VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON COMPARAISON DE DIFFERENTS LIQUIDES DE FLOTTATION EN COPROSCOPIE DES RUMINANTS THESE

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1 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n COMPARAISON DE DIFFERENTS LIQUIDES DE FLOTTATION EN COPROSCOPIE DES RUMINANTS THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 21 décembre 2012 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par RICHARD Fabienne Née le 30 décembre 2012 à Vichy(03)

2 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n COMPARAISON DE DIFFERENTS LIQUIDES DE FLOTTATION EN COPROSCOPIE CHEZ LES RUMINANTS THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 21 décembre pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par RICHARD Fabienne Née le 30 décembre à Vichy 1

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4 LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT Civilité Nom Prénom Unités pédagogiques Grade M. ALOGNINOUWA Théodore Unité pédagogique Pathologie du bétail Professeur M. ALVES-DE- OLIVEIRA Laurent Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Mme ARCANGIOLI Marie-Anne Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences M. ARTOIS Marc Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BARTHELEMY Anthony Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme BECKER Claire Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences M. BELLI Patrick Unité pédagogique Pathologie morphologique et Maître de conférences clinique des animaux de compagnie Contractuel Mme BELLUCO Sara Unité pédagogique Pathologie morphologique et Maître de conférences clinique des animaux de compagnie Mme BENAMOU-SMITH Agnès Unité pédagogique Equine Maître de conférences M. BENOIT Etienne Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur M. BERNY Philippe Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur Mme BONNET-GARIN Jeanne-Marie Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur Mme BOULOCHER Caroline Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. BOURDOISEAU Gilles Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BOURGOIN Gilles Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. BRUYERE Pierre Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie Maître de conférences de la reproduction Contractuel M. BUFF Samuel Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie Maître de conférences de la reproduction M. BURONFOSSE Thierry Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. CACHON Thibaut Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel M. CADORE Jean-Luc Unité pédagogique Pathologie médicale des Professeur animaux de compagnie Mme CALLAIT- Marie-Pierre Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences CARDINAL M. CAROZZO Claude Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. CHABANNE Luc Unité pédagogique Pathologie médicale des Professeur animaux de compagnie Mme CHALVET- Karine Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences MONFRAY M. COMMUN Loic Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Mme DE BOYER DES Alice Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences ROCHES Stagiaire Mme DELIGNETTE- Marie-Laure Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur MULLER M. DEMONT Pierre Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme DESJARDINS Isabelle Unité pédagogique Equine Maître de conférences PESSON Contractuel Mme DJELOUADJI Zorée Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme ESCRIOU Catherine Unité pédagogique Pathologie médicale des Maître de conférences M. FAU Didier animaux Unité pédagogique de compagnie Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme FOURNEL Corinne Unité pédagogique Pathologie morphologique et Professeur clinique des animaux de compagnie M. FRANCK Michel Unité pédagogique Gestion des élevages Professeur M. FREYBURGER Ludovic Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. FRIKHA Mohamed- Ridha Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences 3

5 M. GENEVOIS Jean-Pierre Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme GILOT-FROMONT Emmanuelle Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur M. GONTHIER Alain Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme GRAIN Françoise Unité pédagogique Gestion des élevages Professeur M. GRANCHER Denis Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Mme GREZEL Delphine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. GUERIN Pierre Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie Professeur de la reproduction Mme GUERIN-FAUBLEE Véronique Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme HUGONNARD Marine Unité pédagogique Pathologie médicale des Maître de conférences animaux de compagnie M. JUNOT Stéphane Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. KECK Gérard Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur M. KODJO Angeli Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAABERKI Maria-Halima Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Stagiaire M. LACHERETZ Antoine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAMBERT Véronique Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Mme LE GRAND Dominique Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences Mme LEBLOND Agnès Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LEFRANC-POHL Anne-Cécile Unité pédagogique Equine Maître de conférences M. Mme LEPAGE LOUZIER Olivier Vanessa Unité pédagogique Equine Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur Maître de conférences M. MARCHAL Thierry Unité pédagogique Pathologie morphologique et Professeur clinique des animaux de compagnie Mme MIALET Sylvie Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Inspecteur en santé publique vétérinaire Mme MICHAUD Audrey Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Stagiaire M. MOUNIER Luc Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences M. PEPIN Michel Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. PIN Didier Unité pédagogique Pathologie morphologique et Maître de conférences clinique des animaux de compagnie Mme PONCE Frédérique Unité pédagogique Pathologie médicale des Maître de conférences animaux de compagnie Mme PORTIER Karine Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme POUZOT-NEVORET Céline Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Stagiaire Mme PROUILLAC Caroline Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme REMY Denise Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur M. ROGER Thierry Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur M. M. SABATIER SAWAYA Philippe Serge Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme SEGARD Emilie Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme SERGENTET Delphine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme SONET Juliette Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel M. THIEBAULT Jean-Jacques Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. VIGUIER Eric Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme VIRIEUX- Dorothée Unité pédagogique Pathologie morphologique et Maître de conférences WATRELOT clinique des animaux de compagnie Contractuel M. ZENNER Lionel Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur 4

6 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur CHAYVIALLE Jean-Alain De la faculté de Médecine de Lyon Qui nous a fait l honneur de présider notre jury de thèse Hommages respectueux. A Monsieur le Professeur ZENNER Lionel De VetAgroSup, campus vétérinaire de Lyon Pour m avoir encadrée et conseillée dans la réalisation de cette thèse Sincères remerciements. A Madame le Docteur ARCANGIOLI Marie-Anne De VetAgroSup, campus vétérinaire de Lyon Pour son aide, ses conseils et pour avoir accepté de participer à notre jury de thèse. Sincères remerciements. A Madame POIREL Marie-Thérèse et aux membres de l unité de Parasitologie de VetAgroSUp Pour son aide lors des manipulations et de la lecture des lames, sa disponibilité et sa gentillesse. Sincères remerciements. Aux membres de l unité de Pathologie du Bétail de VetAgroSup Pour leur aide dans la réalisation de ce travail. Sincères remerciements. A Mademoiselle Jeanne CHANUDET Qui a conduit son travail de thèse en parallèle du mien, Aux laboratoires départementaux vétérinaires de France Pour leur réponse qui nous ont aidés dans l orientation de ce travail. Sincères remerciements. Aux éleveurs qui ont collaboré à la réalisation de ce travail Pour votre disponibilité, votre accueil. Sincères remerciements. 5

7 A mes parents, Pour votre amour, votre soutien et votre confiance, Pour avoir toujours été à l écoute de mes problèmes, Pour m avoir toujours encouragé, Je vous aime très fort A ma grand-mère Aline, Pour ton amour et ton soutien. A ma grand-mère Jeanne, Pour tout l amour dont tu as su nous entourer, Tu me manques chaque jour. A ma sœur Isabelle, Pour le soutien apporté, pour les passions partagées, Pour ce séjour à Paris et tous les moments partagés, Pour les fous rires, Merci. A ma sœur Séverine, Pour ton écoute, ta confiance, ta gentillesse, Pour ta petite étincelle de folie qui me rend toujours le sourire, Merci. A mon frère Régis, Pour tous les jeux partagés, Pour toujours m avoir ramené sur terre quand je me perdais en explications inutiles, Pour m avoir aidé et soutenu surtout dans la réalisation de cette thèse, Merci Et à Floriane, ma belle-sœur, Pour ta présence, ton écoute Pour toutes ces discussions, ces rires, Merci A mes nièces Lana, Maely et Louane, Mes petites princesses, Je vous aime très fort. A mon parrain Pierre Pour ton affection, ta présence et ton soutien toutes ces années, Merci A mes oncles et tantes, Pour votre affection, votre soutien, Merci A mes amis, Pour votre soutien, et tous les bons moments passés ensembles 6

8 TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES... 7 TABLE DES FIGURES TABLE DES TABLEAUX LISTE DES ABBREVIATIONS INTRODUCTION : Partie 1 : Revue des différentes méthodes de coprologie I. Les parasites gastro-intestinaux recherchés chez les ruminants adultes A. Les trématodes Fasciola hepatica a) Espèces cibles b) Cycle évolutif c) Excrétion des œufs d) Impact sur le diagnostic par coproscopie Calicophoron daubneyi a) Espèces cibles b) Cycle évolutif c) Excrétion des œufs d) Impact sur le diagnostic par coproscopie Dicrocoelium lanceolatum a) Espèces cibles b) Cycle évolutif c) Excrétion des œufs d) Impact sur le diagnostic par coproscopie

9 B. Les nématodes Importance et répartition géographique Etiologie a) Principales espèces b) Cycle Excrétion des œufs et coproscopie a) Excrétion b) Aspect des œufs C. Les protozoaires Les espèces d Eimeria Cycle Présentation en coproscopie II. Généralités sur la coprologie chez les ruminants A. Objectifs et indications La lutte antiparasitaire au sein des élevages Développement des antiparasitaires B. Matériel et prélèvement Matériel Prélèvements a) Réalisation du prélèvement b) Conservation du prélèvement C. Coprologie qualitative/ coprologie quantitative Appréciation qualitative Appréciation quantitative Appréciation semi-quantitative

10 III. Les méthodes de concentration A. La concentration par sédimentation Méthode a) Historique a) Variation sur le liquide de dilution b) Modification des temps de sédimentation c) Etape supplémentaire d) Modification du matériel Avantages Inconvénients B. La concentration diphasique Principes physico-chimiques impliqués Méthode a) Historique b) Variantes Avantages Inconvénients C. Concentration biologique Matériel Technique Indications D. Concentration par flottation Méthode a) Historique b) Variation sur l examen

11 c) Variation sur le temps Les liquides de flottation a) Le chlorure de sodium b) Solution de saccharose c) Nitrate de sodium d) Le sulfate de zinc e) Sulfate de magnésium f) Iodomercurate de potassium g) Chlorure de zinc associé au chlorure de sodium h) Chlorure de calcium i) Glycérine IV. Conclusion Partie 2 : Etude Expérimentale I. Introduction II. Matériel et méthodes A. Recueil de données et d échantillons Prise de contact a) Envoi des questionnaires b) Collecte des prélèvements Zones et période a) Période de collecte b) Zones Modalités de prélèvement B. Composition du questionnaire C. Réalisation des coproscopies

12 1. Choix des liquides et préparation Technique de coproscopie a) Protocole de flottation b) Réalisation de gamme Procédures expérimentales D. Analyses statistiques III. Résultats A. Etude des données obtenues par le questionnaire Liquide de flottation a) Quels liquides? b) Densité du liquide c) Tarif Interprétation de la coproscopie Temps de manipulation Mesures de protection a) Port de protection individuelle b) Mesures d évacuation des déchets B. Résultats des expériences Aspect qualitatif a) Aspect des œufs b) Facilité de lecture Analyse statistique a) Œufs de Calicophoron daubneyi b) Œufs de strongles digestifs c) Oocystes d Eimeria

13 3. Etude de la sensibilité des liquides a) Détection des éléments parasitaires les plus fréquents b) Détection des œufs de Dicrocoelium lanceolatum Comparaison de deux densités pour le sulfate de zinc a) Facilité de lecture b) Détection des éléments parasitaires IV. Discussion A. But du travail B. Influence du liquide de flottation sur le résultat Choix des liquides testés Comparaison des résultats a) Détection des œufs de trématodes b) Détection des œufs de strongles digestifs c) Les oocystes d Eimeria C. Biais Technique de flottation Homogénéité de la technique Echantillonnage Prélèvement CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE Annexe 1 : Protocole de sédimentation d après la méthode de Faust et Ingalls Annexe 2 : Protocole de Concentration diphasique selon la méthode de Bailenger Annexe 3 : Protocole de flottation : méthode historique de Bass et Fülleborn Annexe 4 : Protocole de flottation : Méthode de Janesko et Urbanyi

14 Annexe 5 : Protocole de flottation : méthode de Janesko-Urbanyi modifiée par Bailanger Annexe 6 : Protocole de régénération du Iodomercurate de potassium Annexe 7 : Protocole de flottation : méthode de Faust Annexe 8 : Questionnaire Annexe 9 : Préparation des liquides de flottation Annexe 10 : Protocole de coproscopie par flottation Annexe 11 : Protocole de comptage en lame de Mc Master

