des thésards avec qui j ai pu échanger analyses de résultats, connaissances scientifiques, fous rires et coups de blues. Du côté URA : Microseb pour les moments de délire (j en garde une belle preuve en film), la réflexion sur le monde de la recherche, les potins, les balades à cheval ; Manuela, Dorothée, Dom, Vincent et Iz, pour l ambiance fabuleuse qui règne dans le bureau thésard. Du côté PRC : Jessica, en souvenir du soutien mutuel pendant quatre années vécues en parallèle ; Cécile, la petite dernière de l équipe, pour les conversations dans le bureau, les points de vue que nous partageons et ces qualités humaines ; Astrid et Céline, tout simplement parce que ce sont deux personnes extraordinaires avec qui j adore faire des pauses cafés-clopes et aller boire des verres! Du côté de l Université : Julio, avec qui j ai pu (presque) tout partager et comparer, du DEA à la fin de la thèse. Des instants simples qui nous ont liés avec une certaine force! Christelle awanawanawé, pour tous les fous rires, sa passion pour la recherche et parce que c est une personne fabuleuse qui me donne l exemple de ce que devrait être une chercheuse aujourd hui. Sans oublier Alessandro qui même loin sera toujours présent dans les merveilleux souvenirs de ce quatuor du DEA! Guada et Elsa (la relève), pour leurs qualités humaines qui sautent aux yeux! Tous mes colocataires (la plupart, thésards de l équipe) qui se sont succédés pour me supporter au quotidien (à la fois au bureau et à la maison). Pour la coloc de Nouzilly : Un immense merci à Gaëlle et Fredo, pour leur aide inégalable (entre autres avec mes bourriques malades), pour les moments de réflexions sur nos vies, pour les moments de bonheur partagé, pour leur soutien moral, et plus particulièrement pour le dynamisme et l enthousiasme de Fredo ainsi que la sagesse et les conseils de Gaëlle. Je remercie aussi Séverine, pour son humour, les moments entre filles et son exemple de chercheuse en devenir. Je ne pourrai oublier les instants de vie que nous avons vécus à quatre : les discussions sur le coin de la cuisine, le voyage en Australie, les randos... Je n oublie pas non plus, les "remplaçantes de Sév" avec qui j ai vécu des moments forts bien que leur passage fut parfois court : Aurélie, Pauline et Mathilde. Pour la coloc à Tours : encore un gigantesque merci à Bertrand (monsieur "je suis petit, ca vous pose un problème?"), pour sa joie de vivre, son tempérament, ses qualités humaines, ses talents de cuisinier et j en passe et des meilleurs. Bertrand, je dois avouer que j adore vivre à tes côtés, je m y sens détendue. Thomas (monsieur "je squatte chez des potes et je le vis bien!") pour sa culture, sa gentillesse, son humanisme et son dévouement pour le rangement et le ménage. Nous avons créé un trio qui fonctionne bien, je crois, grâce aux petits bonheurs de la vie de tous les jours : l heure de l apéro, les moments de philosophie du soir, les blagues du matin, les week-ends sorties/vautrage de canapé et parce que vous supportez admirablement "madame je suis en 3 ème année de thèse et j embête tout le monde"!

4 Juliette Cognié, qui incarne la bonne humeur, l intelligence, la force d une belle femme et l humour. C est avec Juliette que j ai le plus ri à l INRA, partagé un maximum de grand n importe quoi, mais aussi de conversations sur la vie, sur mon avenir, sur mes amours. Un ensemble de petits bonheurs qui rendent le quotidien joyeux! C est sûr sans mon coach de vie, je n en serais pas à ce stade de développement personnel! Françoise Prades Chauvière, qui m a apporté bien-être et grâce à qui j ai évolué rapidement! Cette rencontre m a permis de ressentir une personnalité dynamique et joyeuse. J ai appris à accepter certains événements sans chercher à les modifier ou à les contrôler. Cette thèse ne serait pas la même sans sa participation. Ma famille, qui m a toujours soutenue quels que soient mes rêves, mes folies, mes joies, mes larmes. Mes parents savent à quel point je leur suis redevable et à quel point je les trouve formidables non seulement dans leur rôle de parents mais aussi dans leur rôle d homme et de femme de cette société. Les trois frangines, qui ne doivent pas se douter à quel point je les admire, et pourtant elles ont été un modèle dans toutes les étapes de ma vie, chacune à leur façon. Les beaufs, pour les conseils qui m ont apporté la vision de grands frères que je n avais pas eue. Je suis très fière d être la petite dernière de cette famille de dingues et je souhaite que nous restions soudés. Les amis de longues dates : Alice, pour notre enfance partagée, parce que tu es comme une sœur, que tu es une fille formidable et que ta simple présence m apaise ; Norman, pour notre vision d anges looseurs, parce que quand on est tous les deux, tout est si cohérent ; Manue, pour son ivresse envers la vie que je partage avec elle et nos conversations de psychologie de comptoir qui me font tant de bien ; Steph de Paris, pour sa bonté, sa douceur, parce qu il est en quelque sorte mon prince charmant, celui qui a éveillé mon romantisme ; et Stef de Tours, pour nos théories, parce que certaines fois j ai la sensation qu on se fait grandir ensemble quand nos visions raisonnées et passionnées se mélangent. Jean-Luc, pour son soutien merveilleux dans cette dernière année de thèse et pour notre idylle inoubliable que nous sommes seuls à connaître. J espère continuer à partager ce bonheur avec toi mon loupiot.

5 SOMMAIRE INTRODUCTION 1 A / Peut on énoncer une définition des émotions? 4 B / Qu est ce que la peur? 6 C / Comment appréhender la peur chez les oiseaux? 7 1 / Situations génératrices de peur chez les oiseaux 7 2 / Réactions comportementales et physiologiques indicatrices d un état de peur chez l oiseau 9 a) Les réactions comportementales 9 b) Les réactions physiologiques 11 3 / Apports des sélections génétiques pour étudier la peur chez les animaux 12 D / Comment le cerveau «contrôle-t-il» la peur? 15 1 / Connaissances générales sur la neurobiologie des comportements de peur chez les mammifères 15 a) L amygdale 16 b) Le noyau du lit de la strie terminale 17 c) L hippocampe 18 d) Le cortex préfrontal 18 e) Le noyau paraventriculaire de l hypothalamus 19 2 / Etat actuel des connaissances sur la neurobiologie des comportements de peur chez les oiseaux 20 a) La structure générale du cerveau d oiseau 20 b) Les structures centrales potentiellement impliquées dans l expression des comportements de peur chez l oiseau 21 Arcopallium et amygdale palliale postérieure 22 Autres structures cérébrales potentiellement impliquées dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux 24 OBJECTIFS 26

6 MODELE ANIMAL 28 1 / Mise en place de la sélection de cailles japonaises sur leur durée d immobilité tonique 28 2 / Conséquences comportementales, génétiques, physiologiques et neurobiologiques de la sélection 31 a) Données comportementales 31 b) Données génétiques 32 c) Données physiologiques 32 d) Données neurobiologiques 33 CHAPITRE 1 35 Implication différentielle de sous-régions de l arcopallium / amygdale palliale postérieure dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau Introduction 35 Etude préliminaire 37 Article soumis dans Behavioral Neuroscience : Subdivisions of the arcopallium / posterior pallial amygdala complex are differentially involved in the control of fear behavior in the Japanese quail 40 Commentaires 59 CHAPITRE 2 62 Identification de structures cérébrales susceptibles d être impliquées dans l expression des comportements de peur des oiseaux, par une étude d activation neuronale Introduction 62 Etude préliminaire 64 Article en préparation : Fearfulness influences Fos expression in the paraventricular hypothalamic nucleus, bed nucleus of the stria terminalis and arcopallium / posterior pallial amygdala in japanese quail 66 Résultats annexes 90 Commentaires 91 CHAPITRE 3 94 Introduction 94 Article accepté dans Applied Animal Behaviour Science : Selection for tonic immobility duration does not affect the response to novelty in quail 95 Commentaires 105

7 DISCUSSION 107 Rappels des principaux résultats 107 A / L arcoppalium / PoA, une région au rôle majeur dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau 109 1) L arcopallium antérieur 109 2) La partie postérieure de l arcopallium / PoA 110 3) L arcopallium / PoA, un homologue partiel de l amygdale des mammifères? 114 B / Le rôle du noyau du lit de la strie terminale dans le contrôle des comportements de peur chez les oiseaux 116 C / Le noyau paraventriculaire de l hypothalamus et son rôle dans le contrôle des réponses de peur chez les oiseaux 117 D / Peut-on établir un réseau de régions cérébrales contrôlant les réponses de peur chez les oiseaux? 119 E / Peut-on considérer la peur comme une émotion unique ou possède-t-elle un caractère multidimensionnel? 121 1) La peur, une émotion unique? 121 2) Des données en faveur de la reconnaisse du caractère multidimensionnel de la peur 121 3) Plusieurs circuits neuronaux pour plusieurs réponses de peur? 123 F / Les modèles (animal et expérimental) utilisés au sein de la thèse sont-ils adaptés à l étude neurobiologique des réponses de peur chez les oiseaux? 125 1) L intérêt des lignées de cailles STI et LTI dans l étude des mécanismes neurobiologiques des réponses de peur chez les oiseaux 125 2) L intérêt du test d objet nouveau pour l étude des mécanismes neurobiologiques des réponses de peur chez les oiseaux 128 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 131 LISTE DE PUBLICATIONS 147

8 INTRODUCTION

9 Introduction Introduction «Au commencement était l émotion» (Louis-Ferdinand Céline) L une des premières études scientifiques portant sur les émotions des animaux date de 1872 lorsque Charles Darwin propose l existence d une continuité dans l expression des émotions chez les mammifères. La démarche de Darwin, motivée par une approche évolutionniste, a consisté à cataloguer avec rigueur, puis à comparer, une variété d expressions émotionnelles chez diverses espèces animales et chez l homme. Pour Darwin (1872), les expressions émotionnelles de l humain trouvent leurs origines au sein de l histoire évolutive des espèces. De plus, comme le remarque Dawkins (2006), il tient pour acquis que non seulement l animal se comporte émotionnellement mais il éprouve aussi ces émotions, au même titre que l homme. Pourtant, en France, les animaux ne sont légalement considérés comme des êtres sensibles et donc capables de percevoir des émotions qu en 1976 (Loi «nature», Journal officiel du 13/7/1976). Les questions relatives à la nature des émotions perçues par les animaux ont ainsi occupé l esprit de nombreux biologistes tout au long du 20 ème siècle, car les preuves solides de l attribution d états affectifs chez l animal s avèrent difficiles à mettre en évidence. Chez l homme, l expérience émotionnelle a été estimée à partir du langage mais elle n est pas directement accessible chez l animal. Il serait pourtant dommage de considérer que l expérience émotionnelle se limite à l homme, par la seule preuve du langage. Des démarches scientifiques ont consisté à faire des analogies entre les réponses émotionnelles chez l homme et celles des autres animaux. Mais elles peuvent se révéler peu convaincantes si la communauté scientifique ne peut désigner des éléments essentiels des émotions comparables entre espèces. Ainsi, c est en déterminant les mécanismes sous-jacents permettant de caractériser les émotions que la biologie peut réduire la résistance à accepter l attribution d une expérience émotionnelle chez l animal (LeDoux, 1996 ; 2000 ; Panksepp, 2005 ; Paul et al., 2005 ; Dawkins, 2006 ; Burgdorf et Panksepp, 2006). Nous verrons au cours de cette introduction que l investigation des mécanismes neurobiologiques apporte des connaissances nécessaires à l étude des émotions chez l animal. En outre, les circuits neuronaux qui sont à la base de l expression des émotions chez l homme, existent également chez l animal (LeDoux, 1996 ; Panksepp, 2005 ; Burgdorf et Panksepp, 2006). 1

10 Introduction «Le cerveau est mon second organe préféré» (Woody Allen) Depuis les travaux de Darwin, on n a de cesse de chercher l existence d une continuité phylogénétique des composantes des émotions. Comme le suggère très simplement Dawkins (2006), «nous avons tous l intuition, depuis longtemps déjà, que les émotions ont quelque chose à voir avec le cerveau». De même, LeDoux dans Le cerveau des émotions (1996), introduit très clairement la question : «Les solutions trouvées par l évolution aux problèmes communs à de nombreuses espèces différentes proviennent certainement de fonctions sous-jacentes communes. La question évidente soulevée par cette discussion est de savoir comment une équivalence fonctionnelle du comportement peut être maintenue entre les espèces, notamment entre celles pour lesquelles cette fonction s exprime par des comportements radicalement différents. La réponse, pour faire bref, à ce problème très complexe est que les systèmes cérébraux requis par ces fonctions sont les mêmes chez les différentes espèces» (p.121). En effet, aujourd hui, la comparaison des mécanismes neurobiologiques sous-jacents aux comportements émotionnels entre différentes espèces permet d établir des homologies (équivalences structurales) et des analogies (équivalences fonctionnelles) au niveau du système nerveux central (Burgdorf et Panksepp, 2006). Par exemple, l amygdale, structure cérébrale jouant un rôle central dans l expression émotionnelle, semble posséder des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles similaires entre différentes espèces. En effet, il a été observé que des lésions de l amygdale diminuaient les réponses émotionnelles chez différentes espèces de mammifères telles que le rat, le lapin, le chat, le chien, le singe (LeDoux, 1996). Chez les oiseaux et les lézards, on recense beaucoup moins d études que chez les mammifères mais il a été montré que des lésions des homologues aviaire et reptilien de l amygdale des mammifères provoquent une diminution des réponses émotionnelles (oiseaux : Cohen, 1975 ; Lowndes et Davies, 1995 ; lézards : Davies et al., 2002). De récentes études neuroanatomiques suggèrent aussi des similitudes structurales entre l amygdale et certains noyaux du cerveau des amphibiens (Laberge et al., 2006 ; Moreno et Gonzalez, 2007). Ainsi, les données neurobiologiques semblent conforter l existence d une continuité phylogénétique des mécanismes émotionnels chez les vertébrés. Cependant, les neurosciences comportementales se sont particulièrement intéressées aux mécanismes des émotions chez les mammifères mais les connaissances chez les autres vertébrés restent encore limitées. Or, pour améliorer la compréhension de la continuité phylogénétique des émotions, les connaissances au sein de différentes classes sont indispensables. L étude des mécanismes neurobiologiques chez les oiseaux constitue donc une étape fondamentale 2

11 Introduction pour la compréhension des émotions chez les vertébrés. Au cours de cette thèse, nous nous sommes penchés sur l étude des mécanismes neurobiologiques associés aux comportements, chez les oiseaux, pour appréhender les mécanismes d une émotion particulière : la peur. «Ce n est pas nécessaire d avoir des raisons pour avoir peur» (Romain Gary) La plupart des études concernant les émotions, et en particulier celles de la neurobiologie des émotions, ont porté sur une émotion particulière, la peur. La raison principale de cette orientation vient du fait que la peur engendre des réponses plus faciles à mesurer chez l animal, telles que la fuite ou l évitement, que d autres émotions comme la joie par exemple. De plus, d un point de vue évolutif, la peur est très conservée au niveau comportemental au sein du règne animal. En effet, la peur, responsable des comportements de fuite face à un danger, est nécessaire à la survie d un individu. On retrouve ainsi des réponses de peur similaires chez de nombreuses espèces animales (Russel, 1979 ; Boissy, 1995 ; LeDoux, 1996), comme l avait déjà observé Darwin (1872). De plus, l élevage des animaux fournit une seconde raison d étudier les réponses de peur chez ces derniers car la peur peut engendrer des comportements inadaptés, au sein d environnements artificiels. De nombreuses situations en condition d élevage, telles que les manipulations par l homme ou des changements brutaux d environnement peuvent être à l origine d atteintes sérieuses au bien-être des animaux, en particulier chez les oiseaux (Jones, 1996). Par exemple, un stimulus soudain, intense et inhabituel peut déclencher un mouvement de panique chez le poulet de chair, conduisant les animaux à se jeter sur les obstacles ou les murs du bâtiment et à s entasser les uns sur les autres, provoquant des blessures, voire la mort par suffocation de certains individus (Mills et Faure, 1990). Or, le respect du bien-être animal implique la recherche de conditions d élevage minimisant les émotions négatives. Ces problèmes ont motivé des travaux visant à comprendre les mécanismes d expression des comportements de peur chez les oiseaux, entre autres au niveau neurobiologique (Boissy et al., 2007). Ainsi, notre objectif a été d étudier les mécanismes neurobiologiques de la peur chez les oiseaux et de les mettre en relation avec les comportements de peur. A la suite de cette brève introduction, nous commencerons par définir les émotions puis cette émotion négative qu est la peur. Nous verrons ensuite comment est étudiée la peur chez les oiseaux et quelles sont les principales connaissances sur la neurobiologie des comportements de peur chez les mammifères et chez les oiseaux. 3

12 Introduction A / Peut on énoncer une définition des émotions? «L une des choses les plus pertinentes qui aient été dites au sujet de l émotion pourrait être que tout le monde sait ce dont il s agit jusqu au moment où on demande de la définir» (LeDoux, 1996). En effet, la principale difficulté concernant l analyse des émotions tient à l absence de définition consensuelle entre les théoriciens, ou d une théorie dominante permettant d expliquer le phénomène émotionnel (Christophe, 1998). Les psychologues ont reconnu l étendue des facettes que recouvre l étude des émotions et ont proposé plusieurs classifications. Ainsi, les théories varient selon que l on s intéresse aux composantes de l émotion, aux mécanismes déclenchants, aux effets de l émotion sur les comportements ou aux fonctions de l émotion. Les premières théories des émotions sont essentiellement fondées sur le rôle supposé de l activation physiologique dans le déclenchement et le déroulement de l émotion. Selon la théorie périphérique de James (1884, cité par Christophe, 1998), tout à fait révolutionnaire à l époque, l émotion résulte de la perception des changements physiologiques déclenchés par la perception d un stimulus. Cette théorie suppose l existence d une activation physiologique spécifique à chaque émotion. La théorie centrale des émotions de Cannon (1927, cité par Christophe, 1998) s oppose à la vision de James et propose que la différenciation des émotions se fasse au niveau du système nerveux central. La perspective centraliste de Cannon ne considère plus les changements physiologiques comme cause de l émotion mais plutôt comme conséquence de l expérience émotionnelle. Par la suite, des théories dites cognitives ont apporté un regard nouveau en soulignant l importance de l évaluation subjective du stimulus dans la genèse des émotions. Selon ces théories, les processus cognitifs sont reliés au déclenchement et au déroulement de l émotion. Ainsi, le résultat de l évaluation cognitive de la situation est à l origine de l émotion ressentie et de sa différentiation (Leventhal et Scherer, 1987). D autres théories, dites néo-darwiniennes, se sont focalisées sur l histoire évolutive des expressions émotionnelles, en distinguant des émotions de base (telles que la peur, la joie ou la tristesse) et des émotions plus complexes qui correspondent à des interactions entre différentes émotions de base. Dans ce modèle, des fonctions adaptatives peuvent être attribuées à chaque émotion de base (Plutchik, 1984, cité par Christophe, 1998; Ekman, 1992). Ces théories sont, par exemple, à l origine de travaux qui ont permis d identifier des circuits neuronaux différenciés pour les émotions de base (Panksepp, 1982 ; LeDoux, 1996). Néanmoins, le concept d émotions de base, probablement trop simpliste, fait aujourd hui l objet de critiques. L existence d émotions de bases est remise en question par la reconnaissance des aspects multidimensionnels au 4

13 Figure introduction 1: Manifestations objectivables d un état émotionnel chez les oiseaux. Expérience subjective Réponses Comportementales Stimulations de l environnement Réponses Neurobiologiques Réponses Physiologiques Critères indicateurs de l état émotionnel

14 Introduction sein de chaque émotion. Chaque émotion serait constituée de dimensions discrètes indépendantes et spécifiquement associées à des situations précises (Russell, 2003). Bien que la liste des théories mentionnées ci-dessus ne soit pas exhaustive, elle constitue un bref historique des discussions centrées sur la conceptualisation de l émotion. Ainsi, les différentes théories abordent les émotions d un point de vue qui leur est propre et y intègrent une définition spécifique (les différentes théories proposées n étant pas toujours incompatibles). Devant cette diversité, nous avons initialement choisi de nous placer dans un cadre conceptuel adapté à l étude des émotions chez l animal, c'est-à-dire intégrant la notion d une continuité phylogénétique des expressions émotionnelles dans le règne animal. De plus, au cours de la thèse, nous tenterons d aborder les émotions en tant que processus multidimensionnel. Ainsi, nous utiliserons une définition de l émotion largement acceptée par de nombreux biologistes travaillant sur les émotions des animaux : une émotion est une réponse affective, intense et de courte durée caractérisée par trois composantes : une composante subjective qui est l expérience émotionnelle proprement dite (le sentiment éprouvé), une composante somato-motrice (une posture ou une activité) et une composante neuroviscérale (Dantzer, 1988). Cette définition est opérationnelle pour étudier les émotions des animaux car, si la composante subjective reste supposée et inaccessible, l observation du comportement et de la physiologie des animaux peut nous renseigner sur leur état émotionnel. Pour que des réponses émotionnelles, comportementales et physiologiques, se produisent après une modification de l environnement, il est nécessaire que le cerveau de l animal perçoive les informations en provenance de l environnement et les intègre. Cette intégration se traduit par un ensemble de réponses neurobiologiques qui sont aussi des manifestations objectivables d un état émotionnel (voir figure introduction 1). 5

