Allergie et toxiques Rôle des cellules dendritiques
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- Patrice Dumais
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1 Allergie et toxiques Rôle des cellules dendritiques Pr Saadia Kerdine-Römer MASTER 2 THERV C2 ANNÉE
2 Mécanismes des réactions allergiques Notion d haptène Formation d un complexe immunogène Phase de sensibilisation (présence de lymphocytes T mémoires de l haptène) Phase pathologique : réexposition au produit
3 La réponse immunitaire spécifique
4 Hypersensibilité retardée à médiation cellulaire Phase de sensibilisation
5 L eczéma de contact D après Saint-Mézard et al., Europ.J.Dermatol., 2004)
6 LA SYNAPSE IMMUNOLOGIQUE
7 HISTORIQUE DCs identifiées pour la première fois dans l épiderme Langerhans cells (1868) Présence dans d autres tissus en 1973 (Steinman and Cohn) Début 1990 : obtention in vitro de DCs humains à partir de cellules CD34+
8 SOUS-POPULATIONS DE DCs DC conventionnelles Cellules de Langerhans DCs interstitielles (DCs dermales) DCs plasmacytoïde
9 Principales voies de différenciation des DCs humaines
10 La DC dans tous ses états! Cellule dendritique non activée Qui s'y frotte, s'y pique... Cellule dendritique activée et hérisson Cellule dendritique (activation, présentation d'antigène)
11 Les molécules sensibilisantes 1. Les haptènes Interagissent directement avec des constituants cellulaires Molécules électrophiles (DNCB, aldéhyde hexyl cinnamique) Cas particuliers des métaux (nickel, chrome) 2. Les pro-haptènes Nécessitent d être transformés en métabolites réactifs pour se fixer aux protéines. Para-phenylènediamine, eugénol, alcool cinnamique 3. Les pré-haptènes Transformation par des mécanismes non enzymatiques d-limonène UV - Oxydation par l O 2 atm Dérivés radicalaires très réactifs (époxydes, hydroepoxydes )
12 LA VIE DE LA DC
13 Maturation des DCs Pathogène Inflammation Nécrose CMH-peptide (Classe I et II) Costimulation T (CD40 / B7) Cytokines DC immature DC mature Lymphocyte T naïf Tissu Migration Ganglion
14 FONCTIONS DE LA DC CD 1a + Mannose receptor +++ FcR +++ Antigen capture CD 1a - Mannose receptor +/- FcR +/- MHC II +/- CD 80, CD 86 CD 83 - CD 40 - MHC II +++ CD 80, CD Antigen presentation CD83 ++ CD IL-12 production E-cadhérin +++ CCR7 CCR6 ++ Migration E-cadhérin - CCR7 +++ CCR6 -
15 Régulation des fonctions CD4 Th1 et Th2 par les DCs et les pathogènes
16 En résumé.. Haptens (Nickel ) 1- Activation Immature dendritic cell epidermis Mature dendritic cell T lymphocyte 2- Migration 3- Presentation Lymph node
