GCH-2103: Biotechnologie industrielle et environnementale, A10 Laboratoire #1: Analyse instrumentale

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1 GCH-2103: Biotechnologie industrielle et environnementale, A10 Laboratoire #1: Analyse instrumentale Objectifs Ce laboratoire a pour but d'initier les étudiants aux techniques analytiques quantitatives utilisées en biotechnologie. Pour ce faire, 3 échantillons d'une culture de levures de concentrations inconnues seront remis à chaque équipe. Les équipes analyseront à tour de rôle leurs échantillons par 4 techniques mises à leur disposition: mesure de la masse sèche, mesure de la densité optique, dénombrement et analyse enzymatique du glucose. Pour chaque équipe, la première technique utilisée sera exécutée de façon à étalonner l'appareil. Mesure de la masse sèche (M.S.): Matériel: Contenant hermétique stérile pour prélever l échantillon (50 ml) (lorsque nécessaire) Seringue ou pipette de 20 ml (stérile lorsque nécessaire) Pincette Coupelle Cylindre gradué de 50 ml Filtre de 0.45 µm, résistant à haute température Dessicateur Étuve à 105 C (préalablement chauffé) Kit de filtration (entonnoir et pied magnétiques) Erlenmeyer 1000 ml avec un raccordement en verre Tube pour la filtration sous vide Méthodologie : 1. Mettre en marche l étuve à l avance à 105 C 2. Placer les filtres et les coupelles à l avance dans le dessiccateur. Identifier les coupelles que vous aller utiliser avec un code approprié. 3. Installer l'appareil de filtration 4. Prélever un volume d'échantillon (entre 5 et 40 ml dépendant de la densité en biomasse) de la culture avec la seringue ou la pipette stérile et le placer dans un contenant hermétique. 5. Peser la coupelle et noter sa masse (m c ), placer le filtre dans la coupelle puis noter sa masse de nouveau (m f+c ). 6. Créer le vide dans l'appareil de filtration 7. À l aide de la pincette, placer délicatement et bien au centre la membrane filtrante sur la base du support du filtre 8. Monter la partie supérieure de l'entonnoir sur la base du support du filtre, puis verser lentement l échantillon sur le filtre (bien agiter l'échantillon avant de verser afin de maintenir les particules en suspension homogène). 9. Rincer toutes les parties mises en contact avec l échantillon 2 fois: contenant, pipette, filtre, avec de l'eau du robinet en utilisant au minimum un volume total équivalent à deux fois celui de l échantillon. 10. Fermer la source de vide et rétablir graduellement la pression atmosphérique dans le système 11. Enlever l entonnoir puis avec la pincette retirer le filtre délicatement pour le déposer dans la coupelle d aluminium. 12. Placer la coupelle dans l étuve à 105 C pendant au moins 24 heures.

2 13. Après 24 heures, mettre la coupelle dans un dessiccateur pour une heure puis peser l ensemble masse sèche+filtre+coupelle (m b+f+c ), noter. Calcul : M.S.(g/L) = (m b+f+c (g) m f+c (g)) / volume de culture filtré (ml) * (1000 (ml/l)) Pour l'étalonnage, répéter l'expérience avec différents volumes d'échantillons et si possible des répétitions. Mesure de la densité optique (D.O.) Matériel: Spectrophotomètre Éprouvettes (5 ml pour spectro) Éprouvettes Eppendorf (1,5 ml) Deux pipettes propres, non-stériles,1 ml et 5mL. Poire pour pipette Support à tube Échantillon de 5 ml Eau distillée Centrifugeuse pour éprouvettes Eppendorf Méthodologie : 1. Préchauffer l appareil 20 minutes avant utilisation. 2. Régler la longueur d onde adéquate (idéalement 600 nm, mais 500 nm pour compatibilité avec mesure de glucose peut être adéquat). 3. Ajuster le zéro et le 100% de transmission tel qu'indiqué dans le protocole de l'appareil. 4. Prélever 3 ml d échantillon dans le tube de 5 ml pour la mesure. 5. Insérer le tube d échantillon dans l appareil, mesurer et noter l absorbance 6. Si la mesure d absorbance est supérieure à 0,7, diluer l échantillon de manière à mesurer une absorbance se situant entre 0,1 et 0,7. Noter le facteur de dilution et l absorbance. 7. Pour étalonner l appareil, mesurer l absorbance (entre 0,1 et 0,7) pour plusieurs dilutions d un même échantillon, avec répétitions. Noter aussi l'absorbance du milieu de culture. Faites aussi des mesures répétées de masse sèche pour cet échantillon. Note 1: Note 2: Note 3: Lors de cette mesure, il est très important que l'échantillon soit homogène. Il faut donc bien agiter l'échantillon tout au long de l'essai. On peut vérifier l'interférence du milieu de culture en mesurant la densité optique du milieu de culture, soit non-utilisé, soit utilisé. Pour du milieu non-utilisé, il ne s'agit que de mesurer l'absorbance d'un échantillon de milieu original. Pour du milieu utilisé, on peut récupérer le surnageant d'un échantillon de culture centrifugé. Idéalement, la longueur d onde choisie devrait permettre d éviter au maximum les interférences dues au milieu de culture. Un autre moyen d'éviter cette interférence consiste à mesurer la densité optique de culots cellulaires resuspendus dans de l eau. Bien rincer les pipettes entre les dilutions

