Polytech UEF1. BONCOMPAGNI Éric MCU - Univ. Nice Sophia Antipolis Site WEB : sites.unice.fr/eb. Outils moléculaires pour l analyse des génomes

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1 Polytech UEF1 BONCOMPAGNI Éric MCU - Univ. Nice Sophia Antipolis Site WEB : sites.unice.fr/eb Outils moléculaires pour l analyse des génomes

2 Pourquoi la génétique moléculaire? La génétique formelle renseigne sur: Le nombre de loci et d allèles relatifs à un caractère héréditaire Sur le caractère dominant/récessif d une mutation Information manquante: SEQUENCE Pour quoi code le gène? (nature du gène, fonction) Nature des mutations? Quel est son environnement génétique (autres gènes similaires?) Quel est son profil d expression? Connaissance de la fonction Applications : génie génétique

3 Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes Les RNA polymérases: -RNA Pol I : transcrit les gènes codant pour les ARN ribosomiaux 28, 18 et 5,8S -RNA Pol II : transcrit les gènes codant pour des protéines en ARNm -RNA Pol III : transcrit les gènes codant pour les ARNr 5S et les ARNt

4 Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes Structure d un gène eucaryote (Pol II) promoter Promoteur: séquences nécessaires à la régulation de la transcription du gène Upstream enhancers: régions régulatrices activatrices de transcription 5 et 3 UTR: régions transcrites mais non traduites (stabilité ARNm & régulation traduction) Introns: zones (dans régions codantes ou UTR) excisées après la transcription

5 Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes Expression d un gène Eucaryote (Pol II) www-class.unl.edu/biochem/gp2/m_biology/animation/gene/gene_a2.html promoter épissage traduction Protéine native maturation Protéine fonctionnelle

6 Rappels structure de l ADN Polymère orienté (5 vers 3 ) de 4 nucléotides (phosphates-désoxyribose-bases, A, T, G, C) S associe en double hélice via la complémentarité des bases Adénine-Thymine (2 liaisons H), Guanine-Cytosine (3 liaisons H) Présence de liaisons hydrogènes possibilité de séparer les deux brins sous l effet de la chaleur = DENATURATION Tm: t à laquelle les deux brins se séparent (composition en bases) Phénomène REVERSIBLE

7 Rappels structure de l ADN DENATURATION / RENATURATION Des molécules d ADN dénaturées peuvent se réapparier - Si la température est permissive - Si le principe de complémentarité des bases est respecté - toujours brins orientés en sens inverse Des brins ayant une complémentarité des bases imparfaite peuvent s apparier au delà d une certaine homologie (> 80%) Propriété utilisée pour détecter des séquences complémentaires à une séquences d intérêt (PCR/ Southern blot / northern blot)

8 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : but et principe But: Amplifier une séquence d ADN cible pour: 1- La visualiser sur gel d agarose 2- Détenir une quantité importante d une séquence d intérêt 3- Utiliser la séquence pour des clonages Principe: Utiliser une ADN polymérase qui grâce à l utilisation d amorces spécifiques et à une succession de cycles de polymérisation va amplifier un fragment d ADN recherché Voir animation:

9 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : éléments de départ - La séquence des extrémités est connue Mélange réactionnel: -ADN matrice -Amorces complémentaires des deux brins (5 vers3 ) -dntp: désoxyribonucléotides, unités élémentaires de l ADN -Taq DNA polymérase (polymérase résistant aux hautes températures) -Tampon réactionnel

10 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : Le premier cycle

11 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : Le deuxième cycle

12 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : Le troisième cycle

13 Détecter un gène: sa présence dans un génome La PCR : 25 à 40 cycles consécutifs Cycle n Cycle n + 1 Séquence recherchée Séquence recherchée Amplification de la séquence cible d un facteur 2 n (avec n= nombre de cycles). Exemple : Après 30 cycles, la séquence cible est 2 30, soit 10 9 x plus représentée