15 Introduction B / Qu est-ce que la peur? La peur est l une des émotions les plus étudiées et de nombreuses définitions ont été offertes par divers auteurs pour décrire un phénomène dont chacun a fait l expérience. Le concept de «peur» est couramment utilisé pour désigner au moins 3 phénomènes : l émotion ressentie par l individu, les réponses comportementales ou physiologiques associées à cette émotion et l exposition à la situation qui provoque les réactions de peur (Murphy, 1978, Jones, 1996). Dans la présente étude, le terme «peur» employé seul est réservé à un état émotionnel ponctuel se traduisant par des réactions comportementales et neuroviscérales et ainsi défini : la peur est une émotion adaptative visant à protéger l animal lors de la perception d un stimulus dangereux ou identifié comme tel (Boissy, 1995 ; Jones, 1996). Par ailleurs, on distingue deux types de peur selon le stimulus déclenchant : la peur dite spontanée ou innée qui est induite par un stimulus spécifique en relation avec l histoire évolutive de l espèce, tel qu un prédateur, l obscurité ou la nouveauté ; et la peur conditionnée qui résulte d une expérience passée au cours de laquelle s est produit une association entre un stimulus a priori neutre et un événement effrayant (Gray, 1987). Dans la littérature, l utilisation de concepts proches de la peur tels que l anxiété, le stress et/ou l émotivité ont été à l origine de fréquentes ambiguïtés. L anxiété est certainement le phénomène émotionnel le plus difficile à dissocier de la peur. Alors que la peur est un état ponctuel répondant à un danger réel et identifié, l anxiété est souvent définie comme un état plus durable de tension ou d appréhension répondant à l anticipation d un danger potentiel et/ou imaginé (Boissy, 1995 ; Jones, 1996). La réaction de stress, est caractérisée par un ensemble de réponses physiologiques non spécifiques permettant à l organisme de résister à des stimuli environnementaux et de retrouver un équilibre initial (homéostasie) (Ramos et Mormède, 1998 ; Veissier et Boissy, 2007). Le stress n est pas en lui même une émotion mais il est parfois associé à une ou plusieurs émotions telles que l anxiété ou la peur. Enfin, l émotivité se distingue de la peur puisqu elle désigne la propension d un individu à exprimer des réactions émotionnelles (Savage, 1964). Dans le cadre d une situation effrayante, l émotivité (traduction de «fearfulness») se définit alors comme la propension d un individu à exprimer des réactions de peur (Boissy, 1995, Jones, 1996). Face à une situation légèrement effrayante, des individus très émotifs sont susceptibles d exprimer des réponses de peur marquées, là où des individus peu émotifs ne montreront pas ou peu de réponses de peur. Le seuil de déclenchement des réactions de 6

16 Introduction peur est donc plus bas chez les individus émotifs que chez les individus peu émotifs, mais une grande émotivité n implique pas un état de peur permanent. C/ Comment appréhender la peur chez les oiseaux? Nous avons vu plus haut que la composante subjective de la peur, comme pour toutes les émotions, n est pas objectivable chez les animaux. En expérimentation animale, la peur est donc évaluée à partir d un ensemble de réponses comportementales et neuroviscérales reconnues comme manifestations objectivables d un état de peur, initié par une situation effrayante. Nous verrons ici les situations génératrices de peur utilisées en expérimentation animale chez l oiseau. Ensuite, nous détaillerons les réponses associées à ces situations qui sont utilisées comme indicateurs d un état de peur. Enfin, nous verrons comment l utilisation d un modèle génétique sélectionné sur un comportement de peur peut apporter une aide à l étude de cette émotion. 1/ Situations génératrices de peur chez les oiseaux. De nombreux critères de classification de situations provoquant la peur ont été proposés (Hebb, 1953 ; Gray, 1987 ; Jones, 1996), mais il est nécessaire de garder à l esprit que l extrême diversité des situations peut complexifier indéfiniment toute tentative de généralisation (Russel, 1979). De nombreuses situations peuvent être effrayantes par leur caractère nouveau ou soudain, alors que d autres sont intrinsèquement effrayantes (la silhouette de certains prédateurs par exemple), d autres encore peuvent devenir effrayantes après association avec un stimulus nocif (Russel, 1979 ; Boissy, 1995). Jones (1996) ne cite, par exemple, pas moins de 11 situations pouvant provoquer la peur chez les volailles en élevage, telles que la nouveauté, la soudaineté, le changement d environnement, l exposition à de grands espaces découverts ou encore la présence d un prédateur (dont l homme). La plupart des tests de peur utilisés chez l oiseau présentent au moins une des ces composantes. On citera par exemple, le test d open-field qui consiste à observer les réactions de l animal placé dans un espace souvent plus grand et plus éclairé que la cage d élevage, nouveau et vide (Candland et Nagy, 1969 ; Jones, 1996). Dans ce test, l animal subit donc un changement d environnement associé à une manipulation par l homme. De plus, l expérimentateur peut ajouter des événements supplémentaires au cours du test, telle que, par exemple, la présentation soudaine d un objet nouveau. On peut ainsi générer différentes situations de peur en fonction des composantes présentes dans le test utilisé. 7

17 Figure introduction 2: Stimuli inducteurs d un état de peur dans les principaux tests de peur utilisés chez les oiseaux Tests Test d open field Test d émergence Stimuli inducteurs de l état de peur - Manipulation par l homme - Nouveauté de l environnement - Espace «ouvert» (=sans abri potentiel, vide et très éclairé) -Manipulation i par l homme - Nouveauté de l environnement - Espace «ouvert» / Espace fermé Test d immobilité tonique - Manipulation par l homme - Nouveauté de l environnement - Contention - «Prédation» Test de contention - Manipulation par l homme - Nouveauté de l environnement - Contention Test de l objet nouveau dans la cage d élevage - Nouveauté - Soudaineté Test de présentation d un leurre de prédateur dans la cage d élevage - Nouveauté - Soudaineté - Prédation

18 Introduction Chez l oiseau, les tests de peur les plus fréquemment utilisés sont, outre le test d openfield : la présentation d un leurre de prédateur ; la présentation d un objet nouveau ; le test d approche de l homme ; le test d émergence (ou «hole-in-the-wall test») qui consiste à placer l animal isolé dans une enceinte obscure dont l unique sortie donne sur une enceinte plus vaste et plus éclairée (Jones, 1996) ; le test de contention qui consiste à contenir les mouvements de l animal dans une boîte étroite (Satterlee & Johnson, 1988 ; Jones et al., 2000) ; et le test d immobilité tonique qui consiste à induire un comportement inné d inhibition motrice par contention manuelle de l oiseau placé sur le dos (Jones, 1996). Les stimuli inducteurs de peur dans ces tests sont énoncés dans la figure introduction 2 avec des illustrations des tests. Les situations de peur citées ci-dessus, provoquent chez l oiseau une peur spontanée, dans le sens où elles ne requièrent aucun conditionnement de la part de l oiseau, mais il existe aussi des tests qui s inscrivent dans un paradigme de peur conditionnée. Dans ce cas, l expérimentateur présente à l animal un stimulus neutre appelé stimulus conditionné (un son, un objet ou un contexte par exemple) en association avec un stimulus nocif appelé stimulus inconditionné (choc électrique par exemple). Après une ou plusieurs présentations associant ces deux stimuli, l animal exprime des réponses de peur à la seule présentation du stimulus neutre, sans qu il soit nécessaire de présenter le stimulus nocif à l animal (Domjan, 1996) (voir figure introduction 3). Les tests de peur conditionnée sont très souvent utilisés chez les rongeurs notamment pour étudier les mécanismes neurobiologiques des réponses de peur. Le paradigme de peur conditionnée établi par LeDoux a ainsi permis de dégager des circuits cérébraux, centrés sur l amygdale, impliqués dans les réponses de peur chez le rat (LeDoux, 1996 ; 2000). Bien que de récentes études de neurosciences comportementales ont utilisé de tels paradigmes de conditionnement chez le pigeon (Lissek et Güntürkün, 2003 ; Brito et al., 2006), les tests de peur conditionnée ont été peu employés par le passé chez les oiseaux. Ainsi, les connaissances concernant les réponses de peur spontanée chez les oiseaux, sont bien plus fournies que celles concernant les réponses de peur conditionnée. 8

19 Figure introduction 3 : Exemples de tests de peur conditionnée au son (à gauche) et au contexte (à droite). SC / SI : Stimulus Conditionné / Inconditionné Séance de conditionnement: association Son-Chocs électriques Son (SC) Chocs électriques (SI) Test de rappel du son Test de rappel du contexte Nouveau contexte Son seul Même contexte Pas de son Peur conditionnée au son Peur conditionnée au contexte

20 chez l oiseau. Introduction 2/ Réactions comportementales et physiologiques indicatrices d un état de peur a) Les réactions comportementales En milieu naturel, selon une théorie formulée initialement par Ratner (1967, cité par Gallup, 1974), les comportements de peur des oiseaux s inscrivent selon une chaîne de réponses qui est fonction de la distance au prédateur. Si l oiseau identifie un prédateur à grande distance, il s immobilise, cette immobilisation pouvant être totale («freezing»), ce qui peut lui éviter d être repéré par le prédateur. Si la distance avec le prédateur se réduit, l animal peut tenter de fuir ou entamer un combat avec son prédateur (flight or fight). Enfin, s il est capturé par son prédateur, l oiseau peut exprimer un comportement d inhibition motrice appelé immobilité tonique. On parle d immobilité «tonique» car dans cette situation de nombreux muscles de l animal sont mis en tension (Gentle et al., 1989). Cette absence totale de mouvement de la part de la proie a été décrite comme une simulation de mort par certains auteurs (Rovee et al., 1976) et semble provoquer un désintérêt du prédateur pour la proie. En effet, il a été montré que la mortalité de cailles présentant l immobilité tonique face à l attaque d un chat est plus faible que celle de cailles ne présentant pas ce comportement (Thompson et al., 1981). Ce résultat conforte des hypothèses antérieures concernant le caractère adaptatif de l immobilité tonique (Ratner 1967, cité par Gallup, 1974). Jones (1987a), quant à lui, classifie les réponses de peur chez les oiseaux en fonction de leur intensité, théorie qui n est pas incompatible avec celle de Ratner. Ainsi, selon Jones, plus l animal est effrayé par la situation ou le stimulus, plus il s immobilise : la fuite correspondrait alors à une réponse de peur de faible intensité, alors que le freezing puis l immobilité tonique correspondraient à des réponses de plus forte intensité. En condition expérimentale, le «freezing», la fuite, l évitement et l immobilité tonique sont les principaux comportements utilisés comme indicateurs de peur, différentes réponses s exprimant selon le test utilisé. Dans un test de peur qui consiste à introduire un stimulus nouveau dans l environnement familier de l oiseau, tel qu un leurre de prédateur, un objet nouveau ou encore si un humain s approche, on peut observer des comportements de fuite et d évitement, qui peuvent être mesurés par la distance entre le stimulus et l oiseau, des comportements de «freezing», et/ou des tentatives de menace ou de combat envers le stimulus (Sefton, 1976 ; Hemsworth et al., 1994 ; Jones, 1996 ; Richard-Yris et al., 2005). Dans le test d open-field, on considère généralement (en se basant sur les 9

21 Introduction observations de Jones) que les animaux les plus inactifs, immobiles et silencieux, sont plus effrayés que ceux qui émettent des vocalisations, se déplacent ou explorent l environnement (Jones, 1989 ; 1996). Dans le test d émergence, le temps de sortie de l enceinte obscure est un bon indicateur de peur. Ainsi, plus l animal sort rapidement de l enceinte obscure pour se diriger vers l espace ouvert et inconnu, moins il est considéré comme effrayé (Russell, 1979 ; Jones, 1996). Dans le test de contention, on considère que plus l animal se débat, moins il est effrayé par la situation (Jones et Satterlee, 1996 ; Jones et al., 2000). Dans le test d immobilité tonique, la durée de maintien de ce comportement d immobilité est considérée comme corrélée positivement à la peur de l oiseau (Gallup, 1979 ; Jones, 1986 ; 1996). En effet, ces auteurs montrent que plus l oiseau a été effrayé avant l induction de l immobilité tonique, plus la durée de ce comportement dans le test sera longue. En situation expérimentale, ce comportement n est observé que dans le test d immobilité tonique, car il ne peut pas se mettre en place spontanément en réponse à un stimulus tel que, par exemple la présentation d un objet nouveau (la confrontation directe entre proie et prédateur est rare en milieu expérimental car elle pose de nombreux problèmes, notamment d ordre éthique). Par ailleurs, il est intéressant de noter que ces réponses individuelles peuvent varier qualitativement ou quantitativement, au sein d une même espèce, en fonction de divers facteurs tels que le patrimoine génétique, le sexe, l âge ou l expérience antérieure de l individu (Murphy, 1978). L influence de tels facteurs donnera lieu à une variabilité entre les individus de la population considérée et peut, dans certains cas, compliquer l analyse. De plus, l interprétation d un comportement par son observateur peut être sujette à controverse. On considère, par exemple, que la peur est le principal système de motivation activé par la nouveauté, mais l exploration est également susceptible de diriger le comportement de l oiseau dans une situation nouvelle (Murphy, 1978 ; Faure et al., 1983 ; Jones, 1989). Pour appréhender un état émotionnel chez l animal, il est donc utile de prendre en compte non seulement les réponses comportementales mais aussi d autres facteurs tels que les caractéristiques de la situation ainsi que d autres réponses de l animal, comme les réponses physiologiques. 10

22 Figure introduction 4 : Réactions du système nerveux autonome et de l axe corticotrope lors d une situation effrayante. Hypothalamus CRF Hypophyse Axe corticotrope ACTH Système nerveux autonome Glandes surrénales Système nerveux sympathique Système nerveux parasympathique Corticostérone Catécholamines Foie Glucose Coeur Poumon Muscle

23 Introduction b) Les réactions physiologiques Parallèlement aux réponses comportementales, l occurrence et l intensité des réponses physiologiques peuvent renseigner sur l état de peur d un individu. Les réactions physiologiques sont cependant rarement utilisées comme seuls indicateurs de peur, dans la mesure où une même réponse physiologique de stress peut être déclenchée par diverses atteintes à l intégrité de l organisme (Jones, 1987a). Par contre, en association avec d autres critères comme la caractérisation de la situation, associée aux comportements exprimés, les réponses physiologiques permettent de fournir des informations complémentaires intéressantes, notamment sur le niveau de réponse engagé et sur sa cinétique (Jones, 1987a). D un point de vue général, au niveau périphérique, l axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (ou axe corticotrope) et le système nerveux autonome sont considérés comme les deux systèmes majeurs impliqués dans les réponses émotionnelles chez les oiseaux, au même titre que chez les mammifères (Siegel, 1980 ; Boissy, 1995). L activation de ces deux systèmes physiologiques va se traduire par des modifications au niveau nerveux et au niveau humoral. Bien que la fonctionnalité de l axe corticotrope et du système nerveux autonome ait fait l objet de beaucoup moins d attention chez les oiseaux que chez les mammifères, l organisation générale et les rôles biologiques de ces deux systèmes restent comparables entre les deux classes (Hill, 1983 ; Kuenzel, 1999 ; Hazard, 2005 ; Valance, 2006). Le système nerveux autonome agit sur tous les organes et tissus innervés chez les vertébrés, à l exception des fibres musculaires squelettiques. Il s organise en deux branches : le système nerveux parasympathique et le système nerveux sympathique, ce dernier étant celui qui est activé en situation de stress. L activation du système nerveux sympathique provoque la libération de catécholamines, essentiellement adrénaline et noradrénaline, par le tissu surrénalien, et engendre un ensemble de réponses physiologiques telles qu une accélération du rythme cardiaque, une augmentation de la pression artérielle, une augmentation du rythme respiratoire (Hill, 1983 ; Kuenzel, 1999), (voir Figure introduction 4). Le suivi des rythmes cardiaque et respiratoire peut ainsi être utilisé, en association avec les réponses comportementales, comme indicateur de peur chez les oiseaux. Par exemple, de récentes études montrent que la présentation d un bruit nouveau et soudain chez la caille entraîne une augmentation de la fréquence cardiaque associée à des réponses comportementales de peur telles que le «freezing» (Valance, 2006 ; Valance et al., 2007). 11

24 Introduction L activation émotionnelle induite par un stimulus effrayant constitue une des situations capables de déclencher une activation de l axe corticotrope. Elle conduit à la libération en cascades successives de peptides hypothalamiques (CRF i.e. Corticotropin Releasing Factor et/ou AVT i.e. Arginine VasoTocin) par le noyau paraventriculaire de l hypothalamus (PVN), puis hypophysaires (ACTH i.e. AdenoCorticoTropic Hormone) et enfin de glucocorticoïdes par les surrénales. La forme prépondérante des glucocorticoïdes circulants chez l oiseau est la corticostérone dont le taux plasmatique peut être utilisé comme indicateur de peur (Hill, 1983; Silverin, 1998). Par exemple, la présentation d un objet nouveau chez la caille, induit une augmentation du taux de corticostérone ainsi que des réponses comportementales de peur telles que des tentatives de fuite et un évitement de l objet (Richard et al., 2007b). Comme leur nom l indique, les glucocorticoïdes jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme glucidique. L augmentation généralisée du métabolisme glucidique prédispose l organisme à une réponse comportementale en situation de stress en augmentant la libération de glucose par le foie via la néoglucogenèse. Le glucose ainsi libéré permet notamment de fournir l énergie nécessaire aux muscles pour mettre rapidement en œuvre cette réponse (voir figure introduction 4). Ainsi, pour évaluer la peur chez les oiseaux, différents paramètres physiologiques tels que les rythmes cardiaques et respiratoires, les concentrations sanguines de catécholamines et de corticostérone ou une mesure de l expression du CRF au niveau hypothalamique, peuvent être mesurés en complément de l analyse comportementale. 3/ Apports des sélections génétiques pour étudier la peur chez les animaux. Chez les oiseaux comme chez les mammifères, l utilisation de lignées génétiquement sélectionnées sur un comportement ou une réponse physiologique, constitue une approche scientifique développée pour appréhender les émotions chez l animal. En effet, la comparaison d animaux aux réponses extrêmes et divergentes dans une situation donnée, facilite la compréhension des mécanismes liés à ces réponses (Landgraf et Wigger, 2002). Ainsi, on trouve de nombreux exemples de sélections génétiques sur diverses réponses comportementales ou physiologiques émotionnelles dans différentes espèces. Nous commencerons par donner un exemple chez les rongeurs qui démontre bien l intérêt que peuvent avoir de telles sélections pour l étude des mécanismes de peur. Une sélection génétique sur les réponses comportementales dans un test d anxiété (le test de «labyrinthe» en croix surélevée, contenant deux bras «ouverts» et deux bras «fermés») a permis d établir deux lignées de rats Wistar : les rats HAB pour High 12

25 Introduction Anxiety-related Behaviour et les rats LAB pour Low Anxiety-related Behaviour. Par la suite, diverses études ont démontré l existence d une différence de réponses d anxiété chez ces deux lignées de rats HAB et LAB, non seulement au niveau comportemental, mais aussi au niveau physiologique et neurobiologique (pour revue voir Landgraf et Wigger, 2002). En effet, les rats de la lignée HAB expriment davantage de comportements anxieux que les rats de la lignée LAB dans diverses situations anxiogènes : ils explorent moins et sont plus immobiles dans les test d open field et d open arm (correspondant au test en croix surélevé sans les bras «fermés»), et se débattent moins dans le test de nage forcée, (Landgraf et al., 1999 ; Salomé et al., 2002 ; Landgraf et Wigger, 2002). De plus, les rats HAB montrent une hyperactivité de l axe corticotrope que ne montrent pas les rats de la lignée LAB. En effet, après 5 min d exposition dans le test d open arm, les rats HAB montrent une augmentation des concentrations d ACTH et de corticostérone plasmatiques plus importantes que chez les rats LAB (Landgraf et al., 1999). De plus, un marquage immunohistochimique de la protéine Fos après exposition aux tests d open field et d open arm, a permis de visualiser des différences d activation neuronale entre les rats HAB et LAB dans des structures potentiellement impliquées dans l expression des réponses émotionnelles telles que le PVN, la formation hippocampale et le cortex cingulaire (Salomé et al., 2004). L ensemble des particularités qu expriment les rats des deux lignées, a été mis en parallèle avec certains symptômes de patients souffrant de maladies psychiatriques liées à l anxiété chez l homme et les rats HAB/LAB ont été largement utilisés dans des paradigmes portant sur la compréhension des mécanismes biologiques de l anxiété (Landgraf & Wigger, 2002). Ainsi, le modèle des lignées HAB et LAB constitue un parfait exemple d approche utilisée en neurogénétique du comportement pour étudier les mécanismes d une émotion chez l animal. Chez les oiseaux, il existe deux principaux modèles de sélection génétique sur des réponses de peur ; le premier concerne une sélection sur un paramètre physiologique et le second, une sélection sur un paramètre comportemental. Ainsi, deux lignées de cailles japonaises ont été sélectionnées sur leur taux de corticostérone plasmatique en réponse à une contention dans un environnement nouveau (Satterlee et Johnson, 1988) : les cailles HS (pour High Stress) à fort taux de corticostérone après contention et les cailles LS (pour Low Stress) à faible taux de corticostérone après contention. Par ailleurs, les cailles de la lignée HS présentent aussi une longue durée d immobilité tonique dans le test d immobilité tonique, alors que les cailles de la lignée LS montrent une faible durée d immobilité tonique (Jones et al., 1992). Cette sélection réalisée sur une réponse physiologique de peur 13

26 Introduction a donc entraîné une modification des réponses comportementales de peur des animaux sélectionnés. Ainsi, l utilisation des deux lignées de cailles HS et LS contribue à mieux comprendre la relation qui existe entre la réponse de l axe corticotrope et les réponses comportementales de peur chez les oiseaux (Jones et al., 1992 ; Satterlee et Martin, 2006). D autre part, deux lignées de cailles japonaises ont été sélectionnées génétiquement sur leurs réponses comportementales dans le test d immobilité tonique. Cette sélection, initiée à la fin des années 80 par Mills et Faure (1991) a permis de générer deux lignées de cailles divergeant par leur durée d immobilité tonique : les cailles de la lignée LTI (pour Long Tonic Immobility), à longue durée d immobilité tonique et les cailles de la lignée STI (pour Short Tonic Immobility), à courte durée d immobilité tonique. Ces deux lignées de cailles diffèrent par leur propension à exprimer des comportements de peur dans diverses situations génératrices de peur : les cailles de la lignée LTI présentent des comportements de peur exacerbés alors que les cailles de la lignée STI montrent des comportements de peur réduits. Ces deux lignées montrent également des différences au niveau physiologique. Par exemple, en condition basale, les cailles LTI montrent une fréquence cardiaque plus élevée que les cailles STI (Valance, 2006 ; Valance et al., 2007). Lors de la présentation d un son nouveau, l activité du système nerveux sympathique augmente chez les deux lignées mais chez les cailles STI, le système nerveux parasympathique est également activé (Valance, 2006 ; Valance et al., 2007). De plus, en réponse au test de contention, les cailles STI montrent une augmentation de la corticostéronémie plus marquée que les cailles LTI (Hazard et al., 2007). Le sens de cette différence, a priori étonnant, pourrait s expliquer par le fait que les cailles STI se débattent plus que les cailles LTI dans le test de contention, le taux de corticostérone plasmatique étant corrélée à l activité physique chez les oiseaux (Rees et al., 1985). Enfin, des lésions d une région cérébrale (l arcopallium et l amygdale palliale postérieure) connue pour être impliquée dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux entraîne une diminution de la durée d immobilité tonique uniquement des cailleteaux de la lignée LTI (Davies et al., 1997b). Ainsi, les lignées STI/LTI montrant, à l instar des modèles utilisés chez les rongeurs, un large éventail de différences, à la fois comportementales, physiologiques et neurobiologiques, constituent un modèle adéquat pour l étude des mécanismes neurobiologiques associés aux comportements de peur chez les oiseaux. De plus, l accumulation de données obtenues au laboratoire sur ces lignées représente un apport non négligeable dans cette investigation. Comme ces lignées ont été utilisées au cours de cette 14