17 Signaux d activation de la DC
18 Les Toll Like Récepteurs Agoniste TLR MyD88-dépendant MyD88-indépendant Cytoplasme Noyau Gènes cibles
19 Une molécule chimique peut-elle jouer le rôle d un signal de danger?
20 Modèles in vitro de cellules dendritiques Cellules de Langerhans de la peau Cellules dendritiques murines obtenues à partir de progéniteurs hématopoïétiques Cellules dendritiques humaines -A partir de monocytes -A partir de progéniteurs CD34+
21 CD34 + PURIFICATION Cord blood cells Magnetic labelling CD34 CD34 Column CD34 + J 0 J 7 CD34 + GM-CSF = 200 U/ml TNF-a = 50 U/ml Flt-3L = 50 ng/ml idcs
22 Production de DCs à partir de cellules CD34+ de sang de cordon
23 CD14+ PURIFICATION Elutriation process for monocyte production Leukapheresis product 1 Counterflow monocytes 2 Centrifugal force 3 Elutriation boundary lymphocytes
24 Monocyte-derived cell generation day 0 day 5-7 GM-CSF Macrophage-like cell Monocyte GM-CSF IL-4 GM-CSF IL-4 TNF-a PGE2 Immature DC Mature DC GM-CSF IL-4 TGF-b Langerhans-like DC
25 Expression des marqueurs de maturation de la DC après traitement par les haptènes
26 Apparition de DCs CD83+/CCR7+ après traitement par les haptènes
27 Migration des DCs après traitement par les haptènes
28 Cinétique d expression de l IL-12p40 et de l IL-6 après traitement par le nickel
29 Effet du CoCl2 et du K2Cr2O7 sur la maturation de la DC
30 Questions? Certains haptènes sont capables de provoquer la maturation des DCs. Mécanisme direct ou indirect? Rôle des cytokines produites par la DC?
31 Hypothèse : Rôle des cytokines
32 Rôle du TNF-a
33 Et encore? Mécanisme direct pour le NiSO 4? DNCB induit la production de TNF-a, mécanisme? Signal de danger = MAPK, NF-kB
34 La voie des MAPKs
35 Les haptènes activent les MAPKs
36 Haptènes et signalisation dans la DC Inhibition des voies P38MAPK et JNK
37 Haptènes et signalisation dans la DC L inhibition de P38MAPK et de JNK altère la production de TNF-a après addition des haptènes.
38 Haptènes et signalisation dans la DC
39 Haptènes et signalisation dans la DC
40 MAPKs et haptènes NiSO 4 DNCB MAPKs (p38, JNK) MAPKs (p38, JNK) TNF-a CD86 CD83 HLA-DR CD40 IL-8, IL-6, IL-12p40 CCR7 CD86 IL-8 CCR7 CD83 Boislèveet al., J Invest Dermatol Boislève et al., Toxicology, 2005 Antonios et al., Toxicol. in vitro, 2009
41 MAPKs & haptènes in MoDCs
42 P38MAPK & haptènes in MoDCs
43 P38MAPK & haptènes in MoDCs
44 ERK & haptènes in MoDCs
45 ERK & haptènes in MoDCs
46 MAPKs & haptènes in MoDCs
47 Contrôle de la phosphorylation des MAPKs par les haptènes
48 MAPKS & DCs sous-populations
49 Les modèles pour mesurer le pouvoir sensibilisant Pr Saadia Kerdine-Römer MASTER 2 THERV C2 ANNÉE
50 PROBLEMES POSES PAR LES PHENOMENES ALLERGIQUES Allergènes forts à modérés : sont connus et/ou facilement identifiables Les allergènes qui nous intéressent sont les allergènes faibles : Atteinte d un nombre restreint d individu Individus soumis à des expositions multiples Mécanisme qui peut être complexe (interactions par exemple) Les mécanismes et acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeux, leurs interactions et l influence des molécules chimiques sur ces mécanismes ne sont pas encore tous bien connus.
51 Méthodes d évaluation Lignes directrices
52 LIGNES DIRECTRICES METHODOLOGIES EMEA : se réfère aux seules lignes directrices existantes CEE/OCDE OCDE 406 (17/07/92)/(CEE B 6 (30/07/96) : Sensibilisation par contact avec la peau, méthodes chez le cobaye (M&K ou Buehler) OCDE 429 (24/04/02)/CEE B42 (23/04/04) : LLNA mais exigences particulières - Souris CBA/Ca ou CBA/J, 8-12 semaines - Inclure témoins positifs et négatifs - Pool des nœuds lymphatiques - Analyse statistique (effet dose et comparaison chaque groupe traité/témoin) - Non utilisation de radio-isotope possible FDA et autres : pas de ligne directrice mentionnée, FDA se réfère à la bibliographie.