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16 TABLE DES FIGURES Figure 1 : Œufs de strongles digestifs Figure 2 : Cellule de Mac Master Figure 3 : Schéma de la répartition des phases dans le tube après concentration Figure 4 : Dispositif de Baermann Figure 5 : Carte des laboratoires ayant répondus Figure 6 : Répartition des différents liquides de flottation dans les LVD Figure 7 : Réponse concernant la densité du liquide Figure 8 : Tarif d'une coproscopie simple Figure 9 : Utilisation de protection individuelle par les laboratoires usant du iodomercurate de potassium Figure 10: Laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets Figure 11 : Œuf de Calicophoron daubneyi dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium Figure 12 : Œuf de strongles digestifs dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium Figure 13 : Oocystes d'eimeria dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium Figure 14 : Œuf de Dicrocoelium lanceolatum dans les différents liquides : a) Saccharose, b) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium Figure 15 : lame réalisée au sulfate de zinc Figure 16 : évolution de la cristallisation des lames de chlorure de sodium Figure 17 : présentation de l'estimation des oeufs de Calicophoron daubneyi Figure 18 : présentation des résultats des œufs de strongles digestifs Figure 19 : présentation des résultats des oocystes d Eimeria Figure 20 : observation de la dilution fécale dans les 2 solutions de sulfate de zinc

17 TABLE DES TABLEAUX Tableau 1: Détection des œufs de Calicophoron daubneyi 69 Tableau 2 : Détection des œufs de strongles digestifs 71 Tableau 3 : détection des oocystes d Eimeria 73 Tableau 4 : moyenne des comptages en lame de Mc Master 75 Tableau 5 : résultat des comptages sur lamelle totale 75 Tableau 6 : comptages des œufs de Dicrocoelium lanceolatum 76 Tableau 7: Comptage d'œufs de Dicrocoelium lanceolatum 77 Tableau 8 : Comparaison du comptage des éléments parasitaires selon la densité du sulfate de zinc 78 16

18 LISTE DES ABBREVIATIONS LVD : laboratoires vétérinaires départementaux OPG : œufs par gramme de fèces 17

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20 INTRODUCTION : Les affections parasitaires chez les ruminants ont deux impacts : un impact sur la santé et le bien être des animaux comme dans tout autre espèce un impact économique car un animal parasité va moins bien valoriser la ration qui lui est apportée, et des organes peuvent être saisis lors de l abattage. De ce fait, la prévention du parasitisme est un enjeu majeur pour les élevages. Elle repose le plus souvent sur la mise en place de traitement annuel ; cependant ces traitements restent vains si on ne commence pas par une prévention sanitaire, passant par une bonne gestion des pâtures et un bon diagnostic. En parasitologie, un outil diagnostique rapide et simple est la coproscopie. Il en existe diverses techniques qui seront évoquées en première partie de ce travail. Notre étude s intéressera particulièrement à la technique de coproscopie par flottation et aux différents liquides qui peuvent être utilisés dans ce but. L expérimentation permettra de déterminer la sensibilité des liquides de flottation utilisés pour la détection de différents éléments parasitaires dans les selles. Les parasites ayant un impact majeur en matière d économie et de santé chez les ruminants sont ceux du système digestif et de ses annexes, nous orienterons donc la recherche sur ces helminthes (à savoir les strongles digestifs, les douves, les trichures), et sur certains protozoaires, les coccidies. Chacun de ces parasites présente des particularités dans son cycle dont il est essentiel de tenir compte, tant dans l éventualité d un traitement que dans le raisonnement conduisant à la réalisation d un prélèvement en vue d un examen coproscopique. En parallèle de cette étude sur le diagnostic des parasitoses des ruminants adultes, un travail sur le diagnostic coproscopique des infestations par les protozoaires chez le veau a été réalisé par Jeanne CHANUDET qui s est intéressée aux colorations à réaliser pour faciliter ce diagnostic. 19

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22 Partie 1 : Revue des différentes méthodes de coprologie 21

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24 I. Les parasites gastro-intestinaux recherchés chez les ruminants adultes Les parasites du système digestif et de ses annexes, chez les ruminants, sont principalement des helminthes et des protozoaires. Parmi les helminthes, on distingue des parasites de la classe des trématodes et des nématodes. Nous allons dans cette première partie présenter de façon succincte ces parasites en nous concentrant surtout sur les particularités de leur cycle qui ont un impact sur leur diagnostic par coproscopie. A. Les trématodes Il existe trois principales maladies dues à une infestation par des trématodes chez les ruminants dans nos contrées : - la fasciolose, due à la présence et au développement de Fasciola hepatica dans le parenchyme hépatique puis dans les canaux biliaires des Ruminants. - La dicrocoeliose, due à la présence et au développement dans les canaux biliaires des Ruminants de Dicrocoelium lanceolatum - La paramphistomose, due à la présence et au développement de Calicophoron daubneyi dans le tube digestif des ruminants. 1. Fasciola hepatica a) Espèces cibles Il est important de noter que de nombreuses espèces sont affectées par Fasciola hepatica. Ce parasite affecte les Ruminants mais aussi les Equidés et les Suidés bien que ces deux dernières espèces soit moins sensibles (53). Il peut également contaminer l homme par la consommation de végétaux crus provenant de milieux contaminés. L expression clinique est plus fréquente chez l homme que chez les animaux (54). b) Cycle évolutif Ce parasite présente un cycle dixène avec pour hôte définitif les espèces cibles vues précédemment et pour hôte intermédiaire une limnée : Galba truncatula. Les particularités du cycle de ce parasite impliquent la présence d eau en nature dans l environnement pour que le cycle s accomplisse. La période prépatente de ce parasite est de 3 mois et la phase exogène dure également 3 mois. La présence de métacercaires dans le milieu extérieur est la plus importante au printemps et à 23

25 l automne. Les formes immatures, libérées après ingestion des métacercaires, migrent depuis l intestin jusqu au parenchyme hépatique puis dans les canaux biliaires. Ces considérations globales sur le cycle sont surtout importantes dans le cadre d une action préventive de la fasciolose (9) mais ont aussi un impact important sur le diagnostic par coproscopie. c) Excrétion des œufs Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur, l infestation (période prépatente). dans les fèces, environ 3 mois après Ils sont de grande taille (80µm*140µm), operculés, ovoïdes et bruns à jaunâtres (7). La ponte est peu abondante dans cette espèce et surtout intermittente dans le temps. d) Impact sur le diagnostic par coproscopie La longueur de la période prépatente fait que la présence des œufs dans les bouses sera souvent tardive par rapport à un épisode clinique. En effet le plus souvent ce sont les stades immatures qui sont à l origine de la majorité des lésions, pendant leur migration depuis l intestin vers le parenchyme hépatique. Ceci et le caractère faible et intermittent de la ponte tend à envisager le diagnostic coproscopique essentiellement dans les cas de fasciolose chronique ou pour connaître le statut de l élevage dans le cadre d un traitement global. En effet la présence d un œuf sur une coproscopie conduit à considérer l infestation du cheptel dans sa globalité. La dernière chose à prendre en considération est le fait que les œufs sont lourds et gros, ce qui influence la réalisation de l examen dans les diverses techniques de coproscopie. 2. Calicophoron daubneyi a) Espèces cibles Ce parasite a pour cible les différentes espèces de ruminants domestiques et sauvages. b) Cycle évolutif Ce parasite présente un cycle dixène proche de celui de Fasciola hepatica tant par la nécessité de l eau, la similarité des périodes prépatente et exogène et enfin par l hôte intermédiaire qui est là encore un mollusque amphibie. 24

26 Dans ce cas, les formes immatures se développent dans la sous-muqueuse de l intestin grêle ou de la caillette puis elles effectuent une migration rétrograde jusqu au rumen ou au réseau lors du passage à la forme adulte. Les adultes peuvent survivre plusieurs années dans les préestomacs (2, 20). c) Excrétion des œufs Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur l infestation (période prépatente). dans les fèces environ 3 mois après Les œufs sont également de grande taille (entre 120 et 180µm), operculés, avec une paroi fine et lisse mais sont plutôt gris à verdâtres (7). Contrairement à Fasciola, les adultes de Calicophoron daubneyi sont prolifiques, bien que la ponte reste variable dans le temps. d) Impact sur le diagnostic par coproscopie La coproscopie n aura pas d intérêt lors de forme aiguë puisque comme dans le cas de Fasciola ce sont les formes immatures qui sont à l origine des lésions. Mais cet examen reste intéressant pour connaître le statut de l élevage dans le cadre d un traitement global. En effet la capacité de survie des adultes dans les pré-estomacs permet une accumulation d année en année des parasites en l absence de traitement sans que des cas cliniques apparaissent nécessairement. Un suivi par coproscopie de l élevage permettra donc de déterminer la nécessité d un traitement. Par ailleurs la ponte étant plus importante, la sensibilité de cet examen est plus élevée pour Calicophoron daubneyi que pour Fasciola hepatica. Il est cependant important de conduire un examen précis afin de ne pas risquer de confondre les œufs de ces 2 parasites très proches. 3. Dicrocoelium lanceolatum a) Espèces cibles Ce parasite peut infester tous les ruminants, et principalement les ovins (bien qu on observe de plus en plus de cas chez les bovins), et les autres herbivores. b) Cycle évolutif Ce parasite présente un cycle trixène avec pour hôte définitif les espèces cibles vu précédemment et 2 hôtes intermédiaires : un escargot xérophile et la fourmi. Ce cycle n a pas besoin d eau, et l on retrouve d ailleurs plus souvent ce parasite en zone sèche. 25

27 La période prépatente de ce parasite est de 2 mois et la phase exogène dure de 4 à 6 mois. Les adultes peuvent survivre 2 à 5 ans chez les ovins. Les formes cliniques sont rares et plutôt chroniques avec des symptômes peu spécifiques, la présence de lésions en elle-même peut avoir un impact économique puisque les éleveurs sont sanctionnés sur le paiement des animaux en cas de lésions hépatiques découvertes à l abattoir. c) Excrétion des œufs Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur l infestation (période prépatente). dans les fèces environ 2 mois après Ils sont de petite taille par rapport aux précédents trématodes étudiés (40µm) mais cela reste des œufs lourds. Ils sont foncés et operculés et 2 masses germinatives rondes sont souvent distinguables au microscope (7) d) Impact sur le diagnostic par coproscopie L impact clinique de ce parasite se faisant plutôt sur le long terme avec accumulation des parasites, il a été défini un seuil d infestation au-delà duquel il est considéré comme essentiel de traiter. Ce seuil est à 300 opg pour les ovins et 30 à 40 opg pour les bovins (3). Cependant l excrétion est très variable dans le temps et parfois faible, ce qui diminue la sensibilité diagnostique de cet examen. On conseille donc de réaliser des prélèvements sur plusieurs animaux, étalés dans le temps (49). B. Les nématodes Les principaux nématodes ayant un impact pathogène au niveau digestif chez les ruminants adultes appartiennent à l ordre des Strongylida. 1. Importance et répartition géographique Les strongles sont des parasites que l on retrouve dans chaque espèce de ruminants dés le moment où les animaux pâturent. Ils affectent également les ruminants sauvages. Enfin ils sont cosmopolites. Leur impact sur la santé des animaux est surtout présent chez les jeunes animaux (première ou deuxième saison de pâture), les animaux plus âgés développant avec le temps une certaine immunité face à ces parasites (11). L impact économique est cependant majeur, les 26

28 strongyloses entraînent en effet des pertes de production importantes en qualité et quantité tant dans les cheptels allaitants que laitiers (22). 2. Etiologie a) Principales espèces Parmi cet ordre, nous avons 5 espèces d importance majeure avec des localisations différentes au sein du tube digestif. - Parasites de la caillette : Le principal parasite de la caillette est chez les bovins Ostertagia ostertagi, chez les ovins et caprins Teladorsagia circumcincta. Chez les bovins, Ostertagia ostertagi représente environ 90% des strongles digestifs. - Parasites de l intestin grêle : Le genre des Trichostrongylus est d importance majeure chez les ovins et caprins et est non négligeable chez les bovins. Nous noterons qu il est cependant plus commun chez les bovins de trouver des strongles des genres Cooperia et Nematodirus au niveau de l intestin grêle. - Gros intestin : Au niveau du gros intestin, chez toutes les espèces de ruminants on retrouve essentiellement les strongles du genre Oesophagostomum. b) Cycle Ce sont des parasites monoxènes dont l hôte définitif est un ruminant, ils peuvent éventuellement avoir un hôte facultatif qui assure leur conservation dans le milieu extérieur. Le parasite connaît 5 stades évolutifs entre l œuf et l adulte. L excrétion des œufs se fait dans les fèces, une fois dans le milieu extérieur, il connait 3 évolutions et c est le troisième stade larvaire qui est infestant. La phase exogène est variable selon les conditions climatiques (exemple pour Ostertagia : 3 à 10 jours à 22 C, 3 à 4 semaines à C).Une fois ingérée la larve 3 évolue au stade larve 4. Pour certains parasites (Ostertagia et Oesophagostumum) on peut à ce stade avoir une phase d hypobiose, dans la paroi de l organe cible, suite aux réactions immunitaires de l hôte qui bloquent les parasite au stade larvaire 4(11, 27). Sinon ils continuent leur évolution en stade 5 puis adulte. La période prépatente sans hypobiose est de 3 semaines en moyenne. 27