27 Figure introduction 5 : Structures impliquées dans le système limbique selon MacLean. Cortex cingulaire Aire septale Hypothalamus Hippocampe Amygdale Septum Cortex préfrontal

28 Introduction thèse, les données les concernant seront davantage détaillées dans le chapitre dédié au modèle expérimental. D/ Comment le cerveau «contrôle-t-il» la peur? L expression d un comportement de peur après une stimulation effrayante nécessite un traitement de cette stimulation au niveau du système nerveux central. Ainsi les réponses neurobiologiques associées aux comportements peuvent aussi être indicatrices d un état de peur (Figure introduction 1). Bien que l organisation générale du cerveau d oiseau soit assez différente de celle des mammifères (notablement en ce qui concerne le cerveau antérieur), les études portant sur les oiseaux se sont largement appuyées sur les informations disponibles chez les mammifères. Par conséquent, avant d exposer l état actuel des connaissances sur la neurobiologie des comportements de peur chez les oiseaux, nous rapporterons dans les grandes lignes, les informations connues chez les mammifères qui seront nécessaires à la compréhension des études portant sur l oiseau. 1) Connaissances générales sur la neurobiologie des comportements de peur chez les mammifères Chez les mammifères, les structures centrales spécifiquement impliquées dans le contrôle des émotions ont été qualifiées de limbiques depuis le début du 20 ième siècle. Le terme «limbique» trouve son origine dans la définition proposée par Paul Broca (1878, cité par Morgane et al., 2005) d un lobe limbique constitué par les régions corticales formant une limite annulaire (en latin limbus, la limite) autour du bord médian des hémisphères cérébraux et contenant l amygdale et le cortex cingulaire. L hypothèse selon laquelle ce lobe limbique constituerait le berceau de la genèse des émotions a été formulé par Papez en 1937 (cité par Morgane et al., 2005) et propose un circuit contenant le thalamus, l hypothalamus, la formation hippocampale et le cortex cingulaire. En 1954, Mac Lean (cité par Morgane et al., 2005) complexifie le modèle de Papez en y introduisant le concept de système limbique qui n est autre que le circuit de Papez, augmenté de l amygdale (fortement connectée à l hypothalamus), du septum et du cortex préfrontal (voir figure introduction 5). Aujourd hui cette théorie du système limbique, centre des émotions, apparaît cependant trop simplificatrice. En effet, les émotions interagissent avec des fonctions variées (alimentation, reproduction, liens sociaux ) et les circuits des émotions 15

29 Figure introduction 6 : Les deux voies de traitement de la peur selon LeDoux. Cortex Route longue Hippocampe Contexte Thalamus sensoriel Route courte Amygdale Stimulation émotionnelle Réponse émotionnelle

30 Introduction sont intimement liés à de nombreux autres circuits. Il est donc impossible de dessiner les limites d un éventuel centre des émotions au sein du cerveau. On sait désormais que les structures dites «limbiques» citées ci-dessus n en sont pas moins impliquées, mais elles participent chacune à plusieurs réseaux et ne sont pas les seules structures à être concernées (LeDoux, 1996). Il semblerait donc que les émotions n impliquent pas un seul système, mais il reste pratique d utiliser le terme de structure «limbique» pour désigner une région du cerveau participant majoritairement au contrôle des émotions. Nous présenterons ici quelques structures du cerveau de mammifère connues pour leur implication dans le contrôle de la peur et qui seront utiles à la comparaison avec les oiseaux. a) L amygdale La plus connue des structures dites «limbiques» est certainement l amygdale : une région en forme d amande (amygdale signifie amande en grec) dans la partie médiane du lobe temporal chez les mammifères. Cette structure est hétérogène car organisée en plusieurs noyaux dont l organisation structurale et l origine embryologique diffèrent (Swanson et Petrovich, 1998). C est à l aide d un paradigme de conditionnement de peur chez le rat, associant un son neutre et des chocs électriques, que Joseph LeDoux a décrit et démontré le rôle clé de l amygdale dans l élaboration des réponses comportementales et neurovégétatives de peur chez le mammifère (pour revue voir LeDoux, 2000). Sa théorie propose deux voies distinctes de traitement lorsqu un stimulus potentiellement dangereux est perçu par l animal (Phelps et Ledoux, 2005 ; figure introduction 6). La première voie permet de traiter le stimulus rapidement mais de façon peu précise, en déclenchant automatiquement des réponses de peur permettant éventuellement de faire face au danger. Cette voie est appelée rapide et grossière car dans cette situation, une stimulation potentiellement dangereuse envoie un message directement au thalamus qui projette vers l amygdale pour une activation rapide de réactions comportementales et physiologiques. La deuxième voie permet un traitement plus fin, mais plus lent du stimulus, qui se traduit par l établissement de comportements adaptés : maintien des comportements de peur s il s agit d un danger réel, ou au contraire inhibition de cette émotion superflue s il n y a pas de danger. Cette voie est plus lente et l analyse de la situation y est plus précise car la stimulation dangereuse active, après passage par le thalamus, le cortex qui enverra son message à l amygdale (voir figure introduction 6). 16

31 Figure introduction 7 : Illustration du positionnement de l amygdale au cœur du circuit de peur conditionnée au son (modifié d après Phelps & LeDoux, 2005) SC = son SI = choc aux pattes Thalamus auditif Amygdale LA Thalamus somatosensoriel Cortex auditif Ce Cortex somatosensoriel PAG HL PVN NC NB NPB Immobilité de peur Pression Glucocorticoïdes sanguine Sursaut de peur Éveil Fréquence respiratoire Ce = Noyau central de l amygdale; HL= hypothalamus latéral; LA= Noyau latéral de l amygdale; NB= Noyau basalis; NC= Noyau caudé du pont; NPB= Noyau parabrachial; PAG= Substance grise périaqueducale; PVN= Noyau paraventriculaire de l hypothalamus; SC / SI= Stimulus Conditionné / Inconditionné

32 Introduction Dans le paradigme décrit par LeDoux, il a été montré que les afférences sonores provoquées par le stimulus se font majoritairement au niveau du noyau latéral de l amygdale, soit directement via le thalamus auditif, soit indirectement via le cortex auditif primaire. Alors que le noyau latéral de l amygdale semble être un lieu d intégration des informations, le noyau central semble être celui par lequel l information quitte l amygdale. En effet, il est la cible principale des projections du noyau latéral et projette à son tour vers de nombreuses structures impliquées dans la genèse des réponses comportementales et physiologiques, telles que, par exemple, la substance grise périaqueducale pour l expression d immobilité, le noyau paraventriculaire de l hypothalamus pour la libération d hormones corticotropes, ou encore le noyau caudé du pont pour la régulation des réflexes de sursaut de peur (Swanson et Petrovich, 1998, LeDoux, 2000 ; Phelps et LeDoux, 2005 ; voir figure introduction 7). La description de ces circuits simples nous offre une bonne idée de la place que peut prendre l amygdale dans les systèmes de contrôle des comportements de peur en général, mais ces réseaux se compliquent très rapidement avec la complexité des stimuli mis en jeu (LeDoux, 2000). Ainsi, le rôle de l amygdale dans un contexte de peur non conditionnée tel que par exemple, l exposition à une odeur de prédateur, reste encore controversé (Muller et Fendt, 2006 ; Rosen et Donley, 2006). b) Le noyau du lit de la strie terminale (BNST) Parallèlement aux études portant sur l amygdale, le rôle du BNST a aussi été largement examiné, notamment car cette structure constitue un relais majeur entre certains noyaux de l amygdale et le noyau paraventriculaire de l hypothalamus, qui contrôle l axe corticotrope. Du fait de cette position stratégique du BNST et de ses relations neurochimiques et embryologiques avec l amygdale (Alheid et al., 1995), il était logique de penser que le BNST montrerait des similarités fonctionnelles avec l amygdale (pour revue voir Walker et al., 2003). Cependant, des lésions du BNST chez le rat, contrairement à des lésions de l amygdale, ne modifient pas le comportement de peur de rats dans un paradigme de peur conditionnée associant un son à un stimulus nocif (Sullivan et al., 2004). Les études portant sur le BNST se sont alors dirigées sur son implication dans le contrôle des réactions de peur spontanée (face à une odeur de prédateur par exemple) et des réactions d anxiété. Il était alors supposé que là où l amygdale jouait un rôle de structure clé dans le contrôle des réactions de peur dans un contexte de peur conditionnée, le BNST serait à l origine de la mise en place de réponses de peur non conditionnée et des 17

33 Introduction réponses d anxiété (Walker et al., 2003). Cependant, comme pour justifier que le vivant n est jamais aussi catégorique, de récentes études ont montré que le BNST pourrait aussi être impliqué dans des situations de peur conditionnée lorsque le stimulus conditionné n est plus un son ou une odeur, mais un contexte (Sullivan et al., 2004). Il semble donc qu à l heure actuelle, la recherche portant sur la neurobiologie des comportements de peur n ait pas encore dévoilé tous les secrets du BNST. c) L hippocampe Les premières théories du système limbique prévoyaient un rôle central de l hippocampe dans le contrôle des émotions. Sa participation dans le contrôle direct des réponses de peur est aujourd hui légèrement atténuée puisqu il a été montré que l hippocampe est plus spécifiquement impliqué dans les apprentissages de peur au contexte à travers des processus de consolidation de la mémoire (pour revue voir Anagnostaras et al., 2001). Pour qu un animal soit capable de mettre en place des comportements de peur conditionnée à un contexte, il faut avant tout qu il soit capable de mémoriser le contexte dans lequel s est produit cette peur, c'est-à-dire d apprendre les caractéristiques de cet environnement. Or il a été montré que des lésions de l hippocampe entrainent une amnésie du contexte dans lequel le rat avait été conditionné à avoir peur (Anagnostaras et al., 2001). Bien que la participation de l hippocampe dans le contrôle des comportements de peur chez les mammifères semble indirecte, elle n en reste pas moins indispensable puisque des relations étroites existent entre mémoire et émotions la mémorisation des événements ayant provoqué une émotion étant primordiale pour l adaptation d un individu dans son environnement et donc pour sa survie. d) Le cortex préfrontal De nombreuses régions corticales ont été étudiées pour leur implication dans l expression des comportements de peur et notamment le cortex préfrontal. Une accumulation de données semble indiquer qu il intervient dans l extinction des réponses de peur dans des paradigmes de peur conditionnée. Lors de la phase d extinction de l apprentissage, c'est-à-dire lorsque le stimulus neutre n est plus associé aux chocs électriques, les réponses de peur de l animal diminuent. Or, il a été montré que des lésions du cortex préfrontal empêchent l extinction de l apprentissage en prolongeant les réponses de peur (Morgan et LeDoux, 1995, Quirk et al., 2006). En situation basale, le cortex 18

34 Introduction préfrontal aurait une action inhibitrice sur le noyau basolatéral de l amygdale (Grace et Rosenkranz, 2002). Cette inhibition est levée lors d une association entre un son et des chocs électriques, où le noyau basolatéral de l amygdale irait à son tour inhiber le cortex préfrontal (Garcia et al., 1999). Lors d une phase d extinction, le cortex préfrontal serait capable de moduler les réponses de peur via ses connexions à l amygdale pour un retour à une situation basale (Quirk et al., 2006). Cependant, ces résultats n ont pas été confirmés par l ensemble de la communauté scientifique puisque Vouimba et al. (2000) n ont pas observé d effet de lésions du cortex préfrontal sur l extinction d une peur conditionnée. D autres investigations sont donc encore nécessaires pour confirmer le rôle du cortex préfrontal dans l atténuation des réponses de peur. e) Le noyau paraventriculaire de l hypothalamus (PVN) Le PVN fait également partie des structures classiquement étudiées pour son rôle dans le contrôle des réponses émotionnelles, notamment en raison de ses afférences en provenance, par exemple, des noyaux amygdaliens, du noyau du lit de la strie terminale, de l hippocampe et du cortex préfrontal (Herman et al., 2005). De nombreuses études ont ainsi démontré une activation du PVN en réponse à différentes situations de peur telles que le test d open field (Emmert et Herman, 1999), les tests de «labyrinthe» en croix surélevée et d open arm (Salomé et al., 2004), la présentation d une odeur de prédateur (Dielenberg et al., 2001 ; Figueiredo et al., 2003). Le PVN projette sur l hypophyse et constitue ainsi le plus haut niveau de contrôle de l axe corticotrope (axe hypothalamohypophyso-surrénalien ; voir figure introduction 3) qui est activé en cas de stress. Il est, en effet, un centre de production de divers neuropeptides tels que le CRF, qui agit sur l hypophyse pour déclencher la libération d ACTH. L ACTH agit sur les surrénales pour induire la libération de glucocorticoïdes dans le sang (pour revues voir Aguilera, 1998 ; Landgraf, 2001 ; Schulkin et al., 2005 ; Herman et al., 2005). La plus forte concentration de neurones à CRF se trouve dans le PVN et cette population de neurones s active en réponse à différentes situations effrayantes chez le rat (Landgraf, 2001). En effet, on observe une forte augmentation de la concentration d ARNm du CRF dans le PVN après, par exemple, l exposition à un stress de contention (Hsu et al., 1998 ; Aguilera, 1998) ou à un nouvel environnement (Kabbaj et al., 2000). Nous avons donc vu ici des exemples de l éventail des connaissances sur la neurobiologie de la peur chez les mammifères, à travers les principes de fonctionnement de 19

35 Figure introduction 8 : Comparaison macroscopique de cerveaux chez les vertébrés. Mammifère Oiseau Reptile Poisson Amphibien Télencéphale Bulbe olfactif Lobe optique Cervelet Moelle épinière

36 Introduction quelques structures impliquées dans le contrôle des réactions de peur. Cette présentation n est pas exhaustive mais elle facilitera la compréhension des démarches entreprises pour progresser dans la connaissance de la neurobiologie des comportements de peur chez les oiseaux. 2) Etat actuel des connaissances sur la neurobiologie des comportements de peur chez les oiseaux Les structures centrales contrôlant le comportement des oiseaux sont souvent peu documentées et sujettes à controverse, mis à part quelques systèmes bien étudiés, tels que le circuit de contrôle du chant chez les oiseaux chanteurs. La nouvelle nomenclature du cerveau d oiseau publiée récemment (Reiner et al., 2004) ainsi que l activité d un forum dédié au cerveau des oiseaux (Avi-eaters List ; voir aussi AvianBrain.org) témoignent du manque de consensus qui règne dans la recherche en neurobiologie chez les oiseaux et de l écart des connaissances relatif aux oiseaux et aux mammifères dans ce domaine. Avant de détailler les structures centrales susceptibles d être impliquées dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux, nous présenterons les différences structurales majeures existant entre les cerveaux d oiseaux et de mammifères. Cette présentation rapide devrait faciliter les comparaisons ultérieures entre les deux classes. a) La structure générale du cerveau d oiseau Macroscopiquement, le cerveau d oiseau s inscrit dans la continuité des vertébrés : on peut facilement distinguer les hémisphères cérébraux, le cervelet et le tronc cérébral (voir figure introduction 8). Vu de l extérieur, le télencéphale ne paraît pas si différent de celui de certains mammifères tels que le rat, dont les hémisphères cérébraux sont lisses au même titre que ceux des oiseaux. Une des particularités des oiseaux est cependant le développement important des lobes optiques, à mettre en relation avec l acuité du système visuel dans cette classe. C est au niveau de la structure interne du télencéphale que les oiseaux diffèrent le plus des mammifères. En effet, alors que chez les mammifères une épaisse couche de corps neuronaux délimite le cortex, les corps cellulaires des neurones et leurs axones chez les oiseaux ne sont pas regroupés en substance grise et en substance blanche. Le télencéphale des oiseaux prend cependant la forme d une structure laminée, où corps cellulaires et fibres neuronales sont mélangés au sein d épaisses couches distinctes : l hyperpallium, le 20

37 Figure introduction 9 : Révision de la nomenclature en 2004 A: Les structures palliales (vert), striatales (rose) et pallidales (bleu) chez l oiseau et l homme, avant et après 2004 (modifié à partir des figures disponibles sur avianbrain.org). B: La nomenclature des différentes couches du cerveau d oiseau avant et après 2004 (modifié d après Reiner et al., 2004) A Attribué à des comportements instinctifs Attribué à des comportements cognitifs complexes Vue classique avant 2004 Oiseau Homme Nouvelle vue depuis 2004 B Avant 2004 Après révision par Reiner et al. (2004)

38 Introduction mésopallium, le nidopallium et le striatum (Reiner et al., 2004) (voir figures introduction 9A et 9B). La majeure partie de la moitié dorsale du télencéphale est donc de nature palliale alors que la nomenclature en usage jusqu en 2004 laissait penser que presque tout le télencéphale des oiseaux était de nature striatale (Reiner et al., 2004) (voir figures introduction 9A et 9B). De telles différences de structure entre oiseaux et mammifères compliquent l établissement d homologies. Par exemple, l hippocampe, une structure télencéphalique supraventriculaire dorsomédiane chez les oiseaux, occupe une position très différente de l hippocampe des mammifères, replié en position ventromédiane. b) Les structures centrales potentiellement impliquées dans l expression des comportements de peur chez l oiseau Chez les oiseaux, les premières données fonctionnelles établissant l implication de certaines régions du cerveau dans les comportements de peur datent des années 60 lorsque Phillips publie une étude exploratoire chez le canard colvert (Phillips, 1964). Dans cette étude, il a réalisé des décérébrations complètes ou partielles, des lésions et des stimulations de différentes régions du télencéphale. Il a observé que des décérébrations et des lésions d une large portion du télencéphale ventral incluant entre autres l archistriatum (structure actuellement subdivisée en deux régions : l arcopallium et l amygdale palliale postérieure ; Reiner et al., 2004) et les fibres du tractus occipito-mésencéphalique (voie efférente majeure de l archistriatum), affectaient les comportements de fuite, d évitement et les réactions à la manipulation par l homme. Les résultats des stimulations électriques recoupaient partiellement ceux des lésions : des comportements de peur marqués incluant la fuite et des vocalisations indicatrices de dérangement et d alarme, étaient observés après stimulation de l archistriatum et du noyau taeniae. Cette étude a été l une des toutes premières à suggérer l implication de l archistriatum dans l expression des comportements de peur chez l oiseau. A la suite de ces résultats, l archistriatum devient la structure privilégiée d études fonctionnelles portant sur les comportements de peur chez l oiseau. 21

39 Figure introduction 10 : Schémas de coupes frontales du cerveau de poussin représentant des structures (en rouge) potentiellement homologues de structures du cerveau de mammifère impliquées dans le contrôle des comportements de peur (modifié à partir de l atlas disponible sur avianbrain.org). A : Arcopallium / B : Noyau du lit de la strie terminale, partie latérale / C : Hippocampe / D : Nidopallium caudolatéral / E : Noyau paraventriculaire de l hypothalamus hypothalamus. A B C D E

40 Introduction Arcopallium et amygdale palliale postérieure (PoA) : L ensemble arcopallium / PoA, autrefois nommé archistriatum (Reiner et al., 2004) est une large structure du télencéphale caudal ventrolatéral (figure introduction 10A). Des lésions électrolytiques de cette région entraînent une réduction marquée des comportements de peur chez le canard colvert à l approche de l homme (Phillips, 1964), et le poussin domestique dans un test d open field (Lowndes et Davies, 1995). Des lésions de cette région à l acide kaïnique induisent également une réduction des comportements de peur exprimés par le poussin domestique dans un test d open-field (Phillips et Youngren, 1986). Enfin, chez le canard, des sections de la voie efférente majeure de l arcopallium / PoA, le tractus occipito-mésencéphalique, réduisent la fuite et la latence d approche face à l expérimentateur (Martin et al., 1979). Parallèlement, des stimulations électriques de l arcopallium / PoA ou du tractus occipito-mésencéphalique induisent une augmentation des comportements de peur chez le canard (Phillips, 1964), le poussin (Phillips et Youngren, 1971 ; Andrew et Oades, 1973) et le pigeon (Goodman et Brown, 1966). Une seule étude semble s opposer aux précédentes : des lésions électrolytiques de l arcopallium / PoA ont entraîné chez des poulets adultes une augmentation des durées d immobilité tonique, ce qui indiquerait ici une élévation du niveau de peur des individus après lésion (Maser et al., 1973). Cependant, dans cette étude, les lésions semblent n avoir affecté qu un champ restreint de l arcopallium intermédiaire ventral, ce qui pourrait expliquer l apparente contradiction avec les résultats précédents qui concernaient des régions plus vastes de l arcopallium / PoA. Quoi qu il en soit, l ensemble de ces études semble donc supporter l idée que l arcopallium / PoA joue un rôle clé dans l expression des comportements de peur chez l oiseau. Anatomiquement, l arcopallium / PoA est une vaste structure hétérogène, composée de sous-régions plus ou moins distinctes. La nouvelle nomenclature établie par Reiner et al. (2004) dénomme différentes sous-régions : l arcopallium antérieur (AA), l arcopallium intermédiaire (AI), l arcopallium dorsal (AD), l arcopallium médian (AM), le noyau taeniae de l amygdale (TnA) et le PoA (Reiner et al., 2004). Cependant, les différentes limites de ces subdivisions ne sont pas clairement établies histologiquement, notamment car elles varient selon les marqueurs utilisés (Zeier et Karten, 1971 ; Veenman et al., 1995 ; Davies et al., 1997a ; Reiner et al., 2004 ; Atoji et al., 2006, voir figure introduction 11). Fonctionnellement, aucune étude n a investit le rôle de chaque subdivision dans l expression des comportements de peur. Mais, en étudiant les projections de l arcopallium / PoA, deux études de neuroanatomie ont conduit à suggérer que cette région pourrait se 22

41 Figure introduction 11 : Comparaison des délimitations de subdivisions de l arcopallium / PoA chez le pigeon selon Atoji et al. (2006) ( à gauche) et selon Reiner et al. (2004) (à droite). AD : Arcopallium dorsal / AI : Arcopallium intermédiaire / AM : Arcopallium médian / PoA : Amygdale palliale postérieure / TnA : Noyau taeniae de l amygdale Télencéphale gauche Télencéphale droit