53 Méthode prédictive chez la souris Local Lymph Node Assay LLNA Exposition pour induction Application cutanée Site Oreille Nombre d exposition 3 Fréquence d exposition Rappel 24 heures aucun Paramètres mesurés Poids du ganglion drainant Prolifération des cellules gg Production d Ac
54 LLNA Mesure la phase de sensibilisation (test chez le cobaye : mesure la phase effectrice) Le critère est la phase de prolifération lymphocytaire Permet d avoir une évaluation quantitative Prolifération lymphocytaire en cpm Critères de positivité et d évaluation : Index de stimulation 3 Dose-réponse
55 METHODE
56 SI RESULTATS : LLNA SI 8 y = x R 2 = Concentration (%)
57 DETERMINATION DE LA EC3
58 RESULTATS : LLNA Groups Concentrations (%) HCA at 25% (Acetone/Olive oil) Cell count viable dead Viability (%) Amount of cells (x 10 6 cells) Cellularity index Number of nodes per group Disintegrations per minute per group (dpm) Disintegrations per minute per node (dpm) Stimulation index (SI) Increase in ear thickness (% between day 1 and day 6) EC3 value
59 LLNA EC3
60 LLNA
61 TABLEAU COMPARATIF
62 EXEMPLES DE DEUX SENSIBILISANTS
63 The 3Rs: Reduction, Refinement, Replacement Reduction alternatives methods for obtaining comparable levels of information from the use of fewer animals in scientific procedures, or for obtaining more information from the same number of animals. Refinement alternatives methods which alleviate or minimize potential pain, suffering and distress, and which enhance animal well-being. Replacement alternatives methods which permit a given purpose to be achieved without conducting experiments or other scientific procedures on animals.
64 Physiopathologie de l'allergie de contact Réaction d Hypersensibilité de type IV à médiation cellulaire Molécules responsables = haptènes 1 ère phase: sensibilisation cliniquement MUETTE Initiation de l allergie avec différenciation de lymphocytes T mémoires spécifiques Rôle primordial de la cellule dendritique (ex: cellule de Langerhans dans l'épiderme) 2 ème phase: révélation MANIFESTATION CLINIQUE Apparaît après un 2 ème contact avec le sensibilisant Intervention des LT mémoires Apparaît 48 à 72 heures après la réapplication du sensibilisant
65 Les Haptènes Petites molécules (PM < 1000 Da) pénétration dans l épiderme, facilitée par : Très réactives: pouvoir électrophile fixation sur les résidus nucléophiles des protéines. Non immunogènes - la petite taille - la lipophilie - la quantité appliquée - l altération de la peau (irritation, sécheresse cutanée ) formation d un complexe haptène-protéine immunogène pro-haptènes: molécules non réactives dont la métabolisation / transformation conduit à formation d'une molécule réactive.