29 Dans le cas d ostertagiose, les larves entrées en hypobiose ont tendance à émerger de façon massive en fin d hiver ou début de printemps ce qui entraîne de nombreuses lésions et une présentation clinique dénommée Ostartagiose de type Excrétion des œufs et coproscopie a) Excrétion Il faut noter que l excrétion des œufs est limitée par l immunité de l hôte (4, 11, 21), ce sont donc les jeunes animaux qui excréteront le plus d œufs et seront à l origine des pâtures les plus contaminées. L excrétion est maximale chez les animaux primo-infestés et quasi nulle chez les animaux plus âgés. Au printemps, les animaux se contaminent grâce aux larves 3 résiduelles dans la pâture (qui sont d autant plus présentes que le climat hivernal a été humide sans être trop froid), et réinfestent peu à peu la pâture, ce qui conduit à une contamination plus importante des pâtures et donc des animaux. Cela conduit à une excrétion maximale d œufs par les animaux en été. b) Aspect des œufs Nous n avons pas particulièrement insisté sur les particularités des différentes espèces de strongles digestifs essentiellement en raison de l impossibilité de les distinguer à partir des œufs. En effet les œufs de strongles ont tous le même aspect excepté ceux du genre Nematodirus (fig.1). Nématodirus Autres strongles Figure 1 : Œufs de strongles digestifs 28

30 Leur contenu est granuleux, gris et leur taille va de 40µm à 100µm. Pour les différencier il convient de réaliser une coproculture (34). Pour la coproscopie, on réalisera de préférence un examen individuel et en saison de pâture. C. Les protozoaires Les protozoaires chez les ruminants occasionnent une clinique aiguë plutôt chez les jeunes (veaux, agneaux, chevreaux) (12, 43, 53), parmi les pathogènes on rencontre dans ce cas différents genres : Eimeria, Cryptosporidium et Giardia. Cet aspect de la parasitologie des ruminants chez les jeunes et de son diagnostic est abordé par Jeanne CHANUDET dans un travail de thèse conduit en parallèle de celui-ci. Cependant la présence d Eimeria chez les ruminants adultes, et particulièrement chez des bovins de plus de 6 mois, peut conduire à une spoliation importante responsable d un mauvais aspect général des individus (poil piqué, croissance faible) et ce genre de protozoaires est facile à distinguer en coproscopie simple. 1. Les espèces d Eimeria Il existe 13 espèces d Eimeria chez les bovins dont 3 sont pathogènes : - Eimeria bovis : localisée au niveau du colon et du rectum - Eimeria zuernii : même localisation - Eimeria alabamensis : localisée au niveau de l intestin grêle. 2. Cycle Les Eimeria sont des parasites monoxènes, ils se développent dans les cellules épithéliales des organes digestifs. Les oocystes sont les formes excrétées qui vont subir dans le milieu extérieur une sporulation si les conditions de température, d humidité et d oxygène sont favorables, ils présentent alors 4 sporocystes renfermant chacun 2 sporozoïtes. 3. Présentation en coproscopie Les oocystes font quelques µm. Si l examen est réalisé rapidement après le prélèvement, les oocystes ne seront pas sporulés, ils apparaîtront alors avec une morula. La taille et la forme peut permettre l identification de l espèce. Si les conditions de sporulation ont été rencontrées, la disposition des sporocystes et le nombre de sporogonies sont également des éléments de diagnose. 29

31 II. Généralités sur la coprologie chez les ruminants La coproscopie est la méthode de base du diagnostic en parasitologie. Elle permet de détecter (et éventuellement compter) les éléments parasitaires excrétés dans les fèces par les parasites du tube digestif. A. Objectifs et indications 1. La lutte antiparasitaire au sein des élevages Comme nous l avons signalé en introduction le parasitisme des ruminants et la lutte antiparasitaire associée ont un impact majeur en terme économique dans les élevages (8,11, 55) : Un animal parasité ne profite pas de sa ration alimentaire complètement. On a, par ce biais, un gaspillage d aliment puisque pour atteindre un même poids l animal parasité aura besoin de plus d aliment. Au niveau clinique, selon l âge et le degré d infestation de l individu, on verra une expression clinique aiguë à chronique qui entraînera une altération de l état général de l animal. Les soins vétérinaires nécessaires au soutien puis au rétablissement de l animal ont une importance mais l impact majeur va être le temps et l aliment nécessaire à la remise en état de l animal. Dans certains cas on arrive à une perte de l animal car les traitements de support et antiparasitaire sont trop tardifs. Le traitement antiparasitaire est globalement dans les élevages une constante du budget puisque les traitements sont effectués de façon systématique pour les strongyloses digestives, pour la fasciolose et de plus en plus souvent pour la paramphistomose. On a une perte de revenu lors de la vente de l animal puisqu il sera de poids moindre que ce que l on pourrait espérer. Certaines infestations parasitaires se traduisent par une altération des organes et entraînent une saisie lors de l abattage (exemple de Fasciola Hepatica dont les lésions entraînent une saisie du foie) avec diminution du paiement de l animal dans certains cas. Dans les publications la coproscopie est souvent indiquée dans le cadre d une médecine individuelle. C est un examen rapide que le vétérinaire peut réaliser au sein de son cabinet s il possède un minimum de matériel et d expérience. En matière de médecine de population de nombreuses techniques alternatives ont été développées au cours des années notamment en élevage laitier où il existe une sérologie sur lait de tank qui permet d évaluer le statut parasitaire d un troupeau. 30

32 La coproscopie peut être un examen de groupe mais il faut être particulièrement logique dans le choix des groupes lors des prélèvements : communauté de pâture, âge. Il est aussi intéressant de raisonner le moment du prélèvement lors d un suivi (animaux en cours de pâture pour les strongyloses, réflexion par rapport aux périodes prépatentes pour les trématodoses). La réalisation de ces analyses de suivi peut permettre de dresser un plan parasitaire de l élevage et en particulier de pouvoir détecter des pâtures à parasitisme plus ou moins prononcé et assurer ainsi une rotation raisonnée des pâturages qui est une part importante de la lutte antiparasitaire (35,40). 2. Développement des antiparasitaires Dans un premier temps, nous pouvons noter que les études conduites pour connaître l efficacité d une molécule antiparasitaire font appel à la coproscopie pour connaitre l infestation des animaux avant traitement et estimer l efficacité du traitement après (25). La coproscopie est en effet dans ce cas la technique la plus intéressante bien que les résultats puissent être difficiles à bien interpréter dans le cas des trématodoses en raison de la longueur de la période prépatente comme l ont souligné Grimshaw et al (30). Il existe des techniques diagnostiques reposant sur les réactions immunitaires développées par l hôte lors d une interaction avec les parasites (51). Il est possible de réaliser des sérologies sur sang ou dans le cas d élevage laitier sur lait de tank. Bien que le coût d une sérologie ne soit pas un facteur limitant face à la coproscopie, elle ne présente aucun intérêt pour contrôler l efficacité d un traitement puisque la réponse immunitaire peut mettre jusqu à plusieurs mois avant de diminuer suite à une infestation. On peut de plus souligner l importance d un contrôle du statut parasitaire des élevages face à la systématisation des traitements et au développement de résistance des parasites face à certains antiparasitaires dans une période où le nombre de molécules autorisées dans le traitement d animaux de production est de plus en plus faible, et où le public souhaite consommer des produits les plus naturels possibles ce qui, dans le cas des viandes, implique le moins de traitement possible (55). B. Matériel et prélèvement 1. Matériel La coproscopie nécessite un matériel assez simple ce qui en fait un examen réalisable en cabinet (1, 7). Il faut le matériel nécessaire au mélange et à la dilution des fèces : mortier, pilon, verres à pied, pipettes, agitateur, tubes à essai et tamis. 31

33 Il est intéressant de posséder une centrifugeuse pour accélérer les manipulations et il faut enfin le matériel pour l observation : un microscope avec objectif *4, *10, *100 et objectif à immersion ainsi que les lames et lamelles associées. Selon la technique d examen envisagée, du matériel supplémentaire pourra être nécessaire. (Voir paragraphe C.) 2. Prélèvements a) Réalisation du prélèvement Les prélèvements doivent être réalisés dans le rectum des animaux ou juste après l émission pour limiter les contaminations par le milieu extérieur (nématodes libres ou larves de diptère par exemple). Ils sont la plupart du temps obtenus lors d une palpation transrectale et donc conditionnés dans le gant de fouille retourné et noué. Selon le but de l examen coproscopique, on peut envisager de réaliser un prélèvement à partir de bouses de différents animaux. Il faut alors veiller à réaliser des lots selon la recherche envisagé : animaux de même âge, de statut semblable et de pâture commune. b) Conservation du prélèvement Comme nous l avons dit précédemment le prélèvement est souvent conditionné dans un gant en plastique. Ceci peut être suffisant si l examen est réalisé au sein du cabinet vétérinaire. Cependant s il est nécessaire de faire parvenir le prélèvement à un laboratoire, il est nécessaire de prendre quelques précautions. Il faut veiller à ce que l emballage contenant le prélèvement ne soit pas imbibé par le prélèvement, pour cela on peut soit reconditionner le prélèvement dans un tube fermé hermétiquement (vissé de préférence) soit entourer le prélèvement de film plastique. Il faut par ailleurs veiller à ce que les commémoratifs, accompagnants tout prélèvement lors d envoi dans un laboratoire, ne soient en aucun cas détériorés avant l arrivée au laboratoire. Il est important que l examen soit réalisé dans un temps limité après l émission du prélèvement afin de limiter l évolution des éléments parasitaires, qui rendrait leur diagnose plus difficile, mais dans le cas où l examen serait différé il est essentiel de préserver le prélèvement dans des conditions optimales. Il existe des modes de conservation qui permettent de ralentir l évolution des éléments parasitaires. Il est possible de conserver le prélèvement à température basse, ainsi la réfrigération ralentit l évolution de façon réversible (2 C à 8 C) et permet de conserver un prélèvement jusqu à une semaine. 32

34 On peut également congeler les prélèvements mais cela peut détruire des éléments parasitaires ou enfin on peut les diluer dans de l eau formolée à 8% (7). C. Coprologie qualitative/ coprologie quantitative La présence d œufs de parasites au sein d un prélèvement de fèces n est pas interprétable sans les données cliniques et épidémiologiques associées. Nous avons vu dans la première partie de ce travail que tous les parasites n excrètent pas de façon similaire, ainsi la présence d un seul œuf de Fasciola sur une lame examinée au microscope n a pas la même signification que la présence d un seul œuf de strongles. Les strongles présentent effectivement une excrétion proliférative et sont des parasites cosmopolites. Il est donc usuel de rencontrer des œufs de strongles sur un examen coprologique. Ceci conduit à réfléchir sur la façon d interpréter la présence d œufs dans un prélèvement et sur la façon d apprécier leur nombre (1, 11). 1. Appréciation qualitative Si l on réalise une coproscopie qualitative, on cherche simplement la présence des œufs de parasites en identifiant au mieux le parasite. Cette technique est considérée comme suffisante dans le cas de Fasciola Hepatica et de Dicrocoelium lanceolatum (3, 8). Ces parasites présentant une excrétion limitée et intermittente, la présence d un œuf est synonyme d infestation de l animal et, souvent, on étend cette infestation à l élevage. En ce qui concerne les œufs de strongles et les oocystes de coccidies rencontrés, il est difficile de se fier à une simple appréciation qualitative puisque ce sont des parasites cosmopolites et prolifératifs. Parallèlement, l absence d œuf au niveau de l examen n est dans le cas d aucun parasite la preuve de l absence d infestation. En effet si l on considère la production de bouse d un bovin par jour, le fait que l on effectue un prélèvement ponctuel de quelques grammes et que sur ce prélèvement environ 5g soient examinés (après homogénéisation), on peut envisager ne pas avoir d œufs dans l échantillon examiné malgré une infestation de l animal. L appréciation qualitative présente un intérêt limité du point de vue de son interprétation finale c est pourquoi elle est souvent associée à une technique quantitative ou au moins semiquantitative que nous allons maintenant envisager. 33