3 Calcul : Pour l'absorbance mesurée sur un échantillon brut: D.O. équivalente = Absorbance * facteur de dilution Absorbance du milieu de culture Pour l'absorbance mesurée sur un culot cellulaire resuspendu dans de l'eau: D.O. équivalente = Absorbance * dilution Mesure du ph (facultatif): Matériel : Électrode à ph et un ph mètre Solution standard à ph 4,00 ; ph 7,00 ; ph 10,00 Support pour l électrode Quatre contenants de 30 ml Bécher de 250 ml Poire à eau Papier absorbant fin Barreau magnétique Plaque agitatrice Méthodologie : A- Étalonnage de l électrode : 1. Allumer l appareil 2. Bien nettoyer l électrode en la rinçant avec de l eau et l éponger avec un papier fin 3. Calibrer la sonde avec des solutions de ph standard. B- Mesure du ph de l échantillon : - Prélever au moins 10 ml d échantillon, déposer le barreau magnétique dans le contenant, puis tremper l électrode pour qu elle soit bien immergée dans le liquide. Tenir l électrode à l aide du support, attendre que la lecture se stabilise, noter le ph. Dénombrement cellulaire Matériel: Microscope Cytomètre (plaque et lamelle) Éprouvettes Eau Micropipette 100 ul, embouts Compteur Méthodologie: 1. Prélever un échantillon stérile de culture (1ml).

4 2. Placer la lamelle de verre sur le cytomètre. 3. Présenter une goutte d échantillon, bien mélangée, devant le cytomètre: l échantillon pénétrera par capillarité et emplira la chambre. 4. Compter le nombre de cellules comprises dans les 4 zones de 4x4 carreaux situées aux 4 coins du quadrillé (volume de chaque zone : 1 mm x 1 mm x 0,1mm = 1x10-4 ml. (voir graphique du cytomètre ci-joint) Calcul : Concentration (# de cellule/ml) = compte x dilution / 4x10-4 Note 1: pour une mesure statistiquement représentative, le compte devrait se situer entre 100 et 400 cellules. Au-delà de ces valeurs, il est préférable de diluer l échantillon. Note 2: Pour l'étalonnage, faire les comptes à différentes dilutions cellulaire du même échantillon et répéter la mesure. Dosage du glucose Voir instruction du manufacturier (ci-jointe) pour méthode générale et principe de fonctionnement de la méthode. Brièvement, 30 μl d'échantillon sont mélangés à 3 ml de solution réactive, puis incubés 10 min à température pièce avant une lecture d'absorbance à 505 nm. Dans le cas où la concentration en glucose de l'échantillon dépasse 2 g/l, une dilution devra être effectuée, ou le volume d'échantillon ajouté devra être modifié, de la manière suivante. Concentration de l'échantillon Dilution de l'échantillon (ou volume d'échantillon) 2-4 g/l 1/2 (15 μl) 4 8 g/l 1/4 (7,5 μl) 8 16 g/l 1/ g/l 1/ g/l 1/32 Pour l'étalonnage, analyser le glucose de différentes solutions standard, en duplicata, et tracer une courbe d'étalonnage. Rapport Présentez et interprétez vos résultats en essayant d identifier l ordre chronologique des échantillons. Discuter les liens entre les différentes mesures.

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