42 Introduction subdiviser en deux grands territoires fonctionnellement distincts (Zeier et Karten, 1971 ; Davies et al., 1997a). Ces deux études s accordent sur le fait que seule la partie postérieure de l arcopallium / PoA (comprenant l AD, l AM, une partie de l AI et le PoA), serait liée au système limbique car elle projette vers des structures elles mêmes considérées comme «limbiques» telles que : l hippocampe, l aire septale, le noyau du lit de la strie terminale (anciennement noyau accumbens et partie latérale du noyau de la strie terminale ; Reiner et al., 2004), l hypothalamus et le noyau dorsal du thalamus. La partie antérieure de l arcopallium (AA) serait, elle, plutôt impliquée dans des fonctions sensorimotrices. Cette suggestion de subdivision fonctionnelle de l arcopallium / PoA est de plus supportée par des données embryologiques montrant une origine différente de ces deux sous-régions (Tsai et al., 1981; Puelles et al., 2000). De nombreuses données neuroanatomiques et quelques données embryologiques et fonctionnelles récoltées sur l arcopallium / PoA montrent des similitudes avec l amygdale de mammifères, suggérant une homologie partielle, surtout pour la partie la plus postérieure de l arcopallium / PoA (Neuroanatomie : Zeier et Karten, 1971 ; Davies et al., 1997a ; Veenman et al., 1995 ; Atoji et al., 2006 ; Embryologie : Puelles et al., 2000; Fonctionnelle : Cohen, 1975). Ce sont ces similitudes qui ont conduit Reiner et al. (2004) à utiliser le terme «d amygdale palliale postérieure» pour la région autrefois nommée archistriatum postérieur. Cependant la limitation précise du PoA pose problème. Reiner et al. (2004) reconnaissent eux-mêmes que la séparation entre le PoA et l AM n est pas claire et que ce dernier pourrait peut-être faire partie du complexe amygdalien des oiseaux si d autres preuves venaient à apparaître. Or, des données récentes suggèrent que l AM pourrait être considéré comme «limbique» car il projette sur le PoA et sur le noyau de la strie terminale (Atoji et al., 2006). A l heure actuelle, une correspondance entre le noyau central de l amygdale des mammifères et le PoA des oiseaux a été supposée mais n a pas encore été clairement établie (Reiner et al., 2004 ; Atoji et al., 2006) : on note essentiellement des différences au niveau de certaines caractéristiques neurochimiques (Atoji et al., 2006) et un manque de données fonctionnelles concluantes. En dehors de l arcopallium / PoA, les données fonctionnelles n ont pas permis d identifier d autres structures participant aux circuits contrôlant les comportements de peur chez les oiseaux. Il est cependant possible de considérer comme potentiellement intéressantes, des régions du cerveau d oiseau présentant des caractéristiques neuroanatomiques similaires à celles des structures impliquées dans le contrôle des comportements de peur chez les mammifères. 23

43 Autres structures cérébrales potentiellement impliquées dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux Introduction De nombreuses données neuroanatomiques et neurochimiques suggèrent que la partie latérale du noyau du lit de la strie terminale (BSTL) (figure introduction 10B) des oiseaux est comparable au BNST des mammifères (Reiner et al., 2004 ; Atoji et al., 2006). Par exemple, le BSTl des oiseaux contient, au même titre que le BNST des mammifères (Cummings et al., 1983), une forte concentration de neurones producteurs de CRF (Richard et al., 2004), neuropeptide jouant un rôle majeur dans le contrôle des réactions de peur chez les mammifères (Dunn et Berridge, 1990 ; Schulkin et al., 2005). De plus, le BSTL des oiseaux reçoit des afférences du PoA (Zeier et Karten, 1971 ; Atoji et al., 2006), comme c est le cas chez les mammifères où le BNST reçoit des afférence de l amygdale (Walker et al., 2003). Connaissant le rôle du BNST chez les mammifères (LeDoux, 2000), ces correspondances suggèrent une possible implication du BST des oiseaux dans l élaboration des comportements de peur. Cependant, la projection du PoA sur le BST ne semble pas démontrée chez toutes les espèces d oiseaux : alors que cette projection est visible chez le pigeon (Zeier et Karten, 1971 ; Atoji et al., 2006), elle n a pas été observée chez le poussin (Davies et al., 1997a). De plus, la ressemblance entre le BST du rat et celui du pigeon n est pas parfaite, notamment en termes de connections (Atoji et al., 2006). De plus amples études sont donc encore nécessaires, notamment au niveau fonctionnel, pour établir une éventuelle implication du noyau du lit de la strie terminale des oiseaux dans l élaboration des comportements de peur. Il existe également des similitudes neuroanatomiques et neurochimiques entre l hippocampe des oiseaux (figure introduction 10C) et celui des mammifères (Krayniak et Siegel, 1978, Atoji et Wild, 2006), même si la localisation de l hippocampe au sein du télencéphale est très différente dans les deux classes. Au niveau fonctionnel, il a été montré, à l aide d une étude d activation neuronale chez le pigeon, que l hippocampe est activé après un test de peur conditionnée (Brito et al., 2006) et qu il est nécessaire à l expression de cette réponse de peur conditionnée (Reis et al., 1999). L hippocampe des oiseaux semble donc, au même titre que celui des mammifères, être impliqué dans le contrôle des comportements de peur conditionnée, ne serait-ce qu indirectement par les liens étroits qui existent entre peur et mémoire. Cependant, l hippocampe des oiseaux a été principalement étudié pour son rôle dans les phénomènes de mémorisation, notamment 24

44 Introduction pour la mémorisation spatiale (Clayton, 1998 ; Capaldi et al., 1999) et l étude de son implication dans le contrôle des comportements de peur ne fait que débuter. Dans la mesure où les oiseaux ne possèdent pas de cortex anatomiquement différencié, et en l état actuel des connaissances sur les homologies possibles entre mammifères et oiseaux, il est difficile de désigner une structure du cerveau d oiseau homologue du cortex préfrontal des mammifères. Cependant, des études neuroanatomiques, neurochimiques et fonctionelles récentes semblent indiquer qu une sous-région du nidopallium, le nidopallium caudolatéral (figure introduction 10D), pourrait être similaire au cortex préfrontal des mammifères (Güntürkün, 2005). Mais les études actuelles sur le nidopallium caudolatéral se sont concentrées sur son implication dans la mémoire de travail (Lissek et Güntürkün, 2003 ; Güntürkün, 2005) et il n existe, à notre connaissance, aucune étude ayant recherché son rôle éventuel dans le contrôle des réactions de peur. Le noyau paraventriculaire de l hypothalamus (PVN) des oiseaux (figure introduction 10E) semble anatomiquement comparable à celui des mammifères mais sa fonctionnalité dans le contrôle des réponses de peur n a, à notre connaissance, pas encore été démontrée. Chez les mammifères, le PVN contrôle l axe corticotrope (pour revue voir Herman et al., 2005). Le PVN des oiseaux présente des caractéristiques anatomiques et neurochimiques lui permettant de contrôler l axe corticotrope, notamment en ce qui concerne ses connections avec l hypophyse (Baylé et al., 1975 ; Korf, 1984 ; Mikami, 1986). Il possède, de plus, des neurones à CRF (Richard et al., 2004) et reçoit des projections de l arcopallium / PoA (Davies et al., 1997a). Il est donc possible que l arcopallium / PoA contrôle l activité du PVN, comme cela a été observé entre l amygdale et le PVN chez les mammifères (Herman et al., 2005). Cette hypothèse est soutenue par une étude démontrant que des stimulations électriques de l arcopallium / PoA chez le pigeon, augmentent la concentration de corticostérone plasmatique, dernier élément de la cascade de réactions de l axe corticotrope (Bouillé et Baylé, 1974). L ensemble des ces résultats suggèrent donc fortement un rôle du PVN des oiseaux dans le contrôle des réactions physiologiques de peur. 25

45 OBJECTIFS

46 Objectifs Objectifs A la suite de cette introduction, il ressort que les études portant sur la neurobiologie des comportements de peur chez l oiseau n en sont qu à leurs débuts. Dans ce domaine, l objectif serait, à terme, de décrire un ou plusieurs réseaux de structures cérébrales, participant au contrôle des comportements de peur chez les oiseaux, comme c est le cas autour de l amygdale, ou de l hippocampe chez les mammifères. L objectif principal de cette thèse a donc été de rechercher des structures cérébrales potentiellement impliquées dans le contrôle des comportements de peur chez les oiseaux. Nous avons vu au cours de l introduction qu une région du cerveau d oiseau, englobant l arcopallium et amygdale palliale postérieure (PoA), a déjà été identifiée comme impliquée dans ce contrôle. Cependant, d importantes incertitudes persistent au sujet de cette région, notamment en ce qui concerne les limitations et implications réelles de ses sous régions. Des études neuroanatomiques ont permis de suggérer que les parties antérieure et postérieure de l arcopallium / PoA pourraient être différemment impliquées dans le contrôle des comportements de peur. Cependant, aucune étude fonctionnelle n a vérifié cette hypothèse. Le premier objectif de la thèse a donc été d évaluer, par une approche lésionnelle, le rôle spécifique de ces deux sous-régions dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau. Dans un deuxième temps, nous avons choisi de rechercher d autres structures susceptibles d être impliquées dans le contrôle des comportements de peur chez les oiseaux. Comme nous l avons vu dans l introduction, la littérature dont nous disposons dans ce domaine nous a permis de désigner des structures neuroanatomiquement similaires à des structures du cerveau des mammifères connues pour être impliquées dans le contrôle des réactions de peur, mais aucune donnée fonctionnelle n est disponible chez l oiseau pour étayer ces comparaisons. Nous avons ainsi choisi de développer une approche exploratoire fonctionnelle ayant pour objectif de visualiser l activation neuronale au sein de structures candidates après exposition à une situation effrayante. Pour cette expérience, nous avons utilisé deux lignées de cailles différant par leur propension à exprimer des comportements de peur, dans le but de faciliter la mise en évidence de populations neuronales spécifiquement impliquées dans l expression des comportements de peur. A l occasion de cette précédente étude, la situation inductrice de peur a généré des réponses comportementales similaires entre les deux lignées de cailles, pourtant connues 26

47 Objectifs pour se différencier dans de nombreux tests de peur. A la suite de cette observation, il nous a semblé pertinent de mieux caractériser cette situation sur le plan comportemental, ce qui a constitué la troisième étape de la thèse. Une telle caractérisation nous a semblé importante dans la mesure où elle facilite la compréhension des comportements observés entre les deux lignées et leurs liens avec les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. 27

48 MODELE ANIMAL

49 Modèle Animal Modèle Animal Les expériences rapportées dans cette thèse ont été réalisées à l aide de cailles japonaises sélectionnées sur leur durée d immobilité tonique. Comme nous l avons vu dans l introduction, l utilisation d animaux aux comportements divergents facilite la mise en évidence des mécanismes liés à ces comportements. Nous verrons ici comment cette sélection a été mise en place et quelles sont les conséquences comportementales, physiologiques et neurobiologiques d une telle sélection. I / Mise en place de la sélection de cailles japonaises sur leur durée d immobilité tonique L immobilité tonique est un comportement inné d inhibition motrice passagère largement répandu dans le monde animal et qui peut être induit chez l oiseau par une brève contention (Gallup, 1974). La durée d immobilité tonique a été choisie comme critère de la sélection mise en place dans les années 80 par Mills et Faure (1991) car elle constitue une mesure de l état de peur des volailles non invasive, robuste, pratique et standardisable (Jones, 1986). En effet, la durée de maintien de ce comportement est positivement corrélée à la peur de l oiseau (Jones, 1986). Ainsi, des stimuli effrayants présentés avant l induction de l immobilité tonique (bruit, placement dans un environnement inconnu ) prolongent la durée de la réaction (Jones, 1986). De plus, une corrélation a pu être établie entre la durée d immobilité tonique d un individu et ses comportements de peur dans d autres tests tels que l open-field et le test d émergence (Mills et Faure, 1986 ; Jones 1987a). Pour réaliser la sélection, Mills et Faure ont mis au point un protocole bien caractérisé. En effet, le test d immobilité tonique est réalisé dans une pièce attenante à la salle d élevage et isolée phoniquement. A l âge de 9-10 jours, chaque cailleteau est placé sur le dos dans un berceau en forme de U et maintenu manuellement en contention pendant 10 secondes, l expérimentateur gardant une main sur le sternum et l autre sur la tête de l oiseau (voir figure modèle animal 1). Les 10 secondes de contention correspondent à la période d induction, à la suite de laquelle l expérimentateur arrête la contention et mesure le temps que l animal met à se redresser. On mesure le nombre d inductions nécessaires pour obtenir une durée minimale de 10 secondes d immobilité tonique et la durée d immobilité tonique, qui se termine lorsque l animal se redresse. Si la caille est toujours en immobilité tonique au bout de 5 minutes, le test est interrompu et la caille obtient un score maximal de 300 secondes. 28

50 Figure modèle animal 1: Déroulement du test d immobilité tonique. Lacailleestplacée en contention sur le dos dans un berceau en bois pendant 10 s (phase d induction) et on mesure le temps pendant lequel l animal reste immobile après la fin de la contention (immobilité tonique). Si la caille se redresse en moins de 10 s, une nouvelle induction est tentée. Capture Induction (retournement et contention pendant 10 s) Nouvelle capture Immobilité tonique Redressement Redressement

51 Figure modèle animal 2 : Durée moyenne d immobilité tonique des cailles des lignées STI et LTI et d une lignée témoin non sélectionnée (CTI), au cours des 44 premières générations de sélection. Durée d immobilité tonique (s) LTI Nombre de générations CTI STI

52 Modèle Animal Les détails du processus de sélection ont été rapportés par Mills et Faure (1991). Seules les grandes lignes sont rapportées ici. Les cailles de la génération de départ étaient issues du croisement réciproque de deux lignées commerciales. A chaque génération, on garde 20 mâles et 40 femelles reproducteurs par lignée. La sélection des reproducteurs est réalisée sur la base de la durée d immobilité tonique des individus. Les deux lignées divergentes ont été nommées LTI pour les cailles présentant une longue durée d immobilité tonique et STI pour celles à courte durée d immobilité tonique. Une lignée témoin non sélectionnée a été maintenue parallèlement. Compte tenu de la divergence satisfaisante obtenue entre les deux lignées STI et LTI, le travail de sélection a été allégé à partir de la 17 ième génération en ne réalisant le test de sélection qu une génération sur deux. Le résultat de la sélection est présenté figure modèle animal 2 montrant l évolution des durées moyennes d immobilité tonique pour chaque lignée au fur et à mesure de la sélection. On observe que désormais les cailles de la lignée LTI montrent en moyenne un score s approchant du maximum de 300 secondes d immobilité tonique alors que la moyenne les cailles de la lignée STI est proche des 0 secondes d immobilité tonique (signifiant que l immobilité tonique chez les cailles STI est désormais très dure à induire). Bien que les tests de sélection soient toujours réalisés sur des cailleteaux, les différences de durée d immobilité tonique observées entre les cailles des lignées STI et LTI se maintiennent à l âge adulte (Launay et al., 1993). Les cailles utilisées au cours des différentes expériences de cette thèse appartiennent aux générations numéro 38 à

53 Figure modèle animal 3 : Tableau récapitulatif des données comportementales, physiologiques et neurobiologiques disponibles sur les cailles sélectionnées sur leur durée d immobilité tonique (LTI et STI). Tests Paramètres Résultats Immobilité tonique Nombre d'inductions Durée LTI < STI LTI > STI COMPOR RTEMENT Open-field (Cailleteau) Emergence (Cailleteau) Réactivité à l homme (Cailleteau) Vocalisations Déplacements Freezing Latence d émergence Ordre de capture LTI < STI LTI < STI LTI > STI LTI > STI LTI > STI Contention (Cailleteau) Débattements LTI < STI Immobilité tonique (période d induction) SN sympathique SN parasympathique LTI < STI PHYSIO OLOGIE Son nouveau dans la cage d élevage Objet nouveau dans la cage d élevage Contention (Adultes) SN parasympathique Corticostéronémie Corticostéronémie STI uniquement LTI = STI LTI < STI Injection ACTH / CRF Corticostéronémie LTI = STI LTI < STI NEU UROBIOLOGIE Approche pharmacologique Approche morphologique Nombre de récepteurs aux opioïdes Affinité aux benzodiazépines Volume arcopallium LTI < STI LTI < STI Lésions arcopallium Durée d immobilité tonique LTI uniquement

54 Modèle Animal 2 / Conséquences comportementales, génétiques, physiologiques et neurobiologiques de la sélection. (Récapitulatif figure modèle animal 3) De nombreuses études ont été réalisées dans le but de caractériser les lignées de cailles STI et LTI. La caractérisation de ces lignées a eu pour objectif sous-jacent de mieux comprendre les manifestations de la peur, les mécanismes qui les régissent ainsi que leurs conséquences sur l organisme. a) Données comportementales (figure modèle animal 3) Les cailles des lignées STI et LTI montrent de larges différences comportementales dans de nombreux tests de peur. Dans le test d open-field, les cailleteaux de la lignée STI émettent davantage de vocalisations et se déplacent plus que les cailleteaux de la lignée LTI, qui expriment davantage de comportement de «freezing» et mettent plus de temps à effectuer les premiers déplacements (Jones et al., 1991). Dans le test d émergence, les cailleteaux de la lignée STI mettent moins de temps que ceux de la lignée LTI à sortir de la boîte obscure pour s aventurer dans la partie éclairée (Jones et al., 1991). La réactivité des deux lignées face à l homme a aussi été testée par ramassage manuel des cailleteaux des deux lignées élevés ensemble. Les cailleteaux de lignée STI sont plus souvent capturés en premier que les cailleteaux de lignée LTI (Mills et Faure, 2000 ; Faure et al., 2006), ce qui suggère que ces derniers montrent un comportement de fuite face à l homme plus prononcé que les cailleteaux de lignée STI. Dans un test de contention, les cailles de la lignée STI se débattent davantage et font plus de tentative de fuite que les cailles de lignée LTI (Hazard, 2005 ; Faure et al., 2006). L ensemble de ces résultats montrent que face à une situation effrayante les cailles de la lignée LTI ont tendance à exprimer davantage d inhibition motrice que les cailles STI (immobilité tonique plus longue, plus de freezing en open field ). Ainsi, Mills et Faure (1991) concluent que les cailles de la lignée LTI montrent des comportements de peur exacerbés, là où les cailles de la lignée STI montrent des comportements de peur réduits dans l ensemble de ces tests de peur. 31

55 Modèle Animal b) Données génétiques Une recherche de régions du génome (QTL = Quantitative Trait Loci) associées aux comportements de peur a été réalisée sur un croisement de deuxième génération entre les cailles STI et LTI. Cinq QTL significatifs au niveau du génome ont été identifiés, dont un lié à la durée d immobilité tonique. Il est intéressant de noter que ce dernier est très proche d un QTL moins significatif associé au comportement en open field, ces deux QTL pouvant être identiques. Ce résultat suggère que des gènes modulant la propension à exprimer des comportements de peur pourraient se trouver dans cette région du génome (Beaumont et al., 2005). c) Données physiologiques (figure modèle animal 3) De récents travaux ont permis de montrer des différences entre les deux lignées au niveau du contrôle de la variabilité de la fréquence cardiaque par le système nerveux autonome. De manière générale, les cailles de la lignée STI présentent une fréquence cardiaque plus basse que les cailles de la lignée LTI au repos. Ce ci est cohérent avec la prédominance de l activité parasympathique chez les STI au repos, alors que chez les cailles LTI, les influences relatives des systèmes sympathique et parasympathique s équilibrent (Valance, 2006). Lors du test d immobilité tonique, au cours de la période d induction, on observe une forte augmentation de l activité du système nerveux sympathique et une diminution de l activité parasympathique chez les deux lignées, mais ces changements sont plus amples chez les cailles de la lignée STI que chez les cailles de la lignée LTI (Valance, 2006). De plus, lors d un test de présentation d un son nouveau dans la cage d élevage, l activité du système nerveux sympathique augmente chez les deux lignées mais le système parasympathique est activé uniquement chez les cailles de la lignée STI. (Valance, 2006). Les deux lignées montrent aussi des différences au niveau de l axe corticotrope. Le taux de corticostérone plasmatique au repos est similaire chez les deux lignées. Par ailleurs, bien que l augmentation de la corticostéronémie soit similaire entre les deux lignées après la présentation d un objet nouveau dans la cage d élevage (Richard et al., 2007b), l augmentation est significativement plus marquée chez les cailles de la lignée STI que chez les cailles LTI à la suite d un stress de contention (Jones et al., 1994 ; Hazard, 2005). Le sens de cette variation, étonnante en soi, pourrait s expliquer par le fait que les cailles de la lignée STI se débattent plus que celles de la lignée LTI dans le test de contention. En effet, chez les oiseaux comme chez les mammifères, une augmentation de 32

56 Figure modèle animal 4 : Diagramme représentant la durée d immobilité tonique chez des cailles des lignées STI et LTI après lésions de l arcopallium et de l amygdale palliale postérieure (anciennement archistriatum), et chez des individus non lésés. Durée d immobilité tonique (s) * Intact Lésion électrolytique LTI STI Figure modèle animal 5 : Mesure du volume de l arcopallium et de l amygdale palliale postérieure (anciennement archistriatum) chez des cailles de lignées STI et LTI. (Richard, 2000; Richard et al., 2005) Volume de l archistriatum (mm 3 ) 8,4 * 8,0 7,6 7,2 0 LTI STI

57 Modèle Animal l activité physique induit une augmentation de l activité de l axe corticotrope (Rees et al., 1985 ; Brown et al., 2007). Cependant, la différence d activité physique n explique probablement pas à elle seule la différence d activité de l axe corticotrope observée entre les deux lignées. En effet, si la contention est maintenue pendant deux heures, le taux de corticostérone plasmatique reste élevé pendant les deux heures de contention chez les cailles STI, alors que leur activité de débattement se réduit progressivement au cours du temps et n est plus différente de celle des cailles LTI au bout de 40 minutes (Hazard, 2005). Il a également été montré que cette différence de réactivité de l axe corticotrope entre les deux lignées de cailles ne s explique pas par une différence de fonctionnement des glandes surrénales. En effet, la sensibilité surrénalienne à l ACTH est comparable entre les deux lignées. Par contre, une injection de CRF induit une augmentation du taux de corticostérone plus importante chez les cailles STI que chez les cailles LTI. L ensemble de ces données suppose donc une divergence à un niveau supérieur de l axe corticotrope, vraisemblablement au niveau central et peut-être au niveau du noyau paraventriculaire de l hypothalamus (Hazard, 2005). d) Données neurobiologiques (figure modèle animal 3). Des différences entre les deux lignées de cailles ont été observées au niveau de l arcopallium / amygdale palliale postérieure (PoA). Il a en effet été montré que des lésions de l arcopallium / PoA entraînaient une diminution de la durée d immobilité tonique chez des cailleteaux de la lignée LTI par rapport à des cailleteaux de la même lignée n ayant pas subi de lésion ; alors que chez les cailleteaux de la lignée STI, la lésion de l arcopallium / PoA n a pas entraîné de modification notable de la durée d immobilité tonique (figure modèle animal 4, Davies et al., 1997b). Nous pouvons cependant noter qu il est difficile d observer une diminution de la durée d immobilité tonique chez les cailles de la lignée STI, dont les réponses dans ce test sont déjà très faibles en situation basale. Cependant, les auteurs ont également observé des différences de comportements de peur dans le test d open-field : les lésions de l arcopallium / PoA ont entraîné une augmentation du nombre de vocalisations chez les cailleteaux LTI, augmentation qui n a pas été observée chez les cailleteaux STI dans ce test (Davies et al., 1997 b). Or l augmentation des vocalisations en open field chez l oiseau peut être interprétée comme une diminution des comportements de peur (Jones, 1996). Par ailleurs, une mesure du volume de l arcopallium / PoA, a également permis de montrer des différences significatives entre les deux lignées au niveau neuroanatomique. En effet, cette étude a montré que les cailles de la lignée STI présentaient un arcopallium / PoA significativement plus volumineux que les cailles de la 33