35 2. Appréciation quantitative La technique de coproscopie quantitative permet de déterminer le nombre d œufs présents par gramme de fèces d un prélèvement. Elle fait appel à un matériel supplémentaire : la cellule de Mac Master et repose sur une dilution systématique des matières fécales (celle à 1/15 ème étant la plus fréquemment rencontrée) (32). 7.5cm 1.8cm 1cm Epaisseur sous chambre : 0.15cm Volume sous grille : 0.15ml Volume chambre : 0.5ml Chambre Figure 2 : Cellule de Mac Master Elle est le plus souvent employée avec une concentration par flottation. On dépose 0.5ml du liquide obtenu par la dilution des selles dans le liquide de flottation dans chaque chambre de la cellule (fig.2). Les œufs viennent se coller sous le verre supérieur et sont alors dénombrés dans chaque colonne de chaque chambre. Le nombre d œufs par gramme de fèces est donné par la formule : [(n1+n2)/2]*100 n1 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 1 n2 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 2 Cette méthode s avère intéressante pour évaluer les infestations d autant plus que certains auteurs dont Mage et Dorchies (41) pensent qu il est possible de mettre en relation le nombre d œufs comptés avec le niveau d infestation (bien qu aucune relation mathématique n ait été proposée). Cependant pour des œufs de faible niveau d excrétion, la lecture en Mac Master limite la détection des œufs. 34

36 Il faut noter qu il est important de procéder en parallèle à l examen d une lame obtenu par flottation car en cas d absence d œufs sur la cellule de Mac Master, il est intéressant de réaliser un contrôle sur la lame simple puisque le seuil de dénombrement est de 50opg avec cette dilution. C est donc une méthode qui demande du temps et un matériel supplémentaire. Une bonne alternative entre les 2 méthodes exposées consiste en la réalisation d un examen semiquantitatif. 3. Appréciation semi-quantitative Un comptage est réalisé sur la lame simple de coproscopie après concentration et permet d évaluer l importance de l infestation. A cet effet on définit des seuils de comptage qui permettent l évaluation de l infestation avec une estimation non par gramme mais par 5 grammes de fèces (quantité généralement utilisée dans la méthode de concentration). Cette estimation s avère souvent suffisante en parasitologie des ruminants. A titre d exemple nous allons ici exposer les seuils utilisés au sein de l unité de Parasitologie du campus vétérinaire de VetAgroSup : Présence : moins de 10 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. + : de 10 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. ++ : de 100 à 200 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. +++ : de 200 à 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces : plus de 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. Maintenant que nous avons vu le matériel nécessaire à l examen et les méthodes nécessaires à l interprétation, nous allons détailler les différents procédés visant à concentrer les éléments parasitaires. III. Les méthodes de concentration. L examen direct d une goutte de fèces diluée peut permettre dans certains cas l observation d éléments parasitaires. Cependant comme nous l avons vu dans le paragraphe sur la méthode qualitative de coproscopie, cet examen ne se fait que sur une portion réduite de fèces qui contient, en plus des éléments parasitaires, de nombreux autres composants. Dans le cas des ruminants, nous avons notamment à faire face à de nombreux débris végétaux digérés ou non (pollens, spores, herbe), en plus de cellules mortes. Il s avère donc nécessaire, afin d avoir une bonne sensibilité de cet examen, de concentrer les éléments parasitaires afin de pouvoir en observer un nombre maximum au microscope. 35

37 Différentes méthodes de concentration ont été proposées au cours des années, et nous allons voir dans cette partie ces diverses techniques et leurs intérêts. Les méthodes de concentration font appel à deux phénomènes physico-chimiques : la densité relative des éléments parasitaires par rapport à celle du réactif de dilution, l équilibre hydrophile-lipophile des éléments parasitaires lesquels tendent à flotter lorsque leur lipophilie prédomine ou à sédimenter si c est leur hydrophilie qui est dominante. Ces deux forces sont des caractères spécifiques pour chaque parasite mais elles peuvent être modifiées par les caractéristiques du liquide (ph) ou par une réaction entre les groupements de la surface des œufs et les constituants du réactif (métaux lourds). Les méthodes exposées par la suite peuvent être combinées pour éliminer un plus grand nombre de débris. A. La concentration par sédimentation Le principe est de réaliser une dilution des selles dans une solution aqueuse de densité faible. Les parasites se déposent, les particules alimentaires non digérées et les cadavres microbiens surnagent ou restent en suspension. La concentration est facilitée par l hydrophilie des éléments parasitaires. Cette technique présente l avantage de partir d une masse volumineuse de selle et d être simple avec l utilisation d un matériel basique. Cependant c est une technique longue, demandant de nombreuses manipulations. 1. Méthode a) Historique La méthode de sédimentation est basée sur la méthode décrite par Faust et Ingalls en 1946 citée par Bailenger (5) qui utilise une solution aqueuse de glycérine à 0.5% comme diluant, elle est décrite dans l annexe 1. Cette méthode est déjà en elle-même une variante de la méthode primitive de Faust qui utilisait simplement de l eau du robinet comme liquide de dilution. Les manipulations sont longues puisqu il faut laisser 3 fois le temps de sédimenter qui est de 30 à 45 minutes. 36

38 De nombreuses autres variantes de cette méthode ont été proposées impliquant soit un autre liquide de dilution soit un protocole différent. Ces différentes variantes sont proposées dans le but d améliorer la détection des œufs de parasites. a) Variation sur le liquide de dilution En 1947, Jahnes et Hodges proposent une variante de la méthode sédimentation de Faust et Ingalls (5), basée sur la constatation que l alcool éthylique à 10% offre un rendement deux fois supérieur à l eau glycérinée dans la détection des œufs de Schistosome. Les œufs ne sont pas endommagés par le liquide et peuvent éclore par addition de quelques gouttes d eau au sédiment. En 1956, Euzéby propose une variante en utilisant de l eau additionnée de détergent (teepol, 1%) pour réaliser la sédimentation (cité par Bailenger (1)). b) Modification des temps de sédimentation Happish et Boray diminuent les temps de manipulation par l utilisation d une trompe à vide pour éliminer le surnageant après chaque sédimentation (31). Chaque sédimentation dure 3 minutes. Barrody et Most (cité par Bailenger (5)) décrivent cette technique avec pour réactif de l eau ordinaire à 40 C. Les centrifugations se font pendant 30 secondes à 1500 tours/mn. Après chaque centrifugation, le surnageant est rejeté et remplacé par le réactif, les centrifugations sont répétées jusqu à ce que le surnageant soit clair (généralement 2 à 3 centrifugations suffisent). c) Etape supplémentaire Boray et Pearson (cité par Happish et Boray (31)) proposent après une sédimentation avec de l eau d ajouter une étape de coloration au bleu de méthylène du culot avant l examen au microscope. Cette coloration permet de faire ressortir les œufs non colorés parmi les débris (colorés) d) Modification du matériel Nous pouvons noter parmi les variantes utilisant un matériel différent celle de Happich et Boray (31) qui fait intervenir une trompe à eau pour évacuer le surnageant par vide ou la technique de sédimentation en longs tubes de verre de Grégoire et al (citée par Raynaud (46)). Cette méthode fait intervenir une colonne de verre de 2.10m de hauteur et de 1cm de diamètre intérieur qui est fixée verticalement par trois supports à pinces à un mur, un robinet de verre rectiligne (ouverture de 3mm, rétréci à 2mm à son ouverture inférieure). Les deux composants sont réunis par un joint de caoutchouc. 37

39 2. Avantages L avantage de cette technique est de demander un matériel simple et peu coûteux ce qui en fait un examen facile à réaliser en pratique courante. La plupart des techniques ont été adaptées à la réalisation de coproscopie quantitative. Chaque variante est faite en vue d améliorer la technique. La variante de Jahnes et Hodges a été adopté pour ces résultats favorables dans la recherche des œufs de schistosomes. Le raccourcissement des temps de sédimentation permet à ces techniques d être plus facilement utilisable en routine. Le rajout de l étape de coloration permet une distinction plus facile des œufs, en particulier ceux de Fasciola hepatica et de Calicophoron daubneyi. L utilisation d un matériel précis permet d améliorer la sensibilité et la rentabilité de la technique de sédimentation, qui en général ne permet de détecter que 50% des éléments parasitaires (46). Les variantes de Happish et Boray et de Grégoire et coll sont décrites comme spécifiques du diagnostic des infestations par Fasciola hepatica par Raynaud (46). 3. Inconvénients Le principal inconvénient de la méthode de base était le temps de manipulation très long qui différait donc le résultat de l analyse. Cependant les modifications apportées qui permettent de diminuer les temps de manipulation ont tendance à faire appel à un matériel supplémentaire. Dans le cas de la sédimentation en tube long, le principal obstacle à sa réalisation est la complexité du dispositif (inutilisé de nos jours pour ce qui concerne la méthode de Grégoire). Enfin cette méthode efficace pour concentrer les gros œufs se révèle de faible rendement dans la concentration des œufs de nématodes et de protozoaires. B. La concentration diphasique 1. Principes physico-chimiques impliqués La concentration diphasique fait intervenir 3 phénomènes dont l essentiel est la mise en présence de 2 phases non miscibles (aqueuse et lipophile) ce qui crée, pour chacune des particules fécales (parasites, débris alimentaires, microbes), un coefficient de partage leur permettant de s orienter en fonction de leur équilibre hydrophile-lipophile. Il en résulte une élimination des éléments à prédominance lipophile et par conséquent, une concentration des particules à tendance hydrophile. 38

40 Le second principe envisagé est l action dissolvante des réactifs qui supprime certains des constituants fécaux. Enfin comme dans toutes les méthodes de concentration envisagées, la densité des œufs joue également un rôle important pour connaître la phase intéressante. Cette méthode permet donc de concentrer les éléments parasitaires dans le culot de sédimentation en favorisant leur hydrophilie. On a ainsi pu étudier l influence de facteurs susceptibles d accroître cette hydrophilie, ce qui a autorisé des modifications raisonnées de la méthode de base. 2. Méthode a) Historique La méthode de base évoquant le principe de concentration diphasique a été mis au point par Telemann en 1908 (cité par Bailenger (5)). Il s agit de délayer les selles avec un mélange composé à parties égales d éther et d acide chlorhydrique concentré puis à tamiser l émulsion fécale et enfin à centrifuger. Les éléments parasitaires sont concentrés dans le sédiment. La méthode de base présente de nombreux désagréments : les vapeurs lors de la manipulation d acide chlorhydrique concentré, les altérations que le réactif fait subir aux kystes et à certains œufs. Le protocole présenté en annexe 2 dérive de la méthode de Telemann et a été proposé par Bailenger (5). Figure 3 : Schéma de la répartition des phases dans le tube après concentration La récupération du sédiment nécessite l élimination des 3 phases supérieures (fig.3). Le cas de la seconde phase est particulier. Ce sont les débris qui forment un anneau qu il faut décoller de la paroi pour l éliminer. 39

41 b) Variantes En 1955, Blagg et coll (cité par Bailenger (5)) ont proposé une méthode reposant de sur l emploi du réactif de Sapero et Lawless avec l éther. Ce réactif est composé à partir d une solution de lugol fraiche et d une solution nommée solution M.F. (composée de teinture de merthiolate, de formol et de glycérine). De nombreux autres protocoles ont été proposés avec des réactifs différents mais des manipulations semblables. Nous nous attarderons cependant sur la technique proposée par Bailenger (5). Des expériences ont été conduites déterminant l influence du ph sur la concentration des œufs. Il a ainsi été déterminé que la valeur de ph permettant la meilleure concentration d éléments parasitaires (même si elle n est pas la meilleure pour tous les œufs) est 5 ce qui a conduit au protocole proposé en annexe 2 avec pour réactif un tampon acéto-acétique ajusté à ph 5 et l éther. 3. Avantages Globalement, les auteurs décrivent les méthodes de concentration diphasique comme simples et rapides (26). Cette technique est également favorable à la concentration des œufs lourds et les variantes proposées ont cherché à augmenter la concentration des œufs (recherche d un ph optimal par Bailenger) ou à se séparer de composants potentiellement toxiques comme l acide chlorhydrique utilisé dans la méthode de Telemann et dont les vapeurs sont déconseillées tant pour le technicien que pour le matériel de laboratoire. 4. Inconvénients Cette méthode est peu intéressante dans la recherche d oocystes de protozoaires ou de petits œufs d helminthes soit par une mauvaise concentration soit par la difficulté à repérer ces éléments parasitaires de petite taille au sein du sédiment. Excepté la variante proposée par Bailenger, toutes les autres méthodes polyvalentes proposent d utiliser des réactifs qui, sans pour autant faciliter la concentration des éléments parasitaires, peuvent présenter un potentiel nocif : solution M.F. pour Blagg et coll, formol pour Ritchie. C. Concentration biologique La méthode de concentration biologique s intéresse non aux œufs des helminthes mais à leurs larves. En effet il est possible dans le cas où l examen coproscopique a été fortement différé du prélèvement ou dans de mauvaises conditions de conservation du prélèvement, que les œufs de Nématodes se soient développés et que seules les larves demeurent dans le prélèvement (10). 40