66 Phase de sensibilisation : muette Phase de révélation : réaction inflammatoire Pénétration Métabolisme Liaison aux protéines Activation des cellules dendritiques 2 ème présentation aux LT spécifiques 1 ère présentation aux Lymphocytes T
67 Nouvelles stratégies d'évaluation de la sensibilisation cutanée in vitro
68 Autre modèle : Peptide reactivity assay
69 Le test du Direct Peptide Recative Assay (DPRA) DPRA : Direct Peptide Reactive Assay (P&G en coll. avec Pr. Lepoittevin) Test basé sur la RÉACTIVITÉ CHIMIQUE des molécules sur les protéines. o Liaison COVALENTE: liaison irréversible. Nu Cl NO 2 NO 2 1-chloro-2,4-dinitrobenzène (DNCB) substitution nucléophile Nu NO 2 NO 2 Nu: nucléophile = résidus cystéine, lysine, méthionine, tyrosine, histidine protéine modifiée = complexe immunogène o Liaison de COORDINATION : liaison réversible, instable. Nu Nu Nu Ni 2+ Nu Nu: histidine+++ avec Ni 2+
70 Le test du Direct Peptide Reactive Assay (DPRA) Principe du DPRA Détection par HPLC de l'interaction de la molécule avec des peptides riches en Lysine ou Cystéine Substance est incubée avec le peptide pendant 24h. Mesure = déplétion en peptide quantifiée par HPLC à 220 nm. Profil HPLC du peptide seul Profil HPLC de la substance seule Profil HPLC du mélange => diminution du pic du peptide car une partie est liée avec la substance
71 Classement de la réactivité du composé testé - non réactif : 6.4% de déplétion de chaque peptide - faiblement réactif : > 6.4% et 22.6% de déplétion - modérément réactif : > 22.6% et 42.5% de déplétion - fortement réactif : > 42.5% de déplétion Validation en cours du DPRA à l'ecvam Soumission à l'ecvam en 2009 Pré-validation a commencé en Mars 2010
72 Phase de sensibilisation : muette Phase de révélation : réaction inflammatoire DPRA Pénétration Métabolisme Liaison aux protéines Activation des cellules dendritiques h-clat GPMT, hript 2 ème présentation aux LT spécifiques 1 ère présentation aux Lymphocytes T LLNA
73 LA SYNAPSE IMMUNOLOGIQUE
74 h-clat : human Cell Line Activation Test (Kao & Shiseido) Test basé sur l'activation DES CELLULES DENDRITIQUES (DC) agents pathogènes: LPS, ADN bactérien cytokines: TNF-a, IL-1b haptènes DC immature CD 83 - MMR, Langerine +++ FcgRII +++ FONCTIONS DE LA DC Endocytose Apprêtement DC mature CD 83 + MMR, Langerine +/- FcgRII +/- Molécules de co-stimulation et d'adhésion : CD 80, CD 86 -, CD40- CD54- CMH II membranaire +/- Activation lymphocytaire Molécules de co-stimulation et d'adhésion : CD 80, CD 86 ++, CD CD54 ++ CMH II membranaire ++
75 Description du test h-clat - Utilisation d'une lignée cellulaire humaine monocytaire : THP1 cellules proches des DC qui répondent aux sensibilisants cutanés en exprimant des marqueurs d'activation telles que la molécule d'adhésion CD54 et la molécule de co-stimulation lymphocytaire CD86. - Incubation de 24h des cellules avec le produit à 8 concentrations Lecture par cytomètrie en flux de l'expression de CD54 et CD86 pour la concentration induisant 25% de mortalité rmq: besoin d'un minimum de stress pour induire l'activation des cellules si expression de CD86 150% et /ou CD %, la molécule est considérée sensibilisante
76 autres tests en cours de développement MUSST : Myeloid U937 Skin Sensitization Test (L'Oréal) Même principe que h-clat sur une autre lignée et d'autres marqueurs. KeratinoSens : Basé sur la voie de signalisation de stress Nrf 2 induite par la plupart des sensibilisants. Réalisée sur lignée de kératinocytes HaCat contenant un gène rapporteur de l'activation Nrf 2.
77 Nrf2 smaf A l état d homéostasie et en absence de stress Dégradation rapide de Nrf2 En cas de stress oxydant Keap1 La voie Nrf2/Keap1 Protéasome 26S Substances électrophiles, ERO et stress oxydant Nrf2 Keap1 Cytoplasme Dimère Keap1 Cytoplasme Dimère Keap1 Nrf2 smaf Noyau Nrf2 Keap1 Nrf2 Keap1 Noyau ARE *Nrf2 : Nuclear factor-erythroid 2 (NF-E2)-related factor 2 *Keap-1 : Kelch-like ECH-associated protein 1 *Maf : Musculoaponeurotic fibrosarcoma *ARE : Antioxydant Responsive Element ARE Gènes antioxydants et enzymes de phase II D après Watai Y et al., Genes to Cells
78
79 Merci
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