58 Modèle Animal lignée LTI (figure modèle animal 5, Richard, 2000 ; Richard et al., 2005). Le fait que les cailles exprimant des comportements de peur réduits (cailles de la lignée STI) présentent aussi un volume de l arcopallium / PoA plus important que les cailles présentant des comportements de peur exacerbés, est un résultat étonnant. En effet, des lésions de l arcopallium / PoA induisant une diminution des comportements de peur (Phillips et Youngren, 1986, Lowndes et Davies, 1995), on pouvait supposer que le volume de l arcopallium serait plus important chez les individus exprimant davantage ces comportements de peur. Ce résultat a conduit à suggérer l existence d une sous-région au sein de l arcopallium / PoA qui aurait un rôle inhibiteur sur les comportements de peur. Le développement préférentiel d une telle sous-région pourrait expliquer l importance de volume du complexe arcopallium / PoA chez les cailles exprimant des comportements de peur réduits (STI). Ainsi, ces deux études portant sur l arcopallium / PoA des cailles STI et LTI suggèrent une fonctionnalité différente de cette structure chez les deux lignées. Une approche pharmacologique a aussi été entreprise pour comparer les deux lignées sur le plan neurobiologique. Des dosages pharmacologiques ont été réalisés sur le cerveau antérieur de cailles adultes. Les résultats montrent que les cailles de la lignée LTI présentent moins de récepteurs aux opioïdes de type δ, et une affinité moindre pour les benzodiazépines que les cailles de la lignée STI (Hogg et al., 1994). De plus, l influence des niveaux d acide γ-amino-butyrique (GABA) sur l affinité aux benzodiazépines diffère également entre les deux lignées (Hogg et al., 1996). Une grande sensibilité aux benzodiazépines et aux opiacés pourrait expliquer la faiblesse des niveaux de peur des cailles de la lignée STI. L ensemble des ces résultats suggèrent fortement que les lignées de cailles STI et LTI constituent un modèle intéressant pour étudier les mécanismes neurobiologiques des comportements de peur chez les oiseaux. Les lignées de cailles STI et LTI ont donc été utilisées dans les études réalisées au cours des travaux de thèse. Plus précisément, nous avons comparé les cailles STI et LTI ou utilisé les cailles LTI seules pour disposer d animaux avec une propension élevée à exprimer des comportements de peur. 34

59 CHAPITRE 1 Implication différentielle de sous-régions de l arcopallium / amygdale palliale postérieure dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau Article soumis dans Behavioral Neuroscience

60 Chapitre 1 CHAPITRE 1 : Implication différentielle de sous-régions de l arcopallium / amygdale palliale postérieure dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau. Notre première approche expérimentale a ciblé la seule région du cerveau d oiseau initialement connue pour être impliquée dans l expression des comportements de peur : l arcopallium / amygdale palliale postérieure (PoA). Différentes études fonctionnelles ont en effet démontré l implication de cette région, souvent comparée à l amygdale des mammifères (Zeier et Karten, 1971 ; Veenman et al., 1995 ; Reiner et al., 2004 ; Atoji et al., 2006), dans le contrôle central des comportements de peur chez les oiseaux. Ainsi, des lésions de l arcopallium / PoA provoquent une diminution des manifestions comportementales de la peur chez les oiseaux (Phillips et Youngren, 1986 ; Lowndes et Davies, 1995) alors que des stimulations électriques les augmentent (Phillips et Youngren, 1971, Andrew et Oades, 1973). De plus, des études neuroanatomiques ont suggéré que cette région se subdivise fonctionnellement en deux principales sous-régions. En effet, ces études montrent que la partie postérieure de l arcopallium / PoA projette vers de nombreuses structures considérées comme «limbiques», telles que le noyau du lit de la strie terminale et l hypothalamus, suggérant une implication possible dans l expression des comportements de peur (Zeier et Karten, 1971 ; Davies et al., 1997a). A contrario, la partie antérieure de l arcopallium projette majoritairement vers des structures considérées comme «sensorimotrices» telles que le lobe optique, la formation réticulée latérale et le noyau du pont latéral, supposant un rôle plus général dans le contrôle des mouvements (Zeier et Karten, 1971 ; Davies et al., 1997a). Compte tenue de l absence de données fonctionnelles venues valider cette hypothèse de subdivision fonctionnelle de l arcopallium / PoA, les délimitations des subdivisions internes de l arcopallium / PoA restent sujettes à controverse. L objectif de notre première étude fut d évaluer les rôles spécifiques de la partie antérieure et de la partie postérieure de l arcopallium / PoA dans l expression des comportements de peur chez l oiseau. Pour cela, nous avons utilisé une approche lésionnelle et évalué les conséquences de cette inactivation sur les comportements de peur. Compte tenu des données neuroanatomiques présentées ci-dessus, nous avons fait l hypothèse que les lésions de la partie antérieure et de la partie postérieure devraient entraîner des conséquences différentes sur les réponses de peur. 35

61 Chapitre 1 Nous avons choisi d utiliser des lésions électrolytiques plutôt que chimiques de façon à léser tous les neurones de la sous-région visée. En effet, lors d une étude lésionnelle réalisée chez le perroquet, des lésions à l acide kaïnique n ont pas affecté tous les neurones de la région visée contrairement à des lésions électrolytiques (Heaton et Brauth, 2000). Nous avons aussi choisi de tester les animaux dans différents tests de peur. En effet, comme nous l avons vu dans l introduction, les comportements de peur de l oiseau peuvent être induits par diverses situations et il est possible que certaines structures soient davantage sollicitées dans certaines situations de peur que dans d autres. Nous avons choisi d utiliser le test de présentation d un objet nouveau pour tester l effet des lésions sur les réponses face à la nouveauté dans un environnement familier ; le test d immobilité tonique, quant à lui, mime la rencontre avec un prédateur ; enfin, les tests d open-field et d émergence, permettent de tester les réponses induites par le placement en environnement nouveau, avec ou sans abri potentiel (voir introduction générale). Pour finir, nous avons utilisé dans cette étude des cailles de la lignée LTI. En effet, nous avons choisi d utiliser des cailles montrant, par nature, des comportements de peur exacerbés, car d après la littérature, nous nous attendions à ce que les lésions de l arcopallium / PoA entraînent une diminution des comportements de peur. De plus, une précédente étude avait montré que des lésions de l arcopallium / PoA entraînaient une diminution des comportements de peur dans les tests d immobilité tonique, d open field et d émergence chez les cailles de la lignée LTI, mais pas chez les cailles STI (Davies et al., 1997b). Cette étude est exposée sous forme d un article qui a été soumis à la revue Behavioral Neuroscience. La réalisation de cette étude a été précédée d une mise au point méthodologique qui sera présentée dans les pages suivantes. 36

62 Chapitre 1 Chapitre 1, Etude préliminaire : Mise au point d une méthode d anesthésie profonde chez les cailles de la lignée LTI Réaliser des lésions électrolytiques dans le cerveau d un animal requiert une intervention chirurgicale sur des individus profondément anesthésiés, placés dans un appareil stéréotaxique. Une première étape a donc consisté à trouver le dosage d anesthésiant (mélange de xylazine et de kétamine) adéquat car il existe peu de données dans ce domaine chez l oiseau (Pionneau, 1985). Les tout premiers essais, réalisés sur des cailles de la lignée LTI, ont montré qu il existait une forte variabilité interindividuelle et que de nombreux facteurs environnementaux et physiologiques intervenaient dans cette variabilité. Nous avons par exemple observé de fortes différences de sensibilité à la température ambiante avant, pendant et après l opération chirurgicale. Nous avons aussi pu observer que le dosage utilisé ne pouvait être directement proportionnel aux poids des cailles, les cailles de poids élevé montrant généralement une sensibilité au mélange anesthésique beaucoup plus forte que les cailles de poids moyen. Ces travaux par essais et erreurs nous ont permis de définir l environnement le mieux adapté aux cailles les plus sensibles : température légèrement au-dessus de celle utilisée en condition d élevage (entre 20 et 25 C) pendant les 24h qui précédaient et qui suivaient l opération, bouillottes chauffantes pendant l opération et jusqu à 2h après le réveil ; retrait de l eau et de l aliment 2h avant l opération. Nous avons aussi adapté le dosage d anesthésiant en fonction des réactions de chaque caille : nous réalisions une première injection (1,25 ml/kg) qui permettait d anesthésier profondément certains individus mais pas tous, que nous complétions par une seconde injection (1.25 ml/kg) suivant les réactions de la caille, 10 à 15 min après la première injection. A la suite de ces mises au point, nous avons réalisé les premières opérations chirurgicales sur des individus SHAM (anesthésiés et opérés mais non lésés) puis comparé leur comportements à des individus témoins (ne subissant aucun traitement particulier), une semaine après ce protocole opératoire. Au cours des premières observations, il nous a semblé que les individus SHAM présentaient moins de comportements de peur que les individus témoins. Cette observation nous a conduit à suggérer que l anesthésie et/ou l opération en elle-même pourraient être à l origine de cette réduction des comportements de peur. Pour tester cette hypothèse, nous avons comparé les réactions de cailles anesthésiées (mais non opérées), de cailles opérées mais non lésées (SHAM) et de cailles 37

63 A C Différence pour la variable temps passé dans la zone de présentation entre les situations objet et témoin (s) x Figures Chapitre 1: B Latence de sortie de la zone centrale dans le test d open field 300 (s) * Différence pour la variable temps passé à essayer de s échapper entre les situations objet et témoin (s) D Nombre de changements de zones dans le test d open field x E 300 Latence d émergence du compartiment sombre (s) x F 600 Durée d immobilité tonique (s) Témoin (n=5) Anesthésié (n=6) SHAM (n=9) x Différents du groupe Témoin Différents des deux autres groupes *

64 Chapitre 1 témoins non manipulées dans les quatre tests de peur sélectionnés pour l étude à suivre : test de présentation d un objet nouveau, test d émergence, test d open-field et test d immobilité tonique. Les cailles étaient testées une semaine après les traitements. Dans le test d objet nouveau, nous avons observé chaque caille dans deux situations : lors de l introduction soudaine d un objet pendant 5 min dans la cage d élevage et lors d une situation témoin (sans présentation de l objet). Nous avons évalué l évitement de l objet en mesurant le temps passé dans la zone de présentation de l objet dans les deux situations. Nous avons aussi enregistré le temps passé à réaliser des déplacements indiquant des tentatives de fuite. Les analyses statistiques ont été réalisées sur le changement de comportement induit par la présentation de l objet (différence «objet» moins «témoin»). Dans ce test, le traitement préalable a influencé le comportement de peur des cailles, les individus anesthésiés passant moins de temps à éviter l objet que les cailles témoins (test de Kruskal-Wallis suivi de tests de Mann-Whitney, p < 0,05; voir figures chapitre 1 A et B). Dans le test d open-field, nous avons pris en compte deux mesures de l exploration de l environnement qui sont la latence à sortir de la zone centrale (où les cailles étaient placées en début de test) et le nombre de zones traversées au cours du test pendant 5 min. Dans ce test, le traitement préalable a influencé le comportement de peur des cailles, les individus SHAM sortant plus vite de la zone centrale que les cailles témoins et anesthésiées, et traversant plus de zones que les cailles témoins (tests de Kruskal-Wallis suivi de tests de Mann-Whitney, p < 0,05 ; voir figures C et D). Dans le test d émergence, nous avons placé les cailles dans un compartiment obscur et mesuré la latence d émergence de ce compartiment pour aller vers un compartiment éclairé et ouvert. Nous avons observé que le traitement préalable influençait le comportement de peur des cailles, les individus SHAM émergeant plus rapidement que les cailles témoins (test de Kruskal-Wallis suivi de tests de Mann- Whitney, p < 0,05; voir figure E). Enfin, les cailles SHAM et anesthésiées ont eu tendance à passer moins de temps en immobilité tonique que les cailles témoins (test de Kruskall-Wallis, 0.05 < p < 0.1 suivi de tests de Mann- Whitney, p < 0,05; voir figure F). Ainsi, les résultats montrent que les cailles SHAM (anesthésiées et opérées) présentent significativement moins de comportements de peur que les cailles témoins sur certaines variables prises en compte. Les cailles anesthésiées, quant à elles, se différencient des cailles témoins de façon moins flagrante, mais montrent tout de même moins de 38

65 Chapitre 1 comportements de peur que les cailles témoins sur une variable du test de l objet nouveau. Nous avons conclu que le protocole opératoire avait un effet sur les cailles. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour tenter d expliquer ces résultats. Il est vraisemblable que les nombreuses manipulations des cailles par les expérimentateurs au cours du protocole aient pu modifier les comportements des cailles dans les tests de peur. Il a par exemple été montré que des manipulations par l homme répétées diminuaient les réponses de peur ultérieures de poussins domestiques dans différents tests de peur (Jones et Faure, 1981). Un éventuel effet physiologique à long terme du mélange anesthésique, se prolongeant plus d une semaine après son administration, nous semble moins plausible. En effet, si à court terme il est connu que la kétamine entraîne une diminution des comportements de peur chez les mammifères (Pietersen et al., 2006), à notre connaissance aucun effet à long terme sur les émotions n a été décrit après une injection aiguë de kétamine. Enfin, nous ne pouvons pas exclure un éventuel effet de l opération en ellemême. En effet, les cailles SHAM ont montré moins de comportements de peur que les cailles anesthésiées sur une variable du test d open field. Nous avons donc conclu que le protocole chirurgical, indépendamment de l application de lésions électrolytiques, diminuait les réponses de peur des cailles. Ces résultats nous ont conduit à utiliser comme groupe «témoin» dans l expérience de lésions de l arcopallium / PoA, un groupe de cailles opérées mais non lésées (SHAM) pour comparer leurs comportements à ceux de cailles lésées. Notons que si ces cailles SHAM montrent moins de comportements de peur que des cailles témoins, s agissant de cailles LTI, leur niveau de peur reste élevé en comparaison de cailles non sélectionnées. Par exemple, des cailles non sélectionnées montrent en moyenne des durées d immobilité tonique proche de 80 s alors que les cailles SHAM ont montré une durée moyenne de 249 s dans le test d immobilité tonique. 39

66 Chapitre 1 Article soumis à Behavioral Neuroscience Subdivisions of the arcopallium / posterior pallial amygdala complex are differentially involved in the control of fear behavior in the Japanese quail. H. Saint-Dizier 1, P. Constantin 1, D.C. Davies 2, C. Leterrier 1, F. Lévy 1 and S. Richard 1 1- Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA UMR85 CNRS UMR 6175 Université de Tours Haras Nationaux, F Nouzilly, France. 2 Division of Basic Medical Sciences, St George s University of London, Cranmer Terrace, Tooting, London SW17 0RE, UK. Correspondence regarding this article should be addressed to Sabine Richard, INRA, Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France. Phone number: ; Fax number: Electronic mail should be sent to 40

67 Chapitre 1 Abstract Growing evidence suggests that the arcopallium / posterior pallial amygdala plays a major role in the control of fear behavior in birds. This brain region comprises several subdivisions, but no direct evidence is available about its functional parcellation. The aim of the present study was to investigate the relative involvement of two subdivisions of the arcopallium / posterior pallial amygdala complex in four classical tests of fear in quail: the presentation of a novel object, the hole-in-the-wall, open-field and tonic immobility tests. Bilateral electrolytic lesions damaging the posterior part of the arcopallium / posterior pallial amygdala resulted in an increase in fear behavior in the open-field test, whereas quail with lesions damaging the anterior part of the arcopallium displayed a decrease in an overall fear score, compared to quail with bilateral nidopallium or sham lesions. The differential involvement of the anterior and posterior parts of the arcopallium / posterior pallial amygdala in fear behavior is discussed in view of the known connections from the arcopallium / posterior pallial amygdala complex towards brain regions considered to be limbic in nature. Keywords: Avian brain; Emotions; Birds; Archistriatum; Amygdala. 41

68 Chapitre 1 A major challenge of behavioral neuroscience is to understand the central control of emotions in vertebrates. Most investigations of the central control of emotions in vertebrates have been carried out in mammals, notably in the study of fear, an adaptive emotional response that is induced by the perception of a danger (Jones, 1996). However, knowledge of the central control of fear reactions in birds is important for a better understanding of the phylogenetic continuity of emotions. Moreover, growing concern for animal welfare has motivated research into the neural mechanisms controlling emotions, in particular fear reactions in birds. A variety of reports have suggested that a large region of the basolateral caudal telencephalon, originally called the archistriatum (Kuenzel & Masson, 1988), including the arcopallium together with the posterior pallial amygdala (PoA; Reiner et al., 2004), is involved in the expression of fear reactions in birds and could be at least partially homologous with the mammalian amygdala (Zeier & Karten, 1971; Davies, Csillag, Székely & Kabai, 1997). Lesions of the arcopallium / PoA have been reported to reduce escape and fear behavior in mallards (Phillips, 1964) and domestic chicks (Phillips & Youngren, 1986; Lowndes & Davies, 1996). In contrast, electrical stimulation of the arcopallium / PoA has been demonstrated to elicit fear and escape responses in mallards (Phillips, 1964), pigeons (Goodman & Brown, 1966) and chickens (Phillips & Youngren, 1971). Therefore, the arcopallium / PoA appears to play an important role in the control of fear reactions in birds. The arcopallium / PoA is a large, heterogeneous brain region and the contribution of its individual subdivisions to the control of fear behavior is unclear. The internal organization of the arcopallium / PoA has been the subject of a number of neuroanatomy studies, but little information is available about its functional parcellation. Zeier and Karten (1971) and Davies et al. (1997) have suggested that, in the pigeon and domestic chick respectively, the posterior part of the arcopallium / PoA may have limbic functions, because it gives rise to efferents terminating in areas of the brain considered to be limbic in nature, such as the hippocampal formation, septal area, medial striatum, nucleus accumbens, ventral paleostriatum, dorsomedial thalamus and hypothalamus. In contrast, the anterior part of the arcopallium is considered to be non-limbic, because it mainly gives rise to sensory, somatosensory and motor telencephalofugal efferents (Zeier & Karten, 1971; Davies et al., 1997). To our knowledge, the involvement of individual arcopallium / PoA subdivisions in the control of fear behavior in birds has not been investigated directly. Therefore, the aim of the present study was to investigate the role of individual subdivisions of the arcopallium / PoA complex, in the expression of fear behavior in quail. 42

69 Chapitre 1 To this end, the effects of lesions of the anterior arcopallium (Reiner et al., 2004) versus the posterior part of the arcopallium / PoA (including the dorsal, intermediate and medial arcopallium and PoA of Reiner et al., 2004) were investigated in four behavioral tests of fear: the presentation of a novel object in the home cage, the hole-in-the-wall, openfield and tonic immobility tests. A variety of behavioral tests were used, because different stimuli may evoke different fear responses relying on different neuronal circuits. Materials and methods Subjects Japanese quail (Coturnix japonica) of the 42 nd and 43 rd generations of the Long Tonic Immobility duration (LTI) line, selected and maintained at the Unité Expérimentale Avicole, INRA, Nouzilly, France (Mills & Faure, 1991), were used in the present experiment. The genetic selection for long tonic immobility has resulted in LTI quail showing high levels of fear behavior in a variety of tests (Faure et al., 2006). Quail expressing high amount of fear behavior were used to minimize the chance of a 'floor' effect masking any lesion-induced reductions in fear behavior. On the day of hatching, male and female chicks were transferred to a communal floor pen maintained at approximately 40 C by continuous illumination with commercial brooder lamps. During the second and third weeks after hatching, the ambient temperature was gradually reduced to 20 C. On the 21 st day after hatching, male and female quail were separated and the photoperiod was adjusted to a 16:8 h light:dark schedule. Standard food and water were freely available at all times, unless otherwise specified. The quail were treated according to the European Communities Council Directive of November 24, 1986 (86/609/EEC) throughout. All procedures described here comply with French legislation on research involving animals and were approved by a local ethics committee (Comité Régional d Ethique pour l Expérimentation Animale, Centre-Limousin, file no. CL2006_051). Surgical procedure At five weeks of age and at least 24 h before surgery, 39 adult males were transferred to a holding room maintained at 20 C with a 16:8 h light: dark photoperiod. A single sex was employed in these experiments, to reduce inter-individual variability and males were chosen to avoid the changes in behavior in females related to laying, which may occur unpredictably. The quail were housed individually in wooden cages, with wood- 43