42 Ces larves ne sont pas concentrées en général par les méthodes habituelles, ce qui a conduit à développer une technique de concentration des larves reposant sur leur hygrotropisme et leur thermotropisme. 1. Matériel entonnoir Tamis + gaze tubulure Verre à pied Figure 4 : Dispositif de Baermann Le matériel utilisé est simple et courant (fig.4) : entonnoir, tamis, gaze, verre à pied. Le liquide utilisé est de l eau tiède. 2. Technique On dispose une gaze dans un tamis métallique que l on dépose sur un entonnoir relié à une tubulure en caoutchouc. On verse de l eau tiède jusqu à atteindre un niveau correspondant à la partie inférieure du tamis. On dépose les selles dans la gaze. On laisse décanter pendant 1 à 2 heures puis on examine le filtrat. 3. Indications Cette technique est utilisée dans la détection des larves de strongles respiratoires chez les bovins (42). 41

43 Elle est, comme nous l avons dit en introduction, indiquée en cas d absence d œufs de strongles sur une lame obtenue par les autres techniques de concentration et dans le cas d un problème de conservation du prélèvement. Cette technique est globalement à réaliser en complément de la coproscopie simple afin de confirmer les résultats obtenus. En cas de mauvaise conservation d un prélèvement, la réalisation d une concentration biologique permet d augmenter de façon importante la sensibilité de l examen coproscopique. D. Concentration par flottation Cette technique consiste à effectuer une dilution fécale avec un liquide plus dense que les éléments parasitaires qui surnagent alors. Leur concentration dans le film superficiel est conditionnée par leur densité inférieure à celle du réactif ainsi que par une prédominance de leur lipophilie. C est une technique simple, qui demande peu de matériel et qui permet une réalisation d examens en série. Cependant cette méthode est contre-indiquée dans le cas de selles riches en lipides ou huiles minérales et si l on recherche des larves ou des kystes de protozoaires car ils seraient déformés par les réactifs qui sont hypertoniques. Il existe de nombreuses techniques autant que de réactifs qui seront présentées dans ce paragraphe. 1. Méthode a) Historique La méthode historique est la méthode de Bass et Fülleborn présentée en annexe 3 (cité par Bailenger (5)). Le liquide de flottation utilisé est une solution de chlorure de sodium saturée de densité L examen se réalise après un repos de 45 minutes environ et nécessite de réaliser un prélèvement de la surface de la dilution fécale. Cette méthode est, d après Bailenger, indiquée pour la recherche d œufs d Ankylostomes et d ascaris. Des études conduites chez les ruminants en particulier ont montré la sensibilité de ce liquide dans la détection des oocystes de coccidies et des œufs de strongles digestifs. Toutefois l utilisation de ce liquide est déclarée contre-indiquée en cas de suspicion de fasciolose. De nombreuses variantes de cette technique ont été mises au point au cours des années tant par la modification du liquide utilisé que par la méthode de lecture associée. La diversité des 42

44 liquides utilisés ne reflète pas tant la faiblesse diagnostique des liquides que la diversité des méthodes laboratoires. En effet bien que certains liquides comme nous le verrons plus tard semblent avoir des possibilités diagnostiques plus élevées que d autres, le choix du liquide de flottation utilisé est souvent le reflet d une habitude et d une facilité de travail. b) Variation sur l examen Une première variante de la méthode précédente est proposée par Willis en 1921 (cité par Bailenger (5)). L auteur propose effectivement de profiter de l adhérence des éléments parasitaires au verre pour les collecter. Concrètement il verse la dilution fécale, après tamisage, dans un tube cylindrique jusqu à obtention d un ménisque. A la surface du tube il dépose une lame (ou lamelle) dégraissée qui sera ensuite examinée au microscope. Il est également possible d envisager un examen quantitatif en lame de Mac Master. c) Variation sur le temps Le temps de réalisation de cette méthode peut être raccourci en considérant deux points : - On considère qu en pratique 20 minutes suffisent pour que les œufs remontent dans la suspension - Il est possible de réaliser une centrifugation après le tamisage à 2000 tours/minute pendant 3 minutes. (Nous présentons ici une moyenne des données proposées par les diverses variantes de la méthode de base) Après avoir vu la méthode de base et les variations possibles concernant le temps de manipulation et l examen au microscope, nous allons maintenant voir l élément à l origine de la majorité des variantes proposées : les différents liquides de flottation. 2. Les liquides de flottation L utilisation de différents liquides au cours des années par les équipes ayant travaillé sur cette problématique tient principalement du fait qu aucun liquide ne s est avéré efficace à 100% dans la détection de tous les types d œufs, ou ne présente pas une facilité de lecture justifiant un recours général à ce liquide. Au-delà du réactif de base qui peut changer d une méthode de flottation à l autre, la densité peut également être plus ou moins élevée et détermine le protocole de fabrication du liquide de flottation. 43

45 a) Le chlorure de sodium C est le liquide utilisé de façon historique. C est une solution de chlorure de sodium à saturation (25%, densité = 1.20). Avantages : C est un liquide très facile à réaliser, il est sans impact pour le technicien comme pour l environnement et son coût est faible. Inconvénients : La densité n est pas suffisante pour faire remonter les œufs de Trématodes (46). Puisque la densité atteinte est celle de la solution à saturation il n y a que peu de façon d améliorer la sensibilité de l examen avec ce liquide. b) Solution de saccharose Cette solution a été utilisée par Levine et al (39) dans une étude comparant différentes méthodes de concentration, mais comparant également la solution de saccharose à celle de chlorure de sodium. Les méthodes utilisant une solution de saccharose nous proposent plusieurs proportions pour la composition de la solution et donc plusieurs densités. La densité de la solution de saccharose peut varier entre 1.20 et Il est également possible que la solution ne soit pas une dilution simple de saccharose et fasse intervenir de nombreux autres composants comme le formaldéhyde, du nitrate de sodium comme dans les solutions utilisées dans l étude menée par Cringoli et al (18) Avantages : C est également un liquide très facile à réaliser, il est sans impact pour le technicien comme pour l environnement. Il présente une excellente sensibilité dans la détection des oocystes de coccidies (28, 48) et des œufs de strongles digestifs (39). Par rapport à la solution saturée de chlorure de sodium, Levine et al (39) ne notent pas de différence de la sensibilité, mais la lecture est facilitée par une moindre cristallisation du saccharose par rapport au chlorure de sodium Inconvénients : Dans l étude menée en 2004, Cringoli ne note aucune remontée d œufs de Dicrocoelium avec les solutions de saccharose utilisées (18). 44

46 Par ailleurs face à des solutions concentrées en saccharose se pose le problème de la durée de conservation et de la façon de conserver le liquide afin d éviter toute contamination. c) Nitrate de sodium La solution de nitrate de sodium en tant que liquide de flottation a été utilisée dans plusieurs études. La solution peut être pure ou comporter d autre composant comme une association au saccharose ou au thiosulfate de sodium (18) Raynaud utilise une solution à saturation présentant une densité de 1.40 (46). Avantages : Présentant une densité élevée, le nitrate de sodium présente l avantage de faire remonter les œufs de nématodes (39) et de Dicrocoelium lanceolatum (18). Inconvénients : La flottation avec le nitrate de sodium fait remonter avec les œufs de nombreux débris qui rendent difficile la lecture de la lame de flottation et donc l interprétation de l examen. d) Le sulfate de zinc Ce liquide est pour la première fois utilisé par Faust en 1938 (cité par Bailenger (5)), la technique fait appel à de nombreuses centrifugations pour éliminer un maximum de débris végétaux avant l ajout de la solution dense. Il utilise une solution de densité 1,18. Le protocole précis est présenté en annexe 7. Par la suite les méthodes utilisant le sulfate de Zinc ont utilisé des solutions de densité plus élevée de 1.35 à En 2003, Courouble a réalisé des coproscopie avec une solution de sulfate de Zinc à densité 1.44 dont l obtention demande plusieurs jours (17). Avantages : C est un liquide peu toxique, de coût moyen. Il présente une excellente sensibilité pour les œufs de nématodes et les oocystes de coccidies (46) et est considéré comme un bon liquide dans la détection des œufs de Fasciola hepatica à une densité proche de 1.40 par Gibson (29). Cette particularité quant à la détection des œufs de trématodes est améliorée par la possibilité d augmenter la densité du liquide. 45

47 Inconvénients : La densité utilisée dans la méthode de base permet une bonne lecture mais rend inutile l utilisation de ce liquide dans la détection d œufs de Trématodes. Cet inconvénient est facilement détourné puisqu il est facile de réaliser une solution de densité supérieure. L utilisation du sulfate de Zinc conduit à considérer son élimination. Ce n est pas un liquide aussi neutre que le chlorure de sodium ou le saccharose, il convient donc de prendre des mesures afin de limiter son élimination dans l environnement. Son inconvénient majeur provient de la difficulté de lecture des lames de flottation. Ce liquide entraîne la formation de nombreuses bulles lorsqu il est utilisé à forte densité, ce qui demande un effort supplémentaire de concentration au technicien. Il entraîne également au cours de la flottation la remontée de nombreux débris qui vont contribuer à la difficulté de lecture de la lame (46) e) Sulfate de magnésium La solution de sulfate de magnésium en flottation a été utilisée par Dunn en 1955 (cité par Raynaud (46)) à saturation (densité = 1.30). La densité de ce liquide peut varier selon les proportions utilisées de 1.20 à 1.30 au maximum. Avantages : Tout comme le sulfate de Zinc, le sulfate de Magnésium accroît la sensibilité de détection des œufs de Nématodes et des oocystes de coccidies par rapport aux solutions de chlorure de sodium et de saccharose comme souligné par Bello (6) Il présente également l avantage de ne pas cristalliser comme le chlorure de sodium et d être de manipulation plus simple que le saccharose. Inconvénients : A sa densité la plus élevée, il est décrit comme donnant une lame illisible par l abondance de débris par Raynaud (46). De plus bien que rendant des résultats positifs dans la remontée d œufs de Dicrocoelium lanceolatum, ce liquide est considéré comme le moins sensible de ceux conduisant à l obtention d un résultat positif par Cringoli et al (18) 46

48 f) Iodomercurate de potassium La solution d iodomercurate de potassium a été proposée en premier lieu par Janesko et Urbanyi en 1931(cité par Bailenger (5)). Sa composition utilise de l iodure de potassium et de l iodure de mercure d après les proportions proposées en annexe 4 ce qui permet d atteindre une densité de 1.44 Bailenger a ensuite diminué la concentration de la solution en mercure dans la variante qu il propose en 1977(annexe 5) (5). Il démontre en 1977 que la combinaison des atomes de mercure à certaines molécules de la surface des œufs permet une modification de leur caractère physico-chimique et donc de leur comportement lors de concentration. Cela favorise ainsi leur présence en dehors de la phase aqueuse. Il considère de plus que l intervention du mercure revêt un aspect qualitatif ce qui permet d envisager l abaissement de la concentration en mercure du liquide. Avantages : La densité élevée du iodomercurate de potassium a dans un premier temps été mise en avant pour sa sensibilité dans la détection des œufs de trématodes et particulièrement pour les œufs de Fasciola hepatica par Rayanud (45) et de Dicrocoelium lanceolatum (18, 49). Il permet de plus une bonne lisibilité de la lame puisqu il limite la remontée des débris végétaux et ne produit que peu de bulles. Il est rapporté qu il est tout aussi précis en ce qui concerne les œufs de nématodes et les oocystes de protozoaires, et efficace pour toute espèce ; ce qui en fait une méthode polyvalente (45). Inconvénients : Il est important de remarquer que ce liquide entraîne une déformation des œufs qui peut rendre la lecture difficile. Raynaud en 1970 signale ainsi la difficulté à distinguer les œufs de Fasciola Hepatica de ceux de Calicophoron daubneyi éventuels et n écarte cet inconvénient que par la considération de l absence d infestation des ruminants par des paramphistomidés en Europe du Nord dans les années 70. Cependant de nos jours l infestation par des ruminants par les trématodes du genre Calicophoron daubneyi est de plus en plus importante (2, 19) ce qui rend la question de la distinction des œufs majeure. Un autre point important et limitant l usage de ce liquide est son coût. Malgré la technique de régénération du liquide proposée par Raynaud et Brunault (47) (voir en annexe 6), les constituants sont des produits coûteux qu il peut être difficile de se procurer particulièrement dans le cas d un laboratoire qui ne réaliserait qu un nombre modéré de coproscopie par an. 47