14 Détecter un gène: sa présence dans un génome But: Le Southern Blot: but et principe Edward M. Southern en 1975 Détecter la présence d une séquence d intérêt dans l ADN génomique extrait d un organisme Afin de : - Rechercher la présence d une séquence (d un gène) dans un génome - Visualiser des différences entre individus/espèces Principe: Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d intérêt repérable Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l ADN Séparer les fragments d ADN issus de l organisme étudié sur gel d agarose afin de les visualiser

15 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: prérequis ADN génomique Eucaryote est sous forme de chromosomes = fragments de très grande taille Afin d individualiser des régions du génome pour les distinguer, il faut fragmenter l ADN Puis, séparer les fragments les uns des autres pour les repérer Utilisation des ENZYMES DE RESTRICTION (UH1)

16 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: digestion enzymatique de l ADN

17 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: digestion enzymatique de l ADN 5 sortant 3 sortant Diapo Issue du cours de S. Chauvet

18 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: digestion enzymatique de l ADN Diapo Issue du cours de S. Chauvet

19 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: digestion enzymatique de l ADN ADN génomique Electrophorèse d ADN après digestion Diapo Issue du cours de S. Chauvet

20 Détecter un gène: sa présence dans un génome LeSBlot: Marquage du fragment d intérêt = SONDE Deux types de marquages : - radioactif (dctp*), détection par autoradiographie - non radioactif (digoxygénine), détection par anticorps couplés à une enzyme

21 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: Étapes 1- Extraction d ADN génomique 2- Digestion enzymatique de l ADN 3- Séparation des fragments sur gel d agarose 4- Transfert sur membrane de nylon 5- Marquage du fragment d ADN étudié (sonde) 6- Hybridation de la sonde sur la membrane 7- Détection du fragment marqué Animation:

22 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: Interprétations L enzyme de restriction utilisée ne coupe pas dans la zone de la sonde 1 bande si le gène est en une seule copie 2 bandes si le gène est en deux copies,. Etc. A Frgt étudié A ADN g 1 copie 1 Sonde A A 2 2 copies séparées A A A A A 2 copies en tandem 3

23 Détecter un gène: sa présence dans un génome Le Southern Blot: Interprétations L enzyme de restriction utilisée coupe dans la zone de la sonde 2 bandes si le gène est en une seule copie 4 bandes si le gène est en deux copies à des loci différents mais 3 bandes si les gène est en deux copies au même locus!!!! A A A 1 copie 1 A A A 2 2 copies séparées A A A A A A A 2 copies en tandem 3

24 Détecter un gène: sa présence dans un génome Comparaison PCR / Southern blot Les deux permettent de détecter la présence d une fragment d ADN dans un génome MAIS - La PCR ne donne pas le nombre de copies du fragment (gène) - La PCR ne donne pas d information sur l organisation dans le génome PAR CONTRE - La PCR est plus rapide (quelques heures contre 48H pour un Southern blot) - La PCR peut être effectuée en haut débit

25 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle But: northern blot: But et Principe Détecter la présence d un ARN messager d intérêt dans l ARN total issu d un tissus Afin de : - déterminer le profil d expression d un gène - visualiser des différences entre individus/espèces Principe: Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d intérêt repérable Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l ADN/ARN Et la capacité de l ADN de s hybrider avec l ARN pour former un duplex stable Séparer les ARNm issus de l organisme étudié sur gel d agarose afin de les visualiser

26 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle northern blot: Les étapes 1- Extraction de l ARN total Contamination ADNg ARNr 28s ARNr 18s Séparation des ARNm sur gel d agarose 4- Transfert sur membrane de nylon 5- Marquage du fragment d ADN étudié (sonde) 6- Hybridation de la sonde sur la membrane 7- Détection du fragment marqué ARNr 5,8s Contamination ADNg Signal Photo gel agarose coloré au BET Autoradiographie

27 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR: But et Principe But: Détecter la présence d un ARN messager d intérêt dans l ARN total issu d un tissus Afin de : - déterminer le profil d expression d un gène - visualiser des différences entre individus/espèces Principe: Utiliser une ADN polymérase ARN dépendante (réverse transcriptase) pour synthétiser le brin complémentaire des ARNm Puis amplifier le fragment obtenu par PCR Si un gène est exprimé dans le tissus testé : bande visible après migration Si le gène n est pas exprimé: pas de bande