70 Chapitre 1 shavings on the floor. Their food and water were removed 2 h before surgery. Each quail was weighed and then anesthetized by intramuscular injection of 2.5 ml/kg of a mixture of ketamine (93.75 mg/kg; Imalgene, Merial SAS, Lyon, France) and xylazine (6.25 mg/kg; Paxman, Virbac France SAS, Carros, France). Immediately prior to surgery, each quail was placed in a small animal stereotaxic instrument, with a horizontal bar placed at the angle between the upper and lower beak, 8 mm anterior and 8 mm below the ear bars, to give an orientation similar to that used by Baylé et al. (1974) in the preparation of their stereotaxic atlas of the quail brain. The body temperature of the quail was maintained during surgery with the aid of a thermostatically controlled heated underblanket. A midline sagittal incision was made through the scalp, which was then retracted. A hole was drilled through the cranium and the dura mater incised. A stainless steel electrode with an insulated shaft was introduced into the telencephalon under stereotaxic control. Quail were given one of the following treatments: bilateral lesions of the 1) anterior part of the arcopallium (AA), 2) posterior part of the arcopallium and PoA (AP), and 3) nidopallium (NIDO). The nidopallium was chosen as a control region for the effect of brain damage per se, because it is located above the arcopallium / PoA and does not appear to be involved in fear behavior (Lowndes & Davies, 1996). Electrolytic lesions were made by passing a constant current (3500 Lesion Making Device, UGO Basil, Comerio, Italy) of 1 ma through the uninsulated tip (0.5mm) of the electrode for 15 s. For each hemisphere of AA quail, electrode penetrations were made 2.5 mm (1 lesion site) and 1.5 mm (2 lesion sites) rostral to the parieto-occipital suture. These three electrode penetrations were placed 4.5 mm, 4.25 mm and 5.25 mm from the midline respectively and 4.5 mm, 4.5 mm and 3.5 mm below the surface of the brain respectively (the lesion sites lay between levels A7.0 and A6.0 according to the atlas of the quail brain by Baylé, Ramade & Olivier, 1974). For each hemisphere of AP quail, electrode penetrations were made 1.5 mm (1 lesion site) and 0.5 mm (2 lesion sites) rostral to the parieto-occipital suture. These electrode penetrations were placed 4.5 mm, 4.25 mm and 5.25 mm from the midline respectively and 4.5 mm, 4.5 mm and 3.5 mm below the surface of the brain respectively (the lesion sites lay between levels A6.0 and A4.5 in the Baylé et al., 1974 atlas of the quail brain). For NIDO quail, bilateral electrode penetrations were placed 1.5 mm (1 lesion site) and 0.5 mm (2 lesion sites) rostral to the parieto-occipital suture. These three electrode penetrations were placed 3.5 mm, 3.25 mm and 4.25 mm from the midline respectively and 2 mm, 2 mm and 1 mm below the surface of the brain respectively (the lesion sites lay between levels A7.0 and A6.0 in the Baylé et al., 1974 atlas). Sham quail received similar electrode penetrations to 44

71 Figure 1. A: Diagram of a cage in which the quail were housed after surgery and where the novel object test was performed (viewed from above). The diagram shows the site where the novel object was dropped into the cage and the limit of the zone near to the object (dashed line). B: Diagram of the 'openfield' test arena (viewed from above), showing the 5 zones. 42 cm A Drinker Opaque PVC walls 14 cm Site of object presentation 24 cm Removable feeder Plexiglas wall Near zone boundary Opaque PVC wall B Plexiglas roof with a hole in the center for introduction of the quail 130 cm Central zone 43 cm Imaginary boundaries

72 Chapitre 1 those of AA, AP or NIDO quail, but no current was passed through the electrode. After the electrode was withdrawn from the last site in each hemisphere, the hole in the cranium was sealed with gelatin sponge (Pangen 2, Laboratoires URGO SA, Chenove, France) and the overlying scalp incision was closed with sutures. All quail then received an intramuscular injection of amoxicillin (300 mg; Duphamox, Fort Dodge Santé Animale, Tours, France) and were placed individually in a small cardboard box with wood shavings on the floor and a hot-water bottle, until they had recovered from the anesthesia. The quail were then housed individually in PVC cages (see Figure 1A for measurements) with wood-shavings on the floor and food and water available ad libitum. They were left undisturbed in these cages until the behavioral tests were performed. Each quail was then coded so that all subsequent procedures were performed by an experimenter blind to its previous treatment. Behavioral testing All quail were tested one week after surgery in the following order: using the novel object and associated control tests, the hole-in-the-wall, open-field and tonic immobility tests. The behavior of each quail was videoed during all except the tonic immobility test, with the experimenter remaining out of sight of the quail during recording. Novel object test All quail were tested in their home cage in two situations: with the novel object and without it. To avoid any effect of test order, half of the quail were tested first with the novel object and then in a control test without it, while the remainder of the quail were tested in the opposite order. The first test was performed seven days after surgery and the second test, at the same time on the following day. The test procedure has been described in detail previously (Richard et al., 2007), but briefly, on test days food was removed from each cage 40 min before the test. To habituate the quail to this procedure, the food trough was removed from each cage for 2 h every day, during the week preceding testing. In the novel object test, the food trough was replaced and the object was dropped into the cage immediately when the quail pecked at the food. The object, a 21x4 cm multicolored cylinder covered with 2-cm horizontal stripes of colored tape, was introduced into the cage near the food trough and then withdrawn 5 min later. In the control test without the novel object, the food trough was replaced and the quail was left undisturbed for 5 min. The time spent in the zone near the novel object (see fig. 1A) and the time spent pacing were 45

73 Chapitre 1 recorded. Similar measurements were made in the control test without the novel object. Behavioral measurements were made using The Observer 3.0 software (Noldus Information Technology, The Netherlands, 1993). For each quail, the change in the time spent near the object or in the time spent pacing induced by presentation of the object was calculated as the difference in the expression of the two parameters measured between the test with the novel object and that without it. Hole-in-the-wall test One hour after the second part of the novel object test, each quail was tested in the hole-in-the-wall test in a separate room. This test is a classical test of fear in birds, based on the premise that timid birds will take longer than less fearful ones to emerge from a dark sheltered area into a brightly lit, unfamiliar and therefore potentially frightening one (Jones, 1996). The apparatus consisted of a wooden box (length = 70cm, width = 27 cm; height = 29 cm) with two compartments of equal size: a dark compartment with a wooden lid and a brightly lit compartment, with a wire mesh lid. A guillotine trapdoor covered a 17 x 10 cm opening in the middle of the wooden wall separating the two compartments. The floor of the two compartments was covered with white paper, which was replaced between tests. Each quail was carried by hand from its home cage, placed in the dark compartment and allowed a 1 min acclimatization period before the door was raised, to give access to the brightly lit compartment. The brightly lit compartment was then videoed from above for five minutes and then the quail was replaced in its home cage. The latency for the quail to poke its head through the door into the light compartment was measured (see Jones, 1996, for details of the hole-in-the-wall test). Open-field test The open-field test was performed between one and three hours after the hole-in-thewall box test in the same room. The open-field was a 130 cm diameter octogonal arena with beige PVC walls, a white painted wooden floor and a Plexiglas lid. To aid analysis of the locomotor activity of the quail, the floor of the open-field was divided into 5 zones (see fig. 1B). Each quail was carried by hand from its home cage and placed at the center of the open-field. The behavior of each quail was videoed from above for 5 min after the beginning of the test. The quail were then returned to their home cage and the floor of the arena was cleaned. The latency to leave the central zone (43 cm diameter) and the number of zone boundaries crossed were recorded, as described by Jones (1996). 46

74 Chapitre 1 Tonic immobility test The tonic immobility test was performed between one and three hours after the end of the open-field test, in the same room. A detailed account of the tonic immobility test procedure has been published previously (Mills & Faure, 1991). Briefly, the experimenter placed each quail on its back in a U-shaped wooden cradle covered with a cloth and restrained it for 10 s (with one hand on the sternum and one hand lightly cupping the head of the quail). The observer sat nearby in full view of the bird but remained silent and as motionless as possible. If an attempt at induction of tonic immobility was unsuccessful (i.e. if the quail righted itself less than 10 s after the end of restraint), the experimenter immediately reattempted to induce tonic immobility. In the present experiment, tonic immobility was expressed by all quail after a maximum of two attempts at induction. The observer recorded the duration of tonic immobility, i.e. the time until the bird righted itself after the end of restraint. If a quail failed to right itself after 10 min, the test was terminated and a tonic immobility duration of 600 s was assigned to it. Overall fear score To provide a generalized view of the effect of the lesions on fear behavior, an overall fear score was calculated. Quail were ranked according to their behavioral responses in each test and a score for each test was calculated from the sum of the ranks of the recorded behavioral variables in that test. The overall fear score for each quail was calculated as the sum of scores for that quail in each behavioral test (sum of the four scores). Thus, quail displaying the least pacing and standing nearest the object in the test of the novel object, emerging fastest in the hole-in-the-wall test, leaving the central zone fastest and crossing the highest number of zones in the open-field test and righting themselves fastest in the tonic immobility test, received the lowest overall fear score. The score theoretically ranged from 4 (because there were 4 tests) to 112 (= 4 x 28 quail included in the analysis). Histology At the completion of the behavioral tests, the quail were weighed and given a lethal injection of sodium pentobarbital (360 mg/kg, i.p.; Pentobarbital Sodique, Sanofi Santé Animale, France). Their brains were removed and fixed by immersion overnight in 4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline (PBS; 0.1M, ph=7.4) at 4 C. The brains 47

75 Chapitre 1 were then cryoprotected by immersion in 30% sucrose in PBS for 24 hours at 4 C and frozen on dry ice. Serial coronal sections (50µm) were cut using a cryostat at -20 C. The sections were stored in PBS at + 4 C. Every fourth section was collected onto glass slides and stained with cresyl violet. The sections were viewed in a light microscope and the lesion sites examined. The borders of the arcopallium / PoA complex as defined by Reiner et al. (2004) were determined with the aid of atlases of the domestic chick (Kuenzel & Mason, 1988) and Japanese quail (Baylé et al., 1974) brain. The outlines of the sections and the lesion sites within each section were drawn with the aid of a camera lucida drawing attachment. These drawings were then used to determine the accuracy of placement and the extent of the lesions in each brain. To evaluate the relative extent of the lesion within the arcopallium / PoA, the surface areas of the lesion and the arcopallium / PoA were estimated for each section in which they were present. Then, a ratio between the total surface areas of the lesion and the anterior or posterior arcopallium / PoA was calculated. Quail that had received a small lesion on one side of the target region (< 10% of the area of that region) and quail that had received a large lesion on one side in the nontarget part of the arcopallium / PoA complex (> 20% of the area of that region), were removed from the analysis. Moreover, the total surface areas of the lesions were measured in all quail, including NIDO quail. Statistical analysis The behavioral data were not normally distributed and therefore, nonparametric statistical analyses were performed using Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., USA, ). To investigate whether surgery had any deleterious effect on the general health of the quail, the weight gain during the experiment (weight at the end minus weight at the beginning of the experiment) was compared across treatment groups, using the Kruskall-Wallis test. The total extent of the lesions, the variables for each test of fear and the overall fear score were compared across treatment groups using Kruskall-Wallis tests followed by Mann-Whitney tests when appropriate. For all tests, p<0.05 was accepted as significant. 48

76 Figure 2: A series of charts illustrating the extent of the lesions in A: the anterior part of the arcopallium, B: the posterior part of the arcopallium / PoA and C: the nidopallium, in quail with the smallest (black) and largest (grey) lesions. D: Schematic drawings of coronal sections of the quail brain illustrating the localization of the anterior and posterior parts of the arcopallium and other anatomical landmarks. AA, Anterior Arcopallium; AP, Posterior Arcopallium + posterior pallial amygdala; CA, Commissura Anterior; LFB, Lateral Forebrain Bundle; LFM, Lamina Frontalis Suprema; LM, Lamina Mesopallialis; LPS, Lamina Pallio-Subpallialis; N, Nidopallium; OM, Tractus Occipitomesencephalicus; QF, Tractus Quintofrontalis; TrO, Tractus Opticus; TSM, Tractus Septopallio-Mesencephalicus. li A B C Lesions in the anterior arcopallium Lesions in the posterior arcopallium / PoA Lesions in the nidopallium D Anatomical landmarks LFM LM LPS N AA LFM LM N LPS QF AA TSM TSM LFM LPS N LFB AA LM N LPS CA TrO AP LPS TrO OM AP LM LPS AP TrO

77 Chapitre 1 Results Histology After histological analysis of the lesions sites, one AA quail was removed from the analysis because it received too small a lesion and one quail was also removed because it received too large a lesion in the posterior arcopallium. In the AA quail (n = 7), a mean of 39.2 % of the left and 41.5 % of the right anterior arcopallium were destroyed, 3.3% of the left posterior arcopallium and 3.3% of the right posterior arcopallium were lesioned (Figs. 2A & 3A). Two AP quail were removed from the statistical analysis because they received too small lesions in the posterior arcopallium and two quail were removed because they received too large lesions in the anterior arcopallium. In AP quail (n = 5), 49.5 % of the left and 40.0 % of the right posterior arcopallium were lesioned, 4.1% of the left anterior arcopallium and 4.9% of the right anterior arcopallium, were lesioned (Figs. 2B & 3B). In NIDO quail (n=7), the lesions affected the dorsolateral nidopallium (Figs. 2 C & 3C). The extent of tissue damaged was similar to that of AA and AP quail (mean ± SEM: NIDO = 3.2 ± 0.7 mm 3 ; AA = 2.1 ± 0.9 mm 3 ; AP = 3.5 ± 1.6 mm 3 ; H = 4.54, p = 0.104, Kruskall-Wallis test). Behavior All quail awoke from the anesthetic about two hours after surgery ended and recovered normal locomotor activity and feeding behavior within a maximum of 36 hours. There was no significant effect of treatment on weight gain during the experiment (H = 4.77, p>0.05, median weight gain for all groups = 11.5 [3.5; 16.5] g), indicating that all quail displayed similar food intake / expenditure. Neither was there any difference in behavior between SHAM and NIDO quail in any of the behavioral variables investigated. There was a significant effect of treatment on the latency to leave the central zone in the open-field test (H = 10.68, p<0.05, Fig. 4A). AP quail showed a significantly longer latency to leave the central zone than SHAM (z = 2.1, p<0.05), NIDO (z = 2.2, p<0.05) and AA quail (z = 2.68; p<0.01). The latency for AA quail to leave the central zone tended to be shorter than that of SHAM quail (z = 1.81, p = 0.07), but it did not differ significantly from that of NIDO quail (z = 0.19). There was no significant effect of treatment on the number of zone boundaries crossed in the open-field test (H= 5.53, p> 0.05, Fig 4B). 49

78 Figure 3: Photographs of lesions in one cerebral hemisphere representative of quail with lesions in A: the anterior arcopallium, B: the posterior arcopallium + posterior pallial amygdala and C: the nidopallium. AA, Anterior Arcopallium; AP, Posterior Arcopallium + posterior pallial amygdala; LFB, Lateral Forebrain Bundle; LFM, Lamina Frontalis Suprema; LM, Lamina mesopallialis; LPS, Lamina Pallio-Subpallialis; N, Nidopallium; QF, Tractus Quintofrontalis; TrO, Tractus Opticus; TSM, Tractus Septopallio-Mesencephalicus. A N LPS LFM B LM LPS AA LFB TSM AP TrO C LFM N LM LPS QF TSM

79 Chapitre 1 There was no significant effect of treatment on the time spent in the zone near the object in the novel object test, nor in the difference between the time spent pacing in the control and novel object tests (H <3.66, p>0.05 for both measures; Figs 4C,D). Neither was there any significant effect of treatment on the latency to emerge from the dark compartment in the hole-in-the-wall test (H = 5.57, p>0.05; Fig. 4E) or in the duration of tonic immobility (H = 3.77, p>0.05; Fig. 4F). There was a significant effect of treatment on the overall fear score (H = 8.9, p<0.05; Fig. 5). AA quail showed a significantly lower score than SHAM (z = 2.07, p<0.05), NIDO quail (z = 1.98, p<0.05) or AP quail (z = 2.52; p<0.05). The overall fear score of AP quail did not differ significantly from that of SHAM or NIDO quail (z = 1.54, p>0.05 and z = 0.98, p>0.05 respectively). 50

80 Figure 4: Box-plot diagrams illustrating the effect of anterior arcopallium lesions and posterior arcopallium + posterior pallial amygdala lesions on A) the latency to leave the central zone in the 'open-field' test, B) the number of zone boundaries crossed in the 'open-field' test, C) the difference in the time spent in the 'near zone' between the object and control trials in the novel object test, D) the difference in time spent pacing between the object and control trials in the novel object test, E) the latency to emerge from the dark compartment in the 'hole-in-the-wall' test, F) the duration of tonic immobility. AA, bilateral lesions of the anterior arcopallium; AP, bilateral lesions of the posterior arcopallium + posterior pallial amygdala; NIDO, bilateral lesions of the nidopallium; SHAM, bilateral electrode penetrations of the telencephalon without electrolytic lesions. Values illustrated by a box-plot are the median, upper and lower quartiles, 10th and 90th percentiles. *= p<0.05, **= p<0.01. A 200 Latency to leave the central zone in the open-field test (s) 250 * * * B Number of boundaries crossed in the open-field test * AA AP NIDO SHAM AA AP NIDO SHAM Difference in the time spent in the near zone C between the novel object and control trials (s) AA AP NIDO SHAM E Latency to emerge from the dark compartment in the hole-in-the-wall test (s) AA AP NIDO SHAM D F Difference in the time spent pacing between the novel object and control trials (s) AA AP NIDO SHAM Duration of tonic immobility (s) AA AP NIDO SHAM

81 Figure 5: Box-plot diagrams illustrating the effect of anterior arcopallium lesions and posterior arcopallium + posterior pallial amygdala lesions on the overall fear score derived from the novel object, 'hole-in-the-wall', 'open field' and tonic immobility tests. The score theoretically ranged from 4 to 112 (see text for details). AA, bilateral lesions of the anterior arcopallium; AP, bilateral lesions of the posterior part of the arcopallium + posterior pallial amygdala; NIDO, bilateral lesions of the nidopallium and SHAM, bilateral electrode penetrations ti of the telencephalon l without t electrolytic l ti lesions. Values illustrated by a box-plot are the median, upper and lower quartiles, 10th and 90th percentiles. * = p<0.05 compared to SHAM, NIDO and AP quail * Overall fear score AA AP NIDO SHAM

82 Chapitre 1 Discussion The results of the present study indicate a differential involvement of the posterior arcopallium / PoA and the anterior arcopallium in the control of fear behavior in Japanese quail. Electrolytic lesions of the posterior arcopallium / PoA significantly increased a fear response in the open-field test. In contrast, lesions damaging the anterior arcopallium did not significantly affect fear responses in any of the four individual tests of fear investigated, but they did significantly reduce the overall fear score. Nidopallium lesions of similar size to those of the anterior or posterior arcopallium / PoA did not affect quail fear behavior in any of the tests investigated and therefore, the effects of lesions of the anterior and posterior arcopallium / PoA are unlikely to be due to brain damage per se. In the present study, electrolytic lesions damaging the posterior part of the arcopallium / PoA induced an increase in fear behavior (as indicated by an increased latency to leave the central zone) in the open-field test, in comparison to quail with anterior arcopallium, nidopallium or sham lesions. Zeier & Karten (1971) and Davies et al. (1997) have previously suggested that the posterior part of the arcopallium / PoA has limbic functions and may be partly homologous to the mammalian amygdala, which is known to be critical for the processing of fear responses in mammals (for review, see LeDoux, 2000). The results of the present study are, to our knowledge, the first to directly implicate the posterior arcopallium / PoA in avian fear behavior. However, it is perhaps surprising that lesions of this region induced an increase in fear in the open field test, because lesioning the entire arcopallium / PoA has been demonstrated to decrease fear in open-field tests in domestic chicks (Phillips & Youngren, 1986; Lowndes & Davies, 1996). Lesions of the entire arcopallium / PoA have also been reported to reduce avian fear behavior in a variety of other tests (e.g. Dafters, 1975; Martin, Delanerolle & Phillips, 1979; Phillips, 1964). However, Maser et al. (1973) reported an increase in fear behavior in the tonic immobility test after partial lesions of the arcopallium in chickens. These lesions mainly affected a restricted portion of the ventral intermediate arcopallium, which was also damaged in quail receiving AP lesions in the present study. Therefore, the posterior arcopallium / PoA may contain a small population of neurons with an inhibitory action on the expression of fear behaviour: lesioning such an inhibitory region, while leaving the rest of the arcopallium / PoA complex intact, would increase fear responses, as observed in the present study. The results of the current study also provide the first direct demonstration that the anterior arcopallium plays a role in the control of fear behavior in birds. Quail with lesions 52

83 Chapitre 1 damaging the anterior arcopallium displayed a decrease in the overall fear score compared to quail with posterior arcopallium / PoA, nidopallium or sham lesions. A decrease in fear behavior after lesions of the entire arcopallium / PoA has been widely reported in the literature (Phillips, 1964; Dafters, 1975; Martin et al., 1979; Phillips & Youngren, 1986; Lowndes & Davies, 1996). However, the involvement of the anterior arcopallium alone in fear behavior is somewhat surprising, since it appears to be mainly connected to brain structures involved in the somatic sensorimotor system (Zeier & Karten, 1971; Davies et al., 1997). However, Davies et al. (1997) have also shown that the anterior arcopallium of the domestic chicks has widespread projections to structures that are traditionally considered to be limbic in nature, such as the medial striatum (formerly named lobus parolfactorius), hippocampal formation, nucleus accumbens and lateral part of the bed nucleus of the stria terminalis. Davies et al. (1997) described that it is the ventral part of the anterior arcopallium that contributes most strongly to this limbic projection. In the current experiment, lesions of the anterior arcopallium always affected its ventral part (see Figure 2), potentially disrupting the limbic projection and thus, decreasing fear behavior. Comparison of the effects of lesions on the fear responses observed in the variety of tests employed in the current experiment supports the possibility that different fear responses are subserved by different neural circuits. Although lesions of the anterior arcopallium did not significantly affect fear responses in any of the individual tests investigated, they significantly decreased the overall fear score and within each individual test, lesioned quail displayed numerically less fear behavior than quail with posterior arcopallium / PoA, nidopallium or sham lesions (see Figs. 4 & 5). Thus, it appears that the anterior arcopallium is involved in aspects of fear common to all of the tests employed. In contrast, lesions damaging the posterior arcopallium / PoA affected fear responses in one specific test, the open-field test, but not in the novel object, hole-in-the-wall or tonic immobility tests. In view of the extensive projections of the posterior arcopallium / PoA to brain regions considered to be limbic (Zeier & Karten, 1971; Davies et al., 1997), lesions of this structure were expected to affect fear behavior in all of the different tests used, but the relatively small number of individuals and relatively small lesion sizes might explain their lack of effect in some of the tests. However, a dissociation between the effects of lesions in individuals tests has previously been demonstrated: lesions of the entire arcopallium / PoA in domestic chicks reduced fear in the open-field but not the fear responses to a novel object (Lowndes & Davies, 1996). Therefore, the posterior arcopallium / PoA may be involved in some, but not all fear responses. It appears to be 53