49 Il est de plus essentiel de noter que les composants de ce liquide sont des toxiques et que leur acquisition et leur manipulation est soumise à une réglementation de plus en plus précise (qui sera mieux précisée dans la seconde partie de ce travail). Les 2 composants du liquide (iodure de potassium et iodure de mercure II) sont catégorisés dans la réglementation comme toxiques (36). Ce liquide présente une potentielle action caustique et allergique, le technicien peut avoir des fissures au niveau des doigts, qui peuvent s accompagner d œdèmes, de prurit et d une sensation de chaleur. Tous ces inconvénients tendent à orienter les laboratoires vers l abandon de ce liquide au profit du recours à des liquides plus neutres de sensibilité proche. g) Chlorure de zinc associé au chlorure de sodium Les publications faisant mention de l utilisation de chlorure de zinc l associent au chlorure de sodium (18, 22, 46). La solution se compose alors d une solution de chlorure de zinc saturée et d une solution de chlorure de sodium saturée avec un rapport des volumes 1/3. L étude de la sensibilité de cette solution chez les ruminants a été réalisée par Cringoli et coll en 2004 et montre que, bien que permettant la remontée d œufs de Nématodes, c est la solution la moins sensible des 14 testées dans ce cadre. Par ailleurs elle ne permet pas la remontée d œufs de Trématodes. Globalement cette solution n apparaît pas comme intéressante au niveau de la coproscopie des ruminants. Son efficacité a cependant été démontrée dans la détection des Ascaris chez les porcs. h) Chlorure de calcium L utilisation de chlorure de Calcium en liquide de flottation a été réalisée avec des solutions de densités diverses (entre 1.05 et 1.20). Ce liquide a globalement toujours été utilisé dans des expérimentations et jamais vraiment en routine. (29) i) Glycérine La glycérine utilisée en solution de flottation a été testée à différentes densités en fonction du parasite recherché. Cependant ce liquide a globalement été abandonné d une part à cause de son coût et d autre part en raison de la déformation des œufs, en particulier ceux de Fasciola hepatica (Vadja 1922 cité par Gibson (29)) 48

50 IV. Conclusion La recherche coproscopique chez les ruminants fait face à de nombreuses particularités : - La petite quantité de fèces examinée - L importance des débris cellulosiques dans les selles - La consistance variable selon les espèces. - La variabilité des éléments parasitaires. Ces particularités sont à l origine de la variété des techniques de coproscopie (33) : - La concentration par sédimentation qui concentre les éléments parasitaires dans le culot mais demande du temps et n est pas toujours très facile de lecture. - La concentration diphasique qui malgré une bonne sensibilité est compliquée chez les ruminants vu l abondance de débris chez les ruminants. - La concentration par flottation qui est rapide mais demande un choix précis du liquide dense utilisé pour avoir la meilleure sensibilité de l examen. Cette dernière technique est majoritairement utilisée tant dans diverses études que dans les laboratoires et va donc être celle utilisée durant les expériences réalisées pour ce travail. 49

51 50

52 Partie 2 : Etude Expérimentale 51

53 52

54 I. Introduction Le but de ce travail était de comparer différents liquides de flottation couramment utilisés en coproscopie des ruminants. Dans un premier temps de ce travail, nous avons cherché à connaître les liquides utilisés dans les différents laboratoires départementaux de France au travers d un questionnaire (Annexe 8). Par la suite, nous avons conduit nos propres expérimentations, en choisissant les liquides d après les réponses reçues au questionnaire, afin de tester la sensibilité diagnostique des différents liquides. II. Matériel et méthodes A. Recueil de données et d échantillons 1. Prise de contact Dans le cadre de notre travail, nous avons eu l occasion de communiquer avec les laboratoires départementaux dans le cadre de notre enquête, avec des vétérinaires ruraux et des éleveurs dans le but de récolter des échantillons de selles. a) Envoi des questionnaires Les laboratoires ont été contactés dans un premier temps par des mails. Le courrier avait pour but d expliquer la raison de notre enquête, à savoir le but de notre thèse, et les différentes méthodes pour répondre et nous faire parvenir les questionnaires en retour. Nous avons proposé aux laboratoires un document format Word à remplir et à nous retourner par mail ou fax, et un questionnaire en ligne. En cas de non réponse à notre premier mail, nous avons relancé les laboratoires par un nouveau mail puis par fax. b) Collecte des prélèvements Nous sommes entrés en contact avec des éleveurs ainsi qu avec des vétérinaires en leur demandant de bien vouloir nous faire suivre tout prélèvement qui pourrait s avérer intéressant dans le cadre de notre étude. Nous avons également effectué la même démarche auprès de l unité de Pathologie du Bétail du campus vétérinaire de VetAgroSup. 53

55 2. Zones et période a) Période de collecte Nous avons contacté les laboratoires départementaux avec le questionnaire définitif durant l été Une première prise de contact avait eu lieu dans le printemps auprès de quelques laboratoires pour sonder leur disponibilité et le moyen le plus simple de les contacter. Les prélèvements ont quant à eux été effectués durant la période d expérimentation à savoir septembre et octobre b) Zones Nous avons contacté l ensemble des laboratoires vétérinaires départementaux de métropole dans la mesure où nous avions pu au moins avoir leur numéro de téléphone. Les prélèvements ont été faits auprès d élevages laitiers et allaitants dans les départements du Rhône, de la Loire et de l Allier. 3. Modalités de prélèvement Dans le cadre de ce travail, les prélèvements de selles ont été effectués auprès de ruminants adultes (plus d un an), de l espèce bovine majoritairement. Nous nous sommes rendus dans les fermes et avons prélevé les bouses au sein du rectum sur les animaux attachés. Comme un autre travail était conduit sur les fèces des jeunes ruminants, nous avons en parallèle effectué les prélèvements sur les jeunes et les adultes. Les prélèvements ont été conservés au froid dans des pots. Les analyses ont été effectuées dans les 3 à 4 jours suivant le prélèvement. B. Composition du questionnaire Le questionnaire avait pour but d obtenir un maximum de renseignements sur les techniques des laboratoires départementaux en matière de coproscopie chez les ruminants mais aussi en matière de coloration dans le cadre de la recherche des protozoaires dans ces espèces. Le questionnaire était donc composé de 2 parties dans lesquelles des questions ouvertes ou à choix multiple permettaient de connaitre les méthodes des laboratoires. Le questionnaire est présenté en annexe 8. Une des premières questions était de connaître le numéro du département répondant afin de vérifier l unicité des réponses et d éviter toute relance inutile. Par la suite cette information n a plus été utilisée puisque l anonymat avait été garanti aux laboratoires et que cette information n apportait rien à l analyse des réponses. 54

56 C. Réalisation des coproscopies 1. Choix des liquides et préparation Les liquides ont été choisis en rapport avec l enquête menée auprès des LVD et d après ce qui ressortait de la bibliographie. Nous avons utilisés 5 liquides pour tester tous les prélèvements : Le chlorure de sodium, à une densité de Le saccharose, à une densité de 1.26 Le sulfate de magnésium à une densité de 1.27 Le sulfate de zinc, à une densité de 1.36 L iodomerdurate de potassium, à une densité de 1.44 Les modalités de composition des liquides sont données en annexe 9. Une solution de sulfate de zinc à une densité de 1.44 a été utilisée sur quelques échantillons. Nous avons préparé tous les liquides exceptés l iodomercurate de potassium qui a été préparé dans l unité de Pathologie du Bétail qui nous l a fourni et le sulfate de zinc à densité de 1.44 qui nous a été fourni par le Dr. COUROUBLE. 2. Technique de coproscopie a) Protocole de flottation Le protocole a été standardisé pour toutes les coproscopies et utilisé de manière identique avec chaque liquide de flottation testé (voir annexe 10). Pour réaliser une flottation simple, 5 g de matières fécales sont pesées (toujours avec la même balance) et déposées dans un verre à pied en plastique. Vingt ml du liquide de flottation sont ajoutés puis on délaye le tout jusqu à obtenir une dilution homogène. Cette dilution est ensuite passée sur un tamis métallique doublé d une gaze, nous versons ensuite 15ml de la dilution fécale dans un tube à centrifugation jusqu à obtention d un ménisque au dessus du tube. Une lamelle est déposée sur le tube. Nous réalisons une centrifugation des tubes à 1500tours/minute pendant 5 minutes (2 par 2, toujours dans la même centrifugeuse) La lamelle est déposée sur une lame porte-objet et lue dans sa totalité. 55

57 b) Réalisation de gamme Dans un second temps, nous avons cherché à connaître la sensibilité des différents liquides. Pour cela nous avons réalisé des gammes de dilution. Nous avons sélectionné un échantillon pour la présence d un élément parasitaire à chercher, nous avons réalisé sur ce prélèvement un comptage en lame de McMaster (méthode présentée en annexe 11). La variation principale du protocole pour réaliser un comptage en lame de McMaster est la quantité de liquide de flottation utilisée : 70ml sont utilisés pour diluer les 5g de matières fécales. Après tamisage de la dilution fécale, 1ml est prélevé pour la lame de McMaster et 15ml sont prélevés pour remplir un tube à centrifugation afin de réaliser une lame de contrôle en flottation. La dilution utilisée pour l obtention de la solution fécale et la lecture des 2 chambres de la lame de McMaster permet le comptage selon la formule : [(n1+n2)/2]*100 n1 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 1 n2 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 2 Si un œuf est absent de la lame de McMaster mais présent en lame de contrôle, le comptage de cet œuf est déclaré inférieur à 50opg (et non absent simplement) Nous avons réalisé le comptage sur 5 lames afin d avoir une moyenne du nombre d œufs présents par gramme de fèces. Les dilutions ont été réalisées entre l échantillon choisi et de la bouse «saine». Les fèces dites saines ont subi 2 examens coproscopiques : un dans le sulfate de zinc et un dans l iodomercurate de potassium. Les fèces ont été déclarées saines en cas d absence sur les lames de flottation de tout élément parasitaire dans les 2 liquides utilisés Dans chaque cas, la gamme est répétée 5 fois en utilisant les 5 liquides choisis et nous avons réalisé 2 dilutions : - au demi : nous avons délayé 75g de l échantillon dans 75 g de fèces saines. - au 10 ème : Nous avons délayé 15g de l échantillon dans 135g de fèces saines. 56

58 3. Procédures expérimentales Nous avons réalisé les coproscopies avec les 5 liquides différents sur 34 échantillons. L interprétation de l examen a été réalisée de façon semi-quantitative suite à la lecture totale de la lamelle. Nous avons choisi 2 échelles d interprétation en prenant compte du taux d excrétion des différents œufs recherchés. Les résultats concernant les œufs de Calicophoron daubneyi ont été obtenus après comptage des éléments et la catégorisation semi-quantitative suivante : 0 : Absence sur la lame. 1 : moins de 5 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 2 : de 5 à 15 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 3 : de 15 à 30 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 4 : de 30 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 5 : plus de 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. Les résultats concernant les œufs de strongles digestifs et les oocystes d Eimeria sont estimés selon la catégorisation suivante : 0 : Absence sur la lame. 1 : moins de 10 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 2 : de 10 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 3 : de 100 à 200 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 4 : de 200 à 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. 5 : plus de 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces. Les lames réalisées pour la gamme de dilution (5 lames dans chacun des 5 liquides testés) sont également des lames de flottation dont nous avons lu la lamelle complète. Les résultats correspondant sont fournis en nombre d œufs comptés sur la lamelle totale. Enfin 11 échantillons ont été testés dans les 2 solutions de sulfate de zinc, la lecture de la lame de flottation est également complète et fournie en nombre d œufs comptés sur la lamelle totale. D. Analyses statistiques Afin d analyser les résultats obtenus au cours des coproscopies avec les différents liquides de flottation, nous allons utiliser le logiciel de statistique R. Le test utilisé afin de déterminer la p-value est le test de Wilcoxon appliqué à chaque catégorie d éléments parasitaires recherchés (grande taille, taille moyenne et petite taille) et en comparant les liquides utilisés 2 à 2. Pour chaque catégorie étudiée, nous réaliserons donc 10 tests. 57