28 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR: Les étapes 1- Reverse transcription à partir d ARN totaux extraits du tissus analysé à l aide d oligo dt Synthétise le brin ADN complémentaire 2- Amplification spécifique du gène étudié À l aide d amorces spécifique Par PCR 3- Migration sur gel d agarose pour visualisation PCR Migration sur gel d agarose

29 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative 1- Reverse transcription à partir d ARN totaux extraits du tissus analysé à l aide d oligo dt Synthétise le brin ADN complémentaire 2- Amplification spécifique du gène étudié À l aide d amorces spécifique Par PCR Utilisation d un agent intercalant (SYBR Green I) fluorescent 3- Quantification par mesure de la fluorescence

30 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative Quantification dans chaque échantillon évaluée par rapport au Ct (cycle threshold) Plus il y a de copies du fragment cible au début et moins il faudra de cycles pour atteindre le Ct Il faut environ copies d un fragment de PCR (de taille classique entre 100 et 1000 b) pour atteindre le seuil de détection : En partant de : copies initiales, le seuil de est atteint au bout de 14 cycles copies initiales, le même seuil de est atteint au bout de 25 cycles - 1 copie initiale, le même seuil de est atteint au bout de 33 cycles

31 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative Quantification absolue: on compare le Ct obtenu avec une Courbe standard issue d amplification d échantillons contenant une quantité connue de cible. Quantification relative: On compare le niveau d expression à celui d un ou plusieurs gènes de référence considérés comme exprimés de façon stable dans les différentes conditions biologiques. Le résultat est exprimé comme un ratio.

32 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative Ratio d expression dans une condition: 2 = simple CT (Ct gène de référence-ct gène d intérêt)

33 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative Ratio d expression comparé à une condition contrôle: 2 (Ct gène de référence-ct gène d intérêt) condition étudiée 2 (Ct gène de référence-ct gène d intérêt) condition contrôle = Ct (double delta Ct) Ratio Tumor/control : 2 ( ) R= = ( )

34 Détecter un gène: son expression spatio-temporelle RT-PCR quantitative NB: cette formule est applicable dans le cas ou l efficacité d amplification des deux couples d amorces est proche de ou est égale à 100%. Sinon on doit tenir compte des différences d efficacité d amplification et utiliser: X (Ct gène de référence-ct gène d intérêt) condition étudiée X (Ct gène de référence-ct gène d intérêt) condition contrôle OU X est calculée grâce à la pente de la courbe de Ct obtenue pour des dilution croissantes de matrice pour chaque couple d amorce. X= 1+E= 10 (-1/pente de la courbe)

35 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence But : Disposer à volonté et en quantité d une séquence d ADN d intérêt En la multipliant dans un système bactérien (Escherichia coli) Nécessite un vecteur de clonage qui comporte: 1- Une origine de réplication 2- Un gène de sélection 4- Un site multiple de clonage Exemple de vecteur de clonage MCS du pbluescript SK-

36 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: Les étapes 1- Digérer l ADN à cloner par une enzyme de restriction adéquate 2- Digérer le vecteur par la même enzyme 4- Mettre en présence le vecteur et fragment à cloner: appariement par complémentarité des bases 5- Ajouter une DNA ligase (referme la molécule d ADN) 6- Transformer une souche d E. coli 7- Sélectionner les bactéries transformées et les isoler Fragment d ADN obtenu facilement par extraction d ADN plasmidique à partir des bactéries transformée

37 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY Issue des connaissances acquises sur le processus d intégration du phage Lambda dans le chromosome d E. coli

38 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY

39 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY

40 Cloner des séquences d intérêt Le clonage d une séquence: la technologie GATEWAY Permet de s affranchit : 1- des enzymes de restriction 2- des faibles efficacités de clonage 3- élimine les problèmes de site internes d enzymes 4- contre sélection des clones vides : ccdb 5- multiples vecteurs de destination Inconvénients : 1- Les sites Att de recombinaison s intercalent entre les fragments clones: acides aminés supplémentaires en cas de fusions traductionnelles 2- Technologie brevetée: chère