84 Chapitre 1 particularly involved in the behavioral responses induced by placement in a novel environment, a principal characteristic of the open-field test. Such a restricted role in fear behavior is consistent with the notion that fear is a multidimensional concept (Boissy, 1995; Désiré, Boissy & Veissier, 2002; Russell, 2003). Thus, different brains areas may be required to elicit different aspects of fear behavior. A selective involvement of individual brain regions in different fear responses has also been observed in rats. For example, it has been suggested that the bed nucleus of the stria terminalis may preferentially mediate the expression of unconditioned fear, whereas the central nucleus of the amygdala may preferentially mediate the expression of conditioned fear (Fendt, Endres & Apfelbach, 2003; LeDoux, 2000). Therefore, it appears reasonable to assume that different aspects of fear may be controlled by different fear circuits in both the avian and mammalian brains, although the existence of a one-to-one relationship between a behavior and a brain region is probably over-simplistic (Walker, Toufexis & Davis, 2003). The results of the present study suggest that the posterior arcopallium / PoA controls a specific aspect of fear whereas the anterior arcopallium is involved in aspects of fear common to the tests employed in the current experiment. The differential involvement of the anterior and posterior parts of the arcopallium / PoA in fear behavior observed in the present study, constitutes a first step towards a better understanding of the neural circuits subserving fear in the avian brain. First, the posterior arcopallium / PoA may cause inhibition of fear responses in the open-field test via its projections to others structures considered to be limbic in nature, such as the hypothalamus, dorsomedial thalamus, hippocampal complex and medial striatum (Zeier & Karten, 1971; Davies et al., 1997; Atoji, Saito & Wild, 2006). This inhibitory action might be mediated by GABA, the main inhibitory neurotransmitter in vertebrates, since mrna for its synthetic enzyme glutamic acid decarboxylase is expressed in the posterior arcopallium / PoA of domestic chicks (Sun et al., 2005), probably in local circuit neurons. Even if GABAergic local circuit neurons are scarce in the posterior arcopallium / PoA, they might constitute a local inhibitory network involved in the control of fear behavior. Second, it is possible that the anterior arcopallium may facilitate behavioral expressions of fear via its projections to limbic brain areas such as the medial striatum, hippocampal formation, nucleus accumbens and bed nucleus of the stria terminalis (Davies et al., 1997). Finally, the fact that the anterior arcopallium projects to the posterior arcopallium / PoA (Davies et al., 1997) suggests that it can influence the function of the posterior arcopallium / PoA. 54

85 Chapitre 1 Additional studies will be necessary to elucidate the precise role of the arcopallium and PoA in the expression of fear behavior in birds. This heterogeneous brain area processes multimodal information and may, to some extent, be compared to parts of the mammalian cortex (Zeier & Karten, 1971; Davies et al., 1997; Reiner et al., 2004; Atoji et al., 2006). Several reports have described its involvement in complex cognitive tasks such as passive avoidance learning, filial imprinting and food learning (Lowndes & Davies, 1996; Lowndes, Davies &Johnson, 1994; Aoki, Csillag & Matsushima, 2006; Aoki, Suzuki, Izawa, Csillag & Matsushima, 2006). Therefore, it is not surprising that the involvement of the arcopallium / PoA region in fear behavior is complex. Such a cerebral complexity mirrors the complexity of fear itself and its behavioral expression. 55

86 Chapitre 1 Acknowledgements H. Saint-Dizier was supported by a PhD grant from the Conseil Régional du Centre and INRA. We thank M; Couty, from the Unité de Recherches Avicoles (INRA, Nouzilly, France), J-M. Brigant and J-M. Hervouët, from the Unité Expérimentale Avicole (INRA, Nouzilly, France) for technical assistance. References Aoki, N., Csillag, A., & Matsushima, T. (2006). Localized lesions of arcopallium intermedium of the lateral forebrain caused a handling-cost aversion in the domestic chick performing a binary choice task. European Journal of Neuroscience, 24(8), Aoki, N., Suzuki, R., Izawa, E., Csillag, A., & Matsushima, T. (2006). Localized lesions of ventral striatum, but not arcopallium, enhanced impulsiveness in choices based on anticipated spatial proximity of food rewards in domestic chicks. Behavioural Brain Research, 168, Atoji, Y., Saito, S., & Wild, J. (2006). Fiber connections of the compact division of the posterior pallial amygdala and lateral part of the bed nucleus of the stria terminalis in the pigeon (Columba livia). Journal of Comparative Neurology, 499, Baylé, J.-D., Ramade, F., & Olivier, J. (1974). Stereotaxic topography of the brain of the quail (Coturnix coturnix japonica). Journal of Physiology, 68, Boissy, A. (1995). Fear and fearfulness in animals. The Quarterly Review of Biology, 70, Dafters, R. (1975). Active avoidance behavior following archistriatal lesions in pigeons. Journal of Comparative Physiological Psychology, 89, Davies, D. C., Csillag, A., Székely, A. D., & Kabai, P. (1997). Efferent connections of the domestic chick archistriatum: a phaseolus lectin anterograde tracing study. Journal of Comparative Neurology, 389, Desire, L., Boissy, A., & Veissier, I. (2002). Emotions in farm animals: a new approach to animal welfare in applied ethology. Behavioural Processes, 60, Faure, J. M., Arnould, C., Beaumont, C., Guémené, D., Leterrier, C., Mills, A. D., et al. (2006). Consequences of selection for fear in Japanese quail. Archiv für Geflügelkunde, 70, Fendt, M., Endres, T., & Apfelbach, R. (2003). Temporary inactivation of the bed nucleus of the stria terminalis but not of the amygdala blocks freezing induced by trimethylthiazoline, a component of fox feces. Journal of Neuroscience, 23,

87 Chapitre 1 Goodman, I. J., & Brown, J. L. (1966). Stimulation of positively and negatively reinforcing sites in the avian brain. Life Sci, 5(8), Jones, R. B. (1996). Fear and adaptability in poultry : insights, implications and imperatives. World's Poultry Science Journal, 52, Kuenzel, W. J., & Masson, M. (1988). A stereotaxic atlas of the brain of the chick (Gallus gallus domesticus). Baltimore, MD: John Hopkins University Press. LeDoux, J. (2000). Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience, 23, Lowndes, M., & Davies, D. C. (1996). The effect of archistriatal lesions on 'open field' and fear/avoidance behaviour in the domestic chick. Behavioural Brain Research, 72(1-2), Lowndes, M., Davies, D. C., & Johnson, M. H. (1994). Archistriatal lesions impair the acquisition of filial preferences during imprinting in the domestic chick. European Journal of Neuroscience, 6, Martin, J. T., Delanerolle, N., & Phillips, R. E. (1979). Avian archistriatal control of fearmotivated behavior and adrenocortical function. Behavioural Processes, 4(4), Maser, J., Klara, J., & Gallup, G. G. (1973). Archistriatal lesions enhance tonic immobility in the chicken (Gallus Gallus). Physiology & Behavior, 11, Mills, A. D., & Faure, J. M. (1991). Divergent Selection for Duration of Tonic Immobility and Social Reinstatement Behavior in Japanese Quail (Coturnix coturnix japonica) Chicks. Journal of Comparative Psychology, 105, Phillips, R. (1964). "Wildness" in the Mallard duck: effects of brain lesions and stimulation on "escape behavior" and reproduction. J Comp Neurol, 122, Phillips, R., & Youngren, O. (1971). Brain stimulation and species-typical behaviour: activities evoked by electrical stimulation of the brains of chickens (Gallus Gallus). Animal Behaviour, 19, Phillips, R., & Youngren, O. (1986). Unilateral kainic acid lesions reveal dominance of right archistriatum in avian fear behavior. Brain Research, 377, Reiner, A., Perkel, D. J., Bruce, L. L., Butler, A. B., Csillag, A., Kuenzel, W., et al. (2004). Revised nomenclature for avian telencephalon and some related brainstem nuclei. Journal of Comparative Neurology, 473, Richard, S., Wacrenier-Ceré, N., Hazard, D., Saint-Dizier, H., Arnould, C., & Faure, J. M. (2007). Behavioural and endocrine fear responses in Japanese quail upon presentation of a novel object in the home cage. Behavioural Processes, doi: /j.beproc

88 Chapitre 1 Russell, J. A. (2003). Core affect and the psychological construction of emotion. Psychological Review, 110, Sun, Z., Wang, H. B., Laverghetta, A., Yamamoto, K., & Reiner, A. (2005). The distribution and cellular localization of glutamic acid decarboxylase-65 (GAD65) mrna in the forebrain and midbrain of domestic chick. Journal of Chemical Neuroanatomy, 29(4), Walker, D. L., Toufexis, D. J., & Davis, M. (2003). Role of the bed nucleus of the stria terminalis versus the amygdala in fear, stress, and anxiety. European Journal of Pharmacology, 463(1-3), Zeier, H., & Karten, H. (1971). The archistriatum of the pigeon: organization of afferent and efferent connections. Brain Research, 31,

89 Chapitre 1 Commentaires sur le Chapitre 1 L expérience présentée dans ce chapitre a permis de montrer l existence d une implication différentielle de deux sous-régions de l arcopallium / amygdale palliale postérieure (PoA) dans le contrôle des comportements de peur chez les oiseaux. En effet, alors que des lésions de la partie antérieure de l arcopallium (AA) ont entraîné une diminution des comportements de peur de façon globale dans différents tests, des lésions de la partie postérieure (AP) ont entraîné une augmentation des comportements de peur exprimés dans l open-field uniquement. Les différences observées entre l implication de l AA et de l AP dans le contrôle des comportements de peur se situent donc à deux niveaux : d une part, les deux sous-régions semblent jouer des rôles opposés et d autre part, alors que l AP semble être sollicité dans des situations de peur spécifiques, l AA semble jouer un rôle plus général dans les comportements de peur. AA et AP, des rôles opposés? Le résultat le plus inattendu de cette étude fut d observer une augmentation des réponses de peur des cailles après lésion de l AP. En effet, des lésions affectant l ensemble de l arcopallium / PoA induisent généralement une diminution des réactions de peur (Phillips, 1964 ; Phillips et Youngren, 1986 ; Lowndes et Davies, 1995). Cependant, dans les années 70, Maser et al. (1973) avaient déjà observé une augmentation des comportements de peur (augmentation de la durée d immobilité tonique) après lésion partielle de l arcopallium / PoA chez le poulet. Ces lésions partielles semblaient affecter principalement un petit territoire qui était aussi affecté par les lésions que nous avons effectuées dans le groupe AP (partie ventrale et centrale de l AP). Nos résultats, ainsi que ceux de Maser, nous conduisent à suggérer qu il puisse exister une sous-région inhibitrice des comportements de peur au sein de l AP. L hypothèse d une sous-région inhibitrice au sein de l arcopallium / PoA avait déjà été émise à la suite d une étude réalisée au laboratoire quelques années auparavant (Richard, 2000 ; Richard et al., 2005). En effet, une étude morphologique avait montré que le volume de l arcopallium / PoA était plus important chez les cailles de la lignée STI que chez les cailles LTI. Il avait été supposé que, puisque les cailles de la lignée STI montrent en général des comportements de peur réduits, la supériorité de volume de l arcopallium / PoA chez ces cailles était peut-être liée au développement préférentiel d une région ayant un rôle inhibiteur sur les comportements de peur (Richard, 2000). Cependant, mis à part la présence de GABA, neurotransmetteur à 59

90 Chapitre 1 action inhibitrice, au sein de l arcopallium / PoA (Sun et al., 2005), les éléments confortant l hypothèse d une éventuelle action inhibitrice de l AP sur les comportements de peur, sont peu nombreux. De nouvelles études de neuroanatomie fonctionnelle ciblées sur cette région seront nécessaires pour tester cette hypothèse. Au cours de cette étude nous avons été surpris de découvrir l implication de la partie antérieure de l arcopallium (l AA) dans l expression des comportements de peur. En effet, compte tenu des principales connexions de l AA, différents auteurs ont supposé que cette structure était probablement davantage impliquée dans le contrôle de fonctions sensorimotrices que dans le contrôle de fonctions émotionnelles (Zeier et Karten, 1971 ; Davies et al., 1997a). Cependant, Davies et al. (1997a) ont décrit des projections de la partie ventrale de l AA vers le noyau du lit de la strie terminale et le noyau accumens, structures traditionnellement considérées comme «limbiques». Or dans notre étude, les lésions de l AA affectaient systématiquement ce territoire ventral. Ces données nous conduisent à suggérer que la partie ventrale de l AA puisse contenir une population de neurones impliqués dans le contrôle des comportements de peur. Ainsi compte tenu des résultats obtenus sur l AP et l AA, il serait intéressant de poursuivre la spécification des limites de sous-régions de l arcopallium / PoA responsables du contrôle des réponses de peur. Notre étude a en effet permis de délimiter deux larges sous-régions impliquées, mais d autres investigations devront affiner l identification des limites entre les différentes sous-régions de l arcopallium. Pour cela, l utilisation d un marqueur d activation neuronale permettrait de repérer plus précisément des populations de neurones activés en réponse à une situation effrayante. Une telle étude sera présentée dans le chapitre 2. AA et AP, implication globale vs. implication spécifique dans les comportements de peur? Dans cette étude, l effet de l inactivation de deux sous-régions de l arcopallium / PoA a été étudié dans des tests de peur variés, permettant de visualiser les implications respectives des sous-régions dans différents aspects de la peur. Le fait que les lésions de l AA induisent une légère diminution des comportements de peur dans tous les tests, laisse entendre que cette région serait modérément impliquée dans l activation d un large spectre de comportements de peur chez l oiseau. En effet, la diminution des comportements de peur induite par la lésion n est significative pour aucun des tests considérés isolément, mais elle est significative lorsqu on considère un score global de peur, qui prend en compte les réactions de peur des individus au cours des quatre tests de peur. Ce résultat indique 60

91 Chapitre 1 que l AA semble participer à la modulation de comportements de peur variés. A l inverse, l inactivation de l AP n a eu d effet que sur les comportements de peur des oiseaux dans le test d open-field. Il est donc possible que cette sous-région ne soit impliquée que dans certains aspects de la peur. Dans le test d open-field, les stimuli inducteurs de peur étant une manipulation par l expérimentateur et un placement dans un environnement nouveau sans possibilité d échappement (voir introduction générale), il est probable que les aspects de la peur concernés par l AP soient liés à ces stimuli. Ces résultats suggèrent que l AA et l AP jouent des rôles distincts dans le contrôle des comportements de peur, l AA semblant faciliter l expression des comportements de peur en général, alors que l AP semble exercer une action inhibitrice focalisée sur certains comportements de peur. Il est cependant nécessaire de compléter ces données par des études approfondies de l implication de chaque sous-région de l arcopallium / PoA avec l emploi de tests induisant des aspects spécifiques de la peur. De plus, pour améliorer la compréhension des liens existant entre ces sous-régions et les comportements de peur, il apparaît aussi nécessaire d approfondir la réflexion sur le concept de peur. Les diverses situations expérimentales utilisées semblent susciter divers aspects de la peur, potentiellement contrôlés par des circuits neuronaux différents. Ces différents aspects peuvent-ils être globalisés dans une seule et même unité, «la peur», ou correspondent-ils à «différentes peurs»? Ces questions seront abordées dans le chapitre 3 et la discussion générale de ce mémoire. 61

92 CHAPITRE 2 Identification de structures cérébrales susceptibles d être impliquées dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux, par une étude d activation neuronale Article en préparation

93 Chapitre 2 CHAPITRE 2 : Identification de structures cérébrales susceptibles d être impliquées dans l expression des comportements de peur chez les oiseaux, par une étude d activation neuronale. Après s être intéressé aux détails de l implication de la seule structure connue pour être impliquée dans le contrôle des comportements de peur chez l oiseau, l arcopallium / PoA, nous avons cherché, dans ce deuxième chapitre, d autres structures susceptibles de participer aux réseaux neuronaux contrôlant l expression de ces comportements. En effet, étant donné la variété et la complexité des comportements de peur chez l oiseau, il est probable que ces comportements soient dirigés par plusieurs circuits neuronaux mettant en jeu de nombreuses structures cérébrales. Nous avons entrepris une approche exploratoire permettant de repérer des populations neuronales activées lors de l expression des comportements de peur, considérant qu une telle approche serait susceptible d indiquer des régions pouvant participer au contrôle des réactions de peur. Pour cela, nous avons quantifié l activation neuronale dans des structures candidates, en situation témoin et en réponse à une situation effrayante. Pour faciliter la mise en évidence de populations neuronales spécifiquement activées lors de l expression des comportements de peur, nous avons utilisé des cailles des lignées STI et LTI, génétiquement sélectionnées sur leur propension à exprimer des comportements de peur. En effet, placées dans une même situation de peur, les cailles STI et LTI sont susceptibles de montrer une activation neuronale différente dans des régions jouant un rôle spécifique dans l expression des comportements de peur. Il a par exemple été observé que deux lignées de rats aux comportements plus ou moins anxieux montrent une différence d activation neuronale après exposition à un test d open field dans des régions impliquées dans le contrôle des réactions d anxiété, telle que le noyau paraventriculaire de l hypothalamus (Salomé et al., 2004). Ainsi, à l instar des modèles utilisés chez les rongeurs, la comparaison de l activité cérébrale des cailles LTI et STI devrait faciliter la mise en évidence de structures spécifiquement activées lors de l expression des comportements de peur. Une étude d activation neuronale nécessite au préalable la validation d une situation de peur adaptée. En effet, il a été montré qu un simple changement d environnement induisait une forte activation neuronale dans des régions du cerveau non 62

94 Chapitre 2 spécifiques de la peur (Richard et al., 2003). Or, la plupart des tests comportementaux utilisés pour induire des réactions de peur chez les oiseaux (par exemple, les tests d immobilité tonique, d open field ) comprennent un changement d environnement. Nous avons donc choisi pour cette étude, un test qui évitait un changement d environnement pour l animal mais qui impliquait tout de même une stimulation forte et durable. Il s agit de l introduction soudaine d un objet nouveau dans la cage d élevage. La nouveauté est classiquement utilisée pour induire des réactions de peur chez l animal (Bronson, 1968 ; Boissy, 1995 ; Jones, 1996). Une situation de test de présentation d un objet nouveau dans la cage d élevage a été mise au point au laboratoire. Il a été montré que cette situation induisait chez les cailles STI et LTI, des réponses physiologiques (augmentation de la corticostéronémie) et comportementales (évitement de l objet et tentatives de fuite) caractéristiques d un état de peur (Richard et al., 2007b). Pour étudier l activation neuronale, nous avons utilisé un marqueur classique d activation neuronale, la protéine FOS, produit d expression du gène à expression précoce c-fos. Cette méthode a été largement utilisée pour visualiser l activation neuronale dans diverses situations de peur chez les mammifères (Silveira et al., 1993 ; Dielenberg et al., 2001 ; Salomé et al., 2004). Chez l oiseau, cette méthode est aussi largement utilisée et a par exemple permis de cibler des structures cérébrales potentiellement impliquées dans l expression des comportements sexuels chez la caille japonaise (Meddle et al., 1999 ; Suge et McCabe, 2004 ; Heimovics et Riters, 2006). Le but de cette étude fut donc d étudier l activation neuronale chez des cailles STI et LTI après exposition à un objet nouveau dans la cage d élevage, en utilisant un marquage immunohistochimique de la protéine FOS. Le choix de structures candidates, au sein desquelles l activation neuronale serait étudiée, a été établi sur la base des connaissances neuroanatomiques disponibles chez les oiseaux et des comparaisons possibles avec des structures connues chez les mammifères pour jouer un rôle dans l expression des comportements de peur. Nous avons ciblé notre étude sur la mesure de l activation neuronale dans l arcopallium / PoA, le BST et le PVN et justifié ces choix dans l article présenté dans les pages suivantes. Au préalable, nous avons souhaité présenter les mises au point méthodologiques qui ont été nécessaires à la réussite de cette expérience. 63

95 Chapitre 2 Chapitre 2, Etude préliminaire : Méthode de conservation des cerveaux et des coupes en vue d améliorer le marquage immunohistochimique de la protéine FOS. L expérience visant à étudier l activation neuronale à l aide du marquage immunohistochimique de la protéine FOS a nécessité, au préalable, de traiter les cerveaux. Une fois le prélèvement des cerveaux réalisé, ils étaient tous immergés dans du paraformaldéhyde pendant 3 h puis placés dans une solution de sucrose 30 % à + 4 C, en attendant l étape de coupe au cryostat. Les coupes de cerveaux étaient ensuite placées dans une solution d antigel à -20 C, en attendant l étape du marquage immunohistochimique. Compte tenu de ces différents traitements, nous n avons pas été en mesure de traiter simultanément l ensemble des cerveaux. Ainsi, les cerveaux ont été traités avec des délais différents entre le prélèvement et la coupe ou entre la coupe et le marquage. Or, lors des premiers essais de marquage immunohistochimique de la protéine FOS, nous avons observé que lorsque le marquage immunohistochimique était réalisé sur des cerveaux prélevés plus d une semaine auparavant, le nombre de neurones marqués et l intensité du marquage étaient très faibles. Nous avons en premier lieu fait l hypothèse que la méthode de conservation des coupes de cerveaux que nous utilisions (dans une solution d antigel à -20 C) n était pas adéquate. Pour tester cette hypothèse nous avons comparé cette méthode à une autre méthode de conservation utilisée au laboratoire (TBS-TA à +4 C) : 3 cerveaux de cailles ayant subi le même traitement ont été coupés le lendemain du prélèvement. La moitié des coupes de chaque cerveau ont été placés dans l antigel à -20 C alors que les autres coupes étaient stockées dans le TBS-TA à + 4 C. Nous avons ensuite comparé la qualité du marquage immunohistochimique obtenu après conservation des coupes pendant 1 jour, 10 jours ou 30 jours. Les résultats ont montré qu il n y avait pas de diminution du marquage au cours du temps : nous n avons pas observé de différence entre les coupes marquées 1 jour après la coupe et les coupes marquées 10 ou 30 jours après la coupe, quelle que soit la méthode de conservation utilisée. La méthode conservation des coupes dans l antigel (à - 20 C) que nous avions utilisée pendant les premiers essais, n était donc pas à l origine de la diminution de marquage observée au bout d un certains temps. Nous avons alors fait l hypothèse que la conservation des cerveaux à +4 C dans le sucrose avant la coupe au cryostat pouvait être à l origine du problème. Pour tester cette hypothèse, nous avons investi en parallèle deux nouvelles méthodes de conservation des 64

96 Chapitre 2 cerveaux utilisées par des collègues, sur 6 cerveaux de cailles ayant subi le même traitement : 3 cerveaux placés à -20 C dans une solution cryoprotectrice pendant que 3 autres cerveaux ont été placés à -80 C sans cryoprotection. Nous avons ensuite testé différents délais entre le prélèvement et la coupe : 1 jour, 10 jours et 30 jours. Tous les cerveaux ont été marqués tout de suite après la coupe. Les résultats ont montré qu il n y avait pas de différences de marquage entre les cerveaux coupés 1 jour après le prélèvement et 10 ou 30 jours après, quelle que soit la méthode de conservation. La conservation des cerveaux à +4 C était donc responsable de la diminution du marquage observée après une semaine d expérimentation, lors de notre expérience préliminaire. Pour l étude présentée dans ce chapitre, nous avons donc choisi de placer les cerveaux à -80 C sans cryoprotection, juste après le prélèvement (et passage dans le parformaldéhyde et sucrose) puis de conserver les coupes dans l antigel à -20 C. 65