59 III. Résultats A. Etude des données obtenues par le questionnaire Nous avons dans le cadre de notre enquête contacté 73 laboratoires vétérinaires départementaux. Nous avons réussi après 3 relances à collecter les réponses de 49 laboratoires dont 3 n effectuent plus de coproscopie au sein de leur établissement (fig.5). Figure 5 : Carte des laboratoires ayant répondus Nous nous intéresserons dans ce travail à la première partie du questionnaire. 58

60 1. Liquide de flottation a) Quels liquides? saccharose; 2 autre; 2 NaCl; 5 sulfate de magnésium ; 10 sulfate de zinc; 24 iodomercur ate de potassium; 12 Figure 6 : Répartition des différents liquides de flottation dans les LVD Notre enquête nous a permis de noter l utilisation majoritaire du sulfate de zinc comme liquide de flottation (fig.6). Concernant l utilisation du sulfate de magnésium, déclarée par 10 laboratoires, il faut noter que 4 laboratoires l utilisent en remplacement du sulfate de zinc en cas de rupture du réactif et 2 laboratoires déclarent également utiliser l iodomercurate de potassium. Le chlorure de sodium est utilisé par 5 laboratoires dont 2 utilisent aussi le sulfate de zinc. Le saccharose est utilisé par 2 laboratoires qui déclarent utiliser un autre liquide. Enfin 2 laboratoires ont déclaré l utilisation pour l un de chlorure de zinc et pour l autre de nitrate de sodium. b) Densité du liquide Lors de la conception du questionnaire, il nous a semblé pertinent de s intéresser à la densité des liquides utilisés puisque c est la caractéristique qui revient le plus souvent pour justifier de la capacité du liquide à faire remonter les différents œufs. Sur les 46 laboratoires ayant répondu, 20 nous ont communiqué la densité des liquides utilisés (fig. 7) 59

61 densité répondu Figure 7 : Réponse concernant la densité du liquide Les densités utilisées pour chaque liquide sont assez variables ce qui correspond à ce que nous avons rencontré dans la bibliographie : - Sulfate de zinc : les densités fournies varient de 1.23 à Sulfate de magnésium : 1.26 à Iodomercurate de potassium : 1.38 à 1.44 Nous ne savons pas si les densités déclarées sont mesurées régulièrement par le laboratoire. c) Tarif Nous avons souhaité au cours de notre questionnaire avoir une connaissance des tarifs pratiqués en coproscopie afin d estimer l homogénéité des tarifs et d évaluer l impact du coup du liquide sur le coût de la coproscopie. Nous avons pu estimer le coût du liquide par coproscopie des liquides suivants (36) d après les proportions utilisées lors de nos expériences et en considérant l utilisation de 20ml du liquide pour une coproscopie: - Chlorure de sodium (densité = 1.20) : environ Saccharose (densité = 1.26) : environ Sulfate de Magnésium (densité = 1.27) : environ Sulfate de Zinc (densité = 1.36) : environ Iodomercurate de potassium : environ Nous pouvons remarquer que le coût calculé pour une coproscopie à partir des tarifs proposés par le fournisseur ne montre pas de grande différence pour 3 liquides : sulfate de zinc, sulfate de magnésium et saccharose. Le chlorure de sodium apparait comme moins cher (environ 7 à 8 fois moins cher), cependant ce qui ressort le plus est le coût élevé du iodomercurate de potassium (près de 6 fois plus élevé). Nous avons alors cherché à savoir si ces différences de tarifs se reportaient sur le coût de la coproscopie. 60

62 ZnSO4 MgSO4 Iodo NaCl Saccharose moins de 5 entre 5 et 10 entre 10 et 15 plus de 15 Figure 8 : Tarif d'une coproscopie simple Les tarifs pratiqués au sein des LVD (fig. 8) démontrent une certaine hétérogénéité sans impact du liquide utilisé. Nous retrouvons en effet les différents liquides utilisés dans toutes les catégories de tarif. Nous pouvons cependant nous interroger sur certaines données tant certains tarifs déclarés sont faibles (moins de 5 ) en considérant qu au-delà du coût du liquide, ces tarifs prennent aussi en compte le temps du technicien. 2. Interprétation de la coproscopie Nous avons voulu connaître le mode d interprétation réalisé par les laboratoires à savoir une interprétation qualitative, semi-quantitative ou quantitative. La majorité des laboratoires réalise un examen quantitatif (43 sur 46) soit seul (20 laboratoires) soit couplé à une interprétation qualitative (20 sur 43). Certains laboratoires déclarent effectuer une interprétation quantitative et semi-quantitative (3), et enfin 2 laboratoires réalisent une lecture qualitative et semi-quantitative. Les déclarations des laboratoires ne nous permettent pas de savoir si l interprétation est fonction de la demande dans les cas où 2 modes de lecture sont déclarés. Nous pouvons cependant noter que les protocoles de comptages en McMaster associent souvent la réalisation d une lame simple afin d abaisser le seuil de sensibilité de détection des œufs (45) Tous liquides confondus, nous avons voulu mettre en parallèle le mode d interprétation et le tarif pratiqué. Cependant l observation de ces paramètres a montré quelques incohérences sur 61

63 les informations fournies. Sur 17 laboratoires déclarant une interprétation quantitative et ayant fournis leur tarif, seulement 8 nous fournissent un tarif de coproscopie simple. Nous n avons aucune précision quant à la cumulation des tarifs, ce qui rend impossible cette étude. Sur les 31 laboratoires nous ayant fourni des tarifs de coproscopie simple et avec Mc Master, 6 proposent le même tarif pour les 2 modalités d examens. Dans les autres cas le tarif est plus élevé pour un examen en lame de Mc Master que pour une coproscopie simple. 3. Temps de manipulation Les durées de manipulation fournies par les laboratoires varient entre 15 min et une journée. Nous pouvons supposer que cette grande variation est due à une différence de protocole avec intervention ou non de la centrifugeuse dans l obtention des lames de flottation, mais il est également possible que certains laboratoires aient communiqué leur temps de réponse plutôt que leur temps de manipulation (les coproscopies que nous avons nous-mêmes réalisées demandant environ 10 minutes de manipulation propre puis environ 10 minutes de lecture de la lame). 4. Mesures de protection L utilisation des liquides requiert à minima des mesures de recyclage afin de ne pas rejeter de composants chimiques dans l environnement. Par ailleurs la manipulation de certains liquides peut présenter un danger pour le technicien, il convient donc de prendre les mesures appropriées pour limiter les contacts dangereux avec le liquide. Seuls 2 laboratoires, parmi les 46 ayant répondu, ne déclarent user d aucune mesure de protection que ce soit vis-à-vis du technicien ou de l environnement. a) Port de protection individuelle Nous considérons dans les protections individuelles les gants, les masques et lunettes. Dans le cadre de toutes les manipulations coproscopiques, le port de gants est conseillé quelque soit le liquide utilisé. Cette mesure est bien suivie puisque 42 laboratoires déclarent utiliser les gants lors de la réalisation de cet examen. En ce qui concerne le port de masque et de lunettes, nous nous intéresserons en particulier aux laboratoires utilisateurs du iodomercurate de potassium qui a un potentiel toxique élevé comme nous l indiquent les fiches sécurité de ses composants (36). 62

64 port de gants masque lunettes différence par rapport au nombre total2 nombre de laboratoire usant de protection Figure 9 : Utilisation de protection individuelle par les laboratoires usant du iodomercurate de potassium Nous pouvons remarquer (fig. 9) que si le port de gants est plutôt bien respecté, peu de laboratoires utilisent un masque ou des lunettes en cas de manipulation du iodomercurate de potassium, alors que le iodure mercurique qui le compose est déclaré toxique par inhalation et par contact oculaire. En ce qui concerne les autres liquides utilisés, l usage de masque et lunettes est tout aussi faible (2 utilisent un masque parmi les laboratoires utilisant le sulfate de zinc, aucune protection supplémentaire pour les autres) cependant la fiche sécurité de ces produits ne déclare pas une toxicité des composants. b) Mesures d évacuation des déchets Disposition réglementaire : La gestion des déchets est une problématique collective et est réglementée par les articles législatifs qui ont été réunis majoritairement dans le code de l environnement. Les dispositions en matière de gestion de déchets ont été réunies en un guide par le CNRS en 2009 (16). Les déchets rencontrés dans le cadre du diagnostic vétérinaire sont soumis au plan régional pour l élimination des déchets d activités de soins d après le décret n du 18 novembre 1996 et le code de la santé publique (14). Ce plan permet dans chaque région de déterminer les établissements producteurs de ce type de déchets, la nature et la quantité de ces déchets et leur gestion. Les déchets suite à la réalisation d une coproscopie sont la lame d examen, la dilution fécale, et éventuellement le reste de l échantillon. L élimination des lames et de l échantillon suit la gestion des déchets de soins à risques infectieux en temps que matériel en verre contaminé et est donc soumise aux arrêtés du 7 septembre 1999 et à la circulaire DH/DGS/ n du 1 septembre 1998 relative à la collecte des objets piquants, tranchants souillés. Ces textes régissent les modalités de collecte 63

65 dans des containers adaptés (Norme NF X , décembre 1999) et l élimination de ces déchets (incinération dans des centres agréés). Concernant les liquides et la dilution fécale en particulier, les textes réglementant l élimination des déchets chimiques sont nombreux : - Dispositions générales relatives à la prévention du risque chimique : Code du Travail, art. R à R (15) - Arrêté du 21 février 1990 modifié Titres IV et V Emballage Étiquetage, définissant les critères de classification et les conditions d étiquetage et d emballage des préparations dangereuses. - Arrêté du 20 avril 1994 modifié, relatif à la déclaration, la classification, l emballage et l étiquetage des substances dangereuses. - Dispositions particulières sur le stockage et l élimination des déchets susceptibles d engendrer des effets préjudiciables pour la santé de l homme et l environnement : Code de l'environnement, art.l à 50 (13) - Règlement sanitaire départemental : section 2 Art. 29, alinéa 2 / Déversements délictueux (par assimilation). En ce qui concerne les liquides (excepté l iodomercurate de potassium), ils sont considérés dans la réglementation comme de faible risque chimique. Il faut les collecter dans des contenants réservés à cet usage, hermétiques, et destiner ces contenants à un circuit de traitements adaptés. Le cas du iodomercurate de potassium est particulier. D une part, en raison de son coût, il sera le plus souvent récupéré puis régénéré (voir protocole en annexe 6). D autre part au niveau de la réglementation sur les produits chimiques, il est classé dans une autre catégorie, celle des déchets de produits très toxiques, à cause de son composant mercurique. Il faut gérer l élimination des récipients des composants de base, la collecte du liquide usagé doit être réalisée dans des récipients hermétiques étiquetés, eux-mêmes placés dans un bac ou une caisse adapté(e) empli(e) d un lit d absorbant. Il faut s assurer de la compatibilité du contenant avec le contenu (à l aide des fiches de données de sécurité des produits, ). La gestion des déchets de ce liquide a un coût supérieur aux autres liquides (de 0,23 à 0,84 / kg sans fourniture des conteneurs pour la majorité des liquides contre un coût approximatif de 1,83 à 6,10 / kg pour les déchets toxiques). 64

66 Mise en pratique dans les laboratoires Sur les 46 laboratoires ayant répondu, 27 ont déclaré prendre des mesures particulières d évacuation des déchets différence avec nombre de laboratoires laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets Figure 10: Laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets Nous pouvons observer (fig.10) que concernant l iodomercurate de potassium, la majorité des laboratoires l utilisant déclare avoir des mesures particulières quant à son élimination. En ce qui concerne les laboratoires ne déclarant pas avoir de mesure particulière d élimination des déchets, nous pouvons nous interroger sur la pertinence de la formulation de la question (recyclage au lieu de mesures de gestion des déchets) puisque les laboratoires sont soumis aux mesures réglementaires précédemment citées. B. Résultats des expériences Comme nous l avons expliqué auparavant, le dépouillement des résultats du questionnaire nous a permis de déterminer les liquides que nous comparerions en coproscopie. Nous nous sommes intéressés au nombre d éléments parasitaires concentrés par chaque liquide, mais également à l aspect de ces éléments et à la facilité de lecture de la lame de flottation en fonction du liquide utilisé. 1. Aspect qualitatif a) Aspect des œufs Lors de nos expériences, nous avons eu l occasion de pouvoir préciser plus spécialement l espèce parasite que simplement par sa taille. Nous avons ainsi pu observer des œufs de Calicophoron daubneyi, de Dicrocoelium lanceolatum, de divers strongles dont Nématodirus et les diverses espèces d Eimeria présentes chez les bovins. Pour chacun de ces œufs, nous avons réalisé des photos dans les différents liquides afin d une part de pouvoir comparer leur 65

