Pharmaco-protéomique. Vers l infini et au-delà! Manon Carré
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- Ghislaine Morency
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1 Pharmaco-protéomique Vers l infini et au-delà! Manon Carré INSERM UMR911 Centre de Recherche en Oncologie biologique et Oncopharmacologie (CRO2) manon.carre@univmed.fr
2 Protéines, protéomique & co Protéome humain = + d 1,2 million de protéines Protéomique = «Analyse des protéines exprimées par une cellule / tissu / organisme àun moment donné» Très variable : reflète l état de fonctionnement d une cellule dans un contexte (environnement, pathologie, traitement )
3 la protéomique globale permet d identifier toutes les protéines présentes dans un environnement donné (établissement de la cartographie protéique). la protéomique fonctionnelle permet l analyse des complexes protéiques et la recherche de biomarqueurs. la protéomique qualitative permet l identification des modifications post-traductionnelles, et la protéomique quantitative permet l analyse des variations de l abondance des protéines. Protéines, protéomique & co Pourquoi s ints intéresser àla protéomique omique???
4 Acteurs de la protéomique Protéome : «the PROTEin complement of a genome» 2001, formation de l'organisation du Protéome Humain But : développer l'importance de la protéomique dans le diagnostic, le pronostic et la thérapeutique au travers du Projet du Protéome Humain (HPP) depuis 2009.
5 Acteurs de la protéomique Oral Sessions (Boston 2012) The Business of Biology:BioPharma / Biotherapeutics Beyond Genomics: Proteomics of Cancers Clinical Insights: Disease Proteomics Personal Proteomics: Diagnostics and Targets
6 Acteurs de la protéomique Société Française d'electrophorèse et d'analyse Protéomique But : favoriser le développement des techniques et méthodes permettant l'analyse à grande échelle des protéines.
7 Acteurs de la protéomique Plateau protéomique MaP(Marseille Protéomique). Protéomique clinique (cancer), protéomique quantitative, pharmaco-protéomique, recherche de biomarqueurs Faculté de Pharmacie (Timone) Faculté