97 Chapitre 2 Fearfulness influences Fos expression in the paraventricular hypothalamic nucleus, bed nucleus of the stria terminalis and arcopallium / posterior pallial amygdala in Japanese quail. Hélène Saint-Dizier 1, Nathaële Wacrenier-Ceré 2, Christine Leterrier 1, Frédéric Lévy 1 and Sabine Richard 1 1- Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA UMR85 CNRS UMR 6175 Université de Tours Haras Nationaux, F Nouzilly, France. 2- Unité de Recherches Avicoles, INRA UR 83, F Nouzilly, France Correspondence regarding this article should be addressed to Sabine Richard, INRA, Unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France. Phone number: ; Fax number: Electronic mail should be sent to 66

98 Chapitre 2 Abstract This study investigated whether divergent genetic selection on a behavioural fear trait (tonic immobility duration) was related to change in neural activation in three brains areas potentially involved in the control of fear in birds. Fos expression was assessed in the arcopallium / posterior pallial amygdala (PoA) complex, the bed nucleus of the stria terminalis (BST) and the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) of quail selected for either short (STI) or long (LTI) tonic immobility duration, in two situations: sudden presentation of a novel object in their home cage vs. a control situation. Presentation of a novel object induced typical fear behaviour in STI and LTI quail and an increase in neural activation in the PVN of quail of the LTI line. In the control situation, neural activation was significantly higher in STI than in LTI quail in the anterior arcopallium and in the caudal part of the nucleus taeniae of the amygdala. Moreover, in the lateral part of the BST neural activation was significantly higher in LTI than in STI quail. These differences in neural activation between STI and LTI quail might underlie their differences in fear behaviour. In view of the known connections of these three structures in the avian brain, hypotheses linked to their potential involvement in fear behaviour in birds are discussed, taking into account data available in mammals. Keywords: Brain; Fear; Birds; Emotions; limbic system. 67

99 Chapitre 2 A major challenge of behavioral neuroscience is to understand the neural mechanisms of emotions in vertebrates. Most investigations in this field have involved mammals, in particular in the study of fear, an adaptive emotional response that is induced by the perception of a danger (Boissy, 1995; Jones, 1996). However, knowledge of the neural mechanisms of fear in birds is important for a better understanding of the phylogenic continuity of emotions. To facilitate the understanding of the neural mechanisms underlying fear, the comparison of animals with contrasting fearfulness, defined as the individual predisposition to react in threatening situations (Boissy, 1995), has proved to be useful in mammals (Landgraf & Wigger, 2002; Salomé et al., 2004; Zhang et al., 2004). In birds, two lines of quail divergently selected (Mills et Faure, 1991) for long (LTI) or short (STI) duration of an innate anti-predatory behaviour, tonic immobility (Gallup et al., 1971; Gallup, 1979), display different behavioural responses in a number of classical fear tests: compared to STI quail, LTI quail freeze more, vocalize and move less in an open field, emerge later from a hole-in-the-wall box (Jones et al., 1991), and struggle less during restraint in a crush cage (Jones et al., 1994). Moreover, genetic selection on tonic immobility was associated to changes in the activity of the autonomic nervous system in basal and fear-inducing situations (Valance et al., 2007), responses of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis (Hazard et al., 2005; 2007, 2008) and benzodiazepine and opiate receptors binding in the forebrain (Hogg et al., 1994; 1996). Thus, STI and LTI quail exhibit differences at physiological levels, associated with the behavioural differences in fearfulness. To help in elucidating the neural mechanisms regulating fear behaviour in threatening situations, we assessed the neural activation evoked by a fear-inducing stimulus in STI and LTI quail, in brains areas potentially involved in the control of fear. The literature available about fear in birds has pointed out the role of a brain region comprising the arcopallium and posterior pallial amygdala (arcopallium / PoA, originally called archistriatum; see Reiner et al., 2004), this region being considered as partly homologous to the mammalian amygdala (Zeier & Karten, 1971; Davies et al. 1997a; Reiner et al. 2004; Atoji et al., 2006). Indeed, studies using lesions or stimulations of the arcopallium / PoA complex have suggested a major role for this region in the expression of fear behaviour (Phillips & Youngren, 1971; Martin et al., 1979; Phillips & Youngren, 1986; Lowndes & Davies, 1995). However, this brain region comprises many subdivisions (see Reiner et al., 2004) and the precise neuronal populations which may be specifically involved in the control of fear reactions have not been identified. In addition to the 68

100 Chapitre 2 arcopallium / PoA, the bed nucleus of the stria terminalis (BST) may be suspected to play a role in fear behaviour, but functional evidence is not available in birds. Indeed, the mammalian BST is known to participate in the neural control of fear (Walker et al., 2003) and similarities between the mammalian and the avian BST have been pointed out, based on their connections and neurochemical characteristics (Aste et al., 1998; Richard et al., 2004; Atoji et al., 2006). Finally, the avian PVN is also suspected to play a role in fear responses, since it shares many connectional and neurochemical characteristics with the mammalian PVN and it is assumed to play a role similar to that of the mammalian PVN in the control of endocrine stress responses, notably the control of the activation of the HPA axis (Baylé et al., 1975; Korf, 1984; Mikami, 1986). However, little evidence is available to confirm such a role. Therefore, the aim of the present study was to investigate fearinduced neural activation in the arcopallium / PoA, BST and PVN, three avian brain areas suspected to be involved in the control of fear behaviour. Neural activation was assessed by quantifying the expression of the Fos protein, the product of the immediately-early gene c-fos, a widely used method for detecting neural activation in mammals as well as in birds. In birds, including quail, Fos immunohistochemistry has notably been used to investigate brain areas involved in the expression of several behavioural traits (Meddle, 1999; Suge & McCabe, 2004; Heimovics & Riters, 2006). Fos expression was assessed in STI and LTI quail in two situations: sudden presentation of a novel object in their home cage vs. a control situation. Presentation of a novel object has been shown to induce typical physiological and behavioural fear reactions that are sustained over time, in STI as well as LTI quail (Richard et al., 2007; Saint-Dizier et al., 2007). It was expected that presenting a novel object might induce an increase in Fos expression in the three brain areas investigated, namely the arcopallium / PoA, BST and PVN and that Fos expression might differ between STI and LTI quail. 69

101 Figure 1: Diagram of a cage where the quail were housed after surgery and where the novel object test was performed (viewed from above). The diagram shows the site where the novel object was dropped and the imaginary boundaries delimiting the three zones used for behavior analysis 42 cm Drinker Opaque PVC wall 14 cm Site of object presentation 24 cm Removable feeder Plexiglas wall

102 Chapitre 2 Materials and methods Subjects The experiment involved 40 th generation Japanese quail (Coturnix japonica) selected for Long Tonic Immobility (LTI, n=24) and Short Tonic Immobility duration (STI, n=24), selected and maintained at the Unité Expérimentale Avicole, Nouzilly, France. The selection process has been continued since the foundation of the lines (Mills and Faure, 1991) and at the 40 th generation, the mean duration of tonic immobility (± standard deviation), measured as in Mills & Faure (1991), was 228 (±80) s in the LTI line and 14 (±35) s in the STI line. In this experiment, male and female chicks of both lines were wing-banded on the day of hatching and transferred to a communal floor pen maintained at approximately 40 C by continuous illumination with commercial brooder lamps. Over the second and third weeks after hatching, the temperature was gradually reduced to 20 C and then stabilised. On the 21 st day after hatching, the photoperiod was adjusted to a 16:8 h light:dark schedule. Standard food and water were freely available at all times, unless otherwise specified. Throughout the experiment the birds were treated according to the European Communities Council Directive of November 24, 1986 (86/609/EEC). All procedures described here fully comply with French legislation on research involving animals. Testing apparatus and procedure At the 6 th week of age, 48 adult males were transferred to a testing room maintained at 20 C and under a 16:8 h light: dark photoperiod. A single sex was used in this experiment made to reduce interindividual variability and males were chosen to avoid the changes in behaviour in females related to laying, which may occur unpredictably. The test apparatus and procedure have been described in detail previously (Richard et al. 2007). All quail were housed individually in PVC cages (see Figure 1 for measurements) with woodshavings on the floor and an opaque PVC roof. The front wall of each cage was made of clear Plexiglas in order to be able to record the behaviour of quail with a camera during tests. This apparatus allowed introducing the object, a 21x4 cm multicoloured cylinder covered with 2-cm horizontal stripes of coloured tape, into the cage and pulling it out of the cage from a distance with minimal disturbance to the quail, the experimenter remaining out of sight of the bird during the procedure of object presentation and withdrawal. Quail of both lines were randomly assigned to one of two groups: Object (LTI, n=12; STI, n=12) or control (LTI, n=12; STI, n=12). The test was performed eight or nine days 70

103 Chapitre 2 after the quail had been transferred into individual cages. On test days, the food trough of every cage was removed for 40 min before the test. To habituate the quail to this procedure, the food trough was removed from each cage for 2 h every day, during the week preceding testing. In the object situation, the food trough was replaced and the object was dropped into the cage as soon as the quail pecked at the food. If a quail failed to peck at the food, the object was dropped 60 s after the return of the food trough. The object was withdrawn after 5 min and the quail was left undisturbed for 1 min. The object presentation procedure was then repeated four more times at 1-min intervals, without waiting for the quail to peck in the food trough. In the control situation, the food trough was replaced and the behaviour of each quail was videoed without disturbance for 30 min from the moment they pecked at the food. If a quail failed to peck at the food, the video recording started 60 s after the return of the food trough. Behaviour analysis To analyse the locomotor behaviour of the quail, the cage was subdivided into 3 zones: zone 1 included the food trough and the site of object presentation; zone 2 was an intermediate zone and zone 3 was the area of the cage furthest away from the site of object presentation (Figure 1). The amounts of time spent in zones 1 and 3 were recorded. We also recorded the time spent pacing. Pacing was defined as repetitive movements fixed in form and orientation, including jumps and head movements. The behaviour of Object quail was analysed during the first and fifth presentations of the object and the behaviour of control quail was analysed at corresponding time windows. All observations were made with The Observer 3.0 software (Noldus Information Technology, The Netherlands, 1993). Brain collection and Fos immunohistochemistry Two hours after the beginning of the behavioural observations, quail were deeply anesthetized with a lethal intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (360 mg/kg; Sanofi Santé Animale, France). The thorax was opened and each bird was perfused through the left cardiac ventricule with 50 ml phosphate buffered saline (PBS; 0.1M, ph=7.4) followed by 250 ml 4% paraformaldehyde in PBS. Brains were then removed and immersed overnight in 4% paraformaldehyde in PBS at 4 C. They were subsequently cryoprotected by immersion in 30% sucrose in PBS for 24 hours at 4 C, frozen on dry ice and stored at -80 C until they were cut. Coronal sections (30 µm) were cut in a cryostat at - 71

104 Chapitre 2 20 C and stored in cryoprotectant (30% ethylene glycol and 20% glycerol in 5 mm lowsalt PBS) at -20 C until used for immunohistochemistry. Every fourth section was used for Fos immunohistochemistry. Adjacent sections were collected onto glass slides and stained with cresyl violet to aid in histological localisation of the immunolabelling. Immunohistochemistry was performed on free-floating sections. Unless otherwise specified, Tris-buffered saline (TBS; 0.5M, ph=7.6) was used to dilute reagents and to wash sections between steps. Sections were incubated for 72 hours at 4 C in primary antibody (sc 253 K-25, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) diluted (1:10,000) in TBS containing 0.3% Triton X-100, 0.05% Thimerosal (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) and 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma, Saint Quentin Fallavier, France). The primary polyclonal antibody was raised in rabbit against a 25 amino-acid sequence of the chicken Fos protein sequence. The sections were then incubated in 0.3% hydrogen peroxide at room temperature for 20 min in darkness to reduce endogenous peroxidase activity and were incubated with a biotinylated goat anti-rabbit secondary antibody (BA-1000, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA) diluted (1:2000) in TBS containing 0.3% Triton X-100, 0.05% Thimerosal and 2% goat serum for 24 hours at 4 C. After that, sections were incubated with the avidin-biotin complex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA) diluted (1:2000) in TBS containing 0.3% Triton X-100 and 0.05% Thimerosal. Sections were then washed twice in TBS and twice in Sodium acetate buffer (NaAc; 0.1M; ph = 6.0) prior to visualization with a solution of 0.02 % diaminobenzidine (DAB, Sigma, Saint Quentin Fallavier, France), 0.01 % hydrogen-peroxide (H 2 O 2 ), and 2.5 % Nickel-ammonium sulphate in NaAc. Sections were then mounted in 0.25% gelatine (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) in TBS onto glass slides, air-dried overnight at room temperature, dehydrated in 100% ethanol, defatted in xylene, mounted in DepeX (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) and coverslipped. Quantification of Fos immunoreactivity Quantification of Fos immunoreactivity was carried out using a light microscope with computerised image analysis system (Mercator, Explora Nova, La Rochelle, France). Fos immunoreactive cells were counted according to predetermined gray scale, form (only ovoid shapes were counted as positive nuclei) and size criteria (surface of immunopositive nuclei: 13 to 100 µm²). 72

105 Figure 2: Schematic charts of frontal sections of quail brain illustrating the delineation of the fields used for quantification of Fos-immunoreactivity in the following regions: (A) MSt, used as a reference structure, at a level of the brain corresponding approximately to Plate A9.8 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988); (B) AA and BSTL, at a level of the brain corresponding approximately to Plate A9.0 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988); (C) AA, BSTL, BSTM and TnA, at a level of the brain corresponding approximately to Plate A8.2 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988) (D) different subdivisions within the arcopallium / PoA (AD; AM; AI /PoA; TnA) and PVN, at a level of the brain corresponding approximately to Plate A7.2 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988); (E) two subdivisions within the arcopallium / PoA (AI / PoA and AD), at a level of the brain corresponding approximately to Plate A6.2 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988). AA: anterior arcopallium; AD: dorsal arcopallium; AI / PoA: intermediate arcopallium and posterior pallial amygdala; AM: medial arcopallium; BSTL: lateral part of the bed nucleus of the stria terminalis; BSTM: medial part of the bed nucleus of the stria terminalis; CA: commissura anterior; LFM: lamina frontalis suprema; LM: lamina mesopallialis; LPS: lamina pallio-subpallialis; MST: medial striatum; PVN: paraventricular hypothalamic nucleus; TnA: nucleus taeniae of the amygdala; TrO: tractus opticus; TSM: tractus septopallio-mesencephalicus. A LFM B LM LFM LM LPS LPS AA BSTL MSt TSM C D BSTL AD AM AA CA BSTM TnA AI / PoA TnA TrO PVN E AD AI / PoA TrO

106 Chapitre 2 Atlases of the domestic chick (Kuenzel & Mason, 1988) and Japanese quail (Baylé et al., 1974) brains, together with the examination of cresyl violet staining, were used to aid in histological identification. The nomenclature used in the present paper is based on the revised nomenclature for the avian brain (Reiner et al., 2004). Fos-immunoreactive cells were counted bilaterally in the medial striatum (used as a reference structure), bed nucleus of the stria terminalis, arcopallium / PoA complex and paraventricular hypothalamic nucleus, in sections that were 240 µm apart. Medial striatum (MSt) The MSt was chosen as a reference structure for this study because there is no specific hypothesis about its potential involvement in fear behaviour. In the MSt, Fos-ir cells were counted at 8 rostro-caudal levels, the most caudal level (MSt8) corresponding approximately to Plate A9.0 in Kuenzel & Masson s atlas of the chick brain (1988). The size of the quantification field was adapted to the size of the MSt (Figures 2A): area covered: 0.26 mm 2 for MSt 1 and MSt 2 and 0.9 mm 2 for MSt 3-MSt 8. Bed nucleus of the stria terminalis (BST) Two main subdivisions have been described in the avian BST (Aste et al., 1998), these subdivisions being likely to subserve different functions. The lateral and medial parts of the BST were analysed independently. In the lateral part of the BST (BSTL), Fos-ir cells were counted at 7 rostro-caudal levels, the most rostral level (BSTL1) corresponding approximately to Plate A9.0 in the chicken brain atlas (Kuenzel & Masson, 1988). The quantification field (0.1 mm 2 for BSTL 1-BSTL 3 and mm 2 for BSTL 4-BSTL 7) was adjacent to the ventral horn of the lateral ventricle (Figures 2B & 2C). In the medial part of the BST (BSTM), Fos-ir cells were counted at 3 rostro-caudal levels, the most rostral level taken into account (BSTM1) corresponding approximately to Plate 8.2 in Kuenzel & Masson s chicken brain atlas (1988). The quantification field (0.125 mm 2 for BSTM 1-BSTM 3) was adjacent to the dorsal edge of the anterior commissure (Figure 2C). Arcopallium / posterior pallial amygdala (PoA) complex In the arcopallium / PoA complex, Fos-ir cells were counted at 11 rostro-caudal levels, centred on the section corresponding approximately to Plate A8.2 in the chicken brain atlas (Kuenzel & Masson, 1988). The arcopallium / PoA complex was subdivided into five structures: the anterior arcopallium (AA; Figures 2B & 2C); the nucleus taeniae of 73

107 Chapitre 2 the amygdala (TnA; 2C & 2D); the medial arcopallium (AM; Figures 2D), the dorsal arcopallium (AD; Figures 2D & 2E) and the intermediate arcopallium and posterior pallial amygdala (AI / PoA; Figures 2D & 2E). In the AA, Fos-ir cells were counted at six rostro-caudal levels, the most caudal level (AA6) corresponding approximately to Plate A8.2 in Kuenzel & Masson s atlas (1988) (AA6 to AA1). For the TnA and AM, 4 consecutive sections were analysed, whereas for the AD and AI/PoA, fives consecutive sections were analysed, the most rostral one corresponding to Plate A8.0 in Kuenzel & Masson s atlas of the chicken brain (1988) (TnA1, AM1, AD1, AI/PoA1 respectively). Paraventricular hypothalamic nucleus (PVN) In the PVN, Fos-ir cells were counted at five rostro-caudal levels, the most rostral level corresponding approximately to Plate A7.8 in Kuenzel & Masson s atlas (1988). The quantification field was adjacent to the medial wall of the diencephalon and its size was adapted to the size of the PVN (0.1 mm 2 for PVN 1-PVN 5 and 0.15 mm 2 for PVN 2-PVN 4) (Figure 2D). Within each structure under study, the density of Fos-ir cells in a given section was calculated as the mean of the densities for the right and left sides of the brain. In the regions of interest (BST, arcopallium / PoA and PVN) the results are expressed as a ratio of this local density relative to a reference density. For each quail, the reference density was the mean density of Fos-ir cells within the MSt of that quail. This normalisation of the data allowed to reduce interindividual variability. These normalised data were used for the statistical analysis. Statistical analysis The entire experimental procedure including behavioural observations, quantification of Fos-ir cells and statistical analysis was performed blind with respect to the line identity of the observed quail and to the experimental treatment of the birds. Because the behavioural data were not normally distributed, they were analysed with nonparametric statistical tests, using Statview 5.0 (SAS Institute Inc., USA, ) and Excel 2000 (Microsoft Corporation) softwares. The effects of treatment (object vs control quail), line (LTI vs. STI quail) and interaction between treatment and line on the behavioural variables of interest (time spent in zone 1, time spent in zone 3, time spent eating and time spent pacing) were assessed using a 2x2 factorial analysis for unrelated 74

108 Figure 3: Box-plot diagrams illustrating (A) the time spent in two different zones of the cage and (B) the time spent pacing, in quail selected for long (LTI) or short (STI) tonic immobility duration during the first and the fifth presentations of a novel object (grey bars) and during a control situation (open bars). Zone 1 = area of the cage including the food trough and the site of object presentation. Zone 3 = area of the cage furthest away from the object. n = 12 for each bar. A Time (s) 300 First object presentation Control situation Object situation Fifth object presentation LTI STI LTI STI LTI STI LTI STI Zone 1 Zone 3 Zone 1 Zone 3 Treatment effect, p < 0.05 Other effects, NS B Treatment effect, p < 0.01 Other effects, NS All effects, NS Treatment effect, p < 0.05 Line effect, p < 0.05 Interaction, NS Time spent pacing (s) First object presentation Fifth object presentation 0 LTI STI Treatment effect, p < Other effects, NS LTI STI Treatment effect, p < Other effects, NS

109 Chapitre 2 datasets, with non-specific hypotheses (Meddis, 1984). Evolution of the variables between the first and fifth object presentations was analysed within each experimental group using Wilcoxon tests. Box-plot diagrams were used to illustrate the behavioural results. Values illustrated by a box-plot are the median, upper and lower quartiles, 10 th and 90 th percentiles. A two-way ANOVA with treatment and line as factors was carried out on the mean density of Fos-ir cells in the MSt (used as a reference density). In the regions of interest, statistical analyses were performed on the normalised densities of Fos-ir cells, using a two-way ANOVA for repeated measures (different rostrocaudal levels within a region) with treatment and line as factors. When the interaction between treatment and line was significant, the analysis was followed by a one-way ANOVA for repeated measures within each line. When the interaction between rostrocaudal level and line was significant, a two way ANOVA with line and treatment as factors was performed for each rostrocaudal level. Throughout the text and figures, the normalised density of Fos-ir cells was expressed as the mean and standard error of the mean within each experimental group. In all analyses, p<0.05 was considered as significant. Results Behaviour (Figure 3) Behaviour during the first object presentation There was an effect of treatment on the time spent in zone 1 (H = 5.24, p < 0.05), the time spent in zone 3 (H = 9.19, p < 0.01) and the time spent pacing (H = 16.17, p < 0.001). Object quail spent significantly less time in zone 1, more time in zone 3 and more time displaying pacing than control quail. There was neither a significant effect of line (H < 0.24 for each variable), nor a significant effect of the interaction between line and treatment on any variable of interest (H < 1.24 for each variable). Behaviour during the fifth object presentation There was an effect of treatment on the time spent in zone 3 (H = 4.55, p < 0.05) and on the time spent pacing (H = 14.32, p < 0.001): Object quail spent significantly more time in zone 3 and more time displaying pacing than control quail. There was no significant effect of treatment on the time spent in zone 1 (H = 1.97). There was a significant effect of line on the time spent in zone 3 (H = 4.51, p < 0.05): quail of the LTI line spent significantly more time in zone 3 than quail of the STI line. There was neither a 75

110 Figure 4: Photomicrographs illustrating the density of Fos-ir cells within the regions of interest. AA: anterior arcopallium; AI: intermediate arcopallium; BSTL: lateral part of the bed nucleus of the stria terminalis; PVN: paraventricular hypothalamic nucleus; TnA: nucleus taeniae of the amygdala BSTL PVN AA TnA AI

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