67 aspect entre les liquides et d autre part de proposer une référence avec l aspect de l œuf selon le liquide. a b c d e Figure 11 : Œuf de Calicophoron daubneyi dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium Les œufs de Calicophoron daubneyi ont la particularité de présenter des différences de remplissage ou de coloration selon le liquide envisagé (fig.11). a b c d e Figure 12 : Œuf de strongles digestifs dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium 66

68 a b c d e Figure 13 : Oocystes d'eimeria dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium a b c d e Figure 14 : Œuf de Dicrocoelium lanceolatum dans les différents liquides : a) Saccharose, b) sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium L observation dans les différents liquides ne nous a montré aucune différence d aspect pour les œufs de strongles, les oocystes d Eimeria ou les œufs de Dicrocoelium lanceolatum (fig.12, 13 et 14). Nous n avons malheureusement pas eu l occasion d observer des œufs de Fasciola hepatica dans nos échantillons. 67

69 b) Facilité de lecture Lorsque nous avons voulu évaluer la facilité de lecture selon le liquide, 2 paramètres nous sont apparus à prendre en compte : la présence de bulles et la présence de débris. Nous avons dans ce cadre réalisé pour chaque lame une évaluation de ces paramètres. Il s avère que la présence de bulles et de débris est, pour chaque échantillon, maximale en sulfate de zinc ce qui peut rendre la lecture de la lame difficile (fig.15). Œuf de Calicophoron daubneyi Ookyste d Eimeria Figure 15 : lame réalisée au sulfate de zinc Les autres liquides font apparaître une présence semblable des bulles comme des débris et sont globalement de lecture plus confortable. Cependant on peut noter l importance dans certains cas de réaliser une lecture rapide après réalisation de la lame. C est particulièrement le cas des coproscopies réalisées en chlorure de sodium, liquide qui cristallise rapidement après dépôt de la lamelle sur la lame (fig.16). La cristallisation gène effectivement la lecture. 0 minute 15 minutes 30 minutes Figure 16 : évolution de la cristallisation des lames de chlorure de sodium 68

70 2. Analyse statistique a) Œufs de Calicophoron daubneyi Tableau 1: Détection des œufs de Calicophoron daubneyi échantillon Nacl Saccharose Sulfate de Sulfate Iodomercurate magnésium de zinc de potassium

71 Les tests réalisés donnent une p-value significative dans la comparaison des résultats obtenus entre : - Le sulfate de zinc et l iodomercurate de potassium (p=4.779*10-5), le sulfate de zinc et le sulfate de magnésium (p= ), le sulfate de zinc et le saccharose (p= ) et enfin le sulfate de zinc et le chlorure de sodium (p= ). - L iodomercurate de potassium et le sulfate de magnésium (p=1.218*10-5), l iodomercurate de potassium et le saccharose (p=3.88*10-5) et l iodomercurate de potassium et le chlorure de sodium (p=1.157*10-5) L observation des résultats (tab.1 et fig.17) nous confirme les indications fournies par la p- value. Les résultats obtenus montrent une plus faible concentration et donc détection des œufs de grande taille en cas d utilisation de sulfate de magnésium, de saccharose et de chlorure de sodium par rapport aux résultats obtenus avec le sulfate de zinc et l iodomercurate de potassium. Figure 17 : présentation de l'estimation des oeufs de Calicophoron daubneyi La différence observée entre l iodomercurate de potassium et le sulfate de zinc provient d une différence de dénombrement dans la majorité des échantillons : sur 28 positifs, 18 le sont en sulfate de zinc et en iodomercurate, 8 le sont en iodomercurate mais pas en sulfate de zinc, et 2 le sont dans un autre liquide mais pas en iodomercurate. Il semble que les œufs de grande taille soient détectés mais comptés en moins grand nombre avec le sulfate de zinc qu avec l iodomercurate de potassium. 70

72 b) Œufs de strongles digestifs Tableau 2 : Détection des œufs de strongles digestifs échantillon Nacl Saccharose Sulfate de Sulfate Iodomercurate magnésium de zinc de potassium

73 L étude statistique des résultats expérimentaux concernant les éléments parasitaires de taille moyenne ne donne une p-value significative que dans 3 cas : - Entre le saccharose et le chlorure de sodium (p= ) - Entre le sulfate de zinc et le saccharose (p= ) - Entre le chlorure de sodium et l iodomercurate de potassium (p= ) La p-value dans le cas de la comparaison entre sulfate de zinc et saccharose et dans le cas du chlorure de sodium et du iodomercurate de potassium, bien qu inférieur à 0.05, est supérieure à 0.01 ce qui amène à s interroger sur la valeur de la signification de la différence mise en évidence. Nous allons pour cela nous attarder sur la représentation graphique des données (fig.18). Figure 18 : présentation des résultats des œufs de strongles digestifs L observation de la représentation graphique des résultats montre une moyenne sensiblement différente entre les liquides précédemment cités. Mais elle nous pousse aussi à nous interroger sur l absence de preuve de différence entre les 2 liquides apparemment les plus sensibles (saccharose et iodomercurate de potassium) et le sulfate de magnésium. 72

74 c) Oocystes d Eimeria Tableau 3 : détection des oocystes d Eimeria échantillon Nacl Saccharose Sulfate de Sulfate Iodomercurate magnésium de zinc de potassium

75 Les tests de Wilcoxon réalisés fournissent une p-value significative dans le cas de la comparaison entre l iodomercurate de potassium et tous les autres liquides : - Avec le sulfate de zinc : p=8* Avec le sulfate de magnésium : p=1.55* Avec le chlorure de sodium : p=3.082* Avec le saccharose : p=2.985*10-6 Toutes ces valeurs de p-value sont considérées comme hautement significatives dans le domaine statistique, elles sont par ailleurs confirmées par l observation des données (tab.3 et fig.19). L appréciation semi-quantitative du nombre d œufs en iodomercurate de potassium s avère bien inférieure qu avec les 4 autres liquides. Figure 19 : présentation des résultats des oocystes d Eimeria La p-value s avère également significative dans la comparaison entre les résultats obtenus en saccharose et chlorure de sodium (p=0.007). L observation des données (fig.19) est en accord avec cette différence puisque la moyenne de l estimation est plus élevée en saccharose qu en chlorure de sodium. 74

76 3. Etude de la sensibilité des liquides Au cours des examens coproscopiques, nous avons pu détecter quelques échantillons présentant une diversité de parasites intéressante à utiliser pour réaliser les gammes de dilution. Nous en avons sélectionné 2 pour lesquels nous avons effectué les comptages en cellule de Mc Master (moyenne présentée pour chaque catégorie d œufs, tab.4) Tableau 4 : moyenne des comptages en lame de Mc Master Calicophoron Dicrocoelium Strongles Eimeria daubneyi lanceolatum digestif Echantillon A <50 opg <50 opg 70opg 80opg Echantillon B 140opg <50opg 80opg 290opg Nous avons choisi de réaliser les dilutions à partir de l échantillon B qui présente le plus grand nombre d éléments parasitaires par gramme de fèces. a) Détection des éléments parasitaires les plus fréquents Tableau 5 : résultat des comptages sur lamelle totale La réalisation de gamme de dilution dans les différents liquides montre des résultats similaires (tab.5) à ceux obtenus lors de l analyse statistique précédente : - Concernant les œufs de Calicophoron daubneyi, le sulfate de magnésium, le saccharose et le chlorure de sodium sont de moindre sensibilité que le sulfate de zinc 75

77 et l iodomercurate de potassium, de plus le nombre d œufs détectés de Calicophoron daubneyi est plus important avec l iodomercurate de potassium qu avec le sulfate de zinc. - Concernant les œufs de strongles digestifs, la réalisation de la gamme ne montre pas de différence entre les liquides. La sensibilité des 5 liquides étudiés apparaît donc comme proche dans le cadre du diagnostic de strongylose. - Concernant les oocystes d Eimeria, nous pouvons observer la confirmation des données obtenues dans l étude statistique précédemment réalisée à savoir que l iodomercurate de potassium apparaît comme détectant un nombre moins grand d oocystes alors que le saccharose semble être le liquide permettant le plus grand dénombrement de ces oocystes. Ces gammes nous permettent d envisager l impact du prélèvement sur le résultat de la coproscopie puisque sur les 5 examens réalisés sur le même échantillon, nous pouvons observer pour un même liquide une variabilité du comptage, qui parfois conduit à une interprétation différente de l examen (de présence à plus) mais sans relever d une différence importante du nombre d œufs comptés. b) Détection des œufs de Dicrocoelium lanceolatum Les œufs des parasites de la classe des trématodes sont tous considérés comme lourds et l on peut envisager le comportement des œufs de Dicrocoelium lanceolatum comme semblable à ceux de paramphistomes. Nous n avons pas eu suffisamment d échantillons positifs avec ce type de parasite pour les inclure dans l étude statistique mais la réalisation de gamme de dilution pour ce parasite permet d observer une tendance de ce comportement. En tenant compte de la faible excrétion de ces œufs dans les conditions naturelles, il ne nous a pas semblé pertinent d aller au-delà d une dilution au demi. Tableau 6 : comptages des œufs de Dicrocoelium lanceolatum Sulfate de zinc Iodomercurate de potassium Sulfate de magnésium Chlorure de sodium Saccharose pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/ Au cours de ces gammes, les œufs de Dicrocoelium lanceolatum ont été détectés dans tous les liquides, sauf le chlorure de sodium, au moins une fois (tab.6). La gamme réalisée ne montre pas vraiment de tendance de sensibilité d un liquide puisque seuls les comptages réalisés en sulfate de zinc semblent probant. 76

78 Les comptages dans les autres liquides, et en particulier en iodomercurate de potassium, peuvent être reliés à un biais d échantillonnage que nous remettrons plus en question au cours de la discussion à venir, d autant plus que lors de détection de ces œufs avec d autres échantillons, la sensibilité semblait similaire entre le sulfate de zinc et l iodomercurate de potassium (tab.7) puisque la détection s effectuait en sulfate de zinc et en iodomercurate de potassium. Tableau 7: Comptage d'œufs de Dicrocoelium lanceolatum Sulfate de Iodomercurate Sulfate de Chlorure de saccharose zinc de potassium magnésium sodium Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Echantillon Nous retrouvons donc avec les œufs de Dicrocoelium lanceolatum (de taille moyenne : 40µm environ) le même comportement que pour les œufs de grande taille, comportement semblant plus lié à la densité de l élément parasitaire qu à sa taille même. Dans ce cas précis, la faible excrétion de Dicrocoelium lanceolatum a pour conséquence de ne pas détecter de différence de sensibilité entre le sulfate de zinc et l iodomercurate de potassium, qui sont les liquides les plus sensibles quant à la détection de ces œufs. 4. Comparaison de deux densités pour le sulfate de zinc Il nous a été permis au cours des expériences d obtenir un liquide constitué de sulfate de zinc heptahydraté dont la densité s élève à Il nous a semblé intéressant d étudier les différences apportées par l augmentation de densité. Nous avons alors réalisé les coproscopies pour 11 échantillons avec les 2 solutions de sulfate de zinc de densité différente et avons étudié outre la détection des éléments parasitaires, la lisibilité des lames. 77

79 a) Facilité de lecture Nous avons dans un premier temps pu observer au cours des manipulations que les dilutions fécales filtrées apparaissaient plus claires avec la solution de densité 1.44 qu avec la solution de densité 1.36 (fig.20). Dilution fécale avec la solution de sulfate de zinc de densité 1.36 Dilution fécale avec la solution de sulfate de zinc de densité 1.44 Figure 20 : observation de la dilution fécale dans les 2 solutions de sulfate de zinc Par ailleurs lors de l observation des lames, nous avons pu constater que pour un même échantillon, la présence de débris était moins importante avec la solution à 1.44 (cohérent avec l aspect du filtrat) mais également que la présence de bulles était diminuée dans cette solution. Il apparaît donc que l augmentation de la densité de la solution de sulfate de zinc soit un moyen intéressant de remédier à la difficulté de lecture associée à ce liquide. b) Détection des éléments parasitaires Onze échantillons ont été testés à l aide des 2 solutions de sulfate de zinc de densité 1.36 et Le nombre réduit d échantillon ne permet pas une analyse statistique des données, nous ne pouvons donc en conclure qu une tendance quant à l impact de la densité d une solution sur la concentration des éléments parasitaires. Tableau 8 : Comparaison du comptage des éléments parasitaires selon la densité du sulfate de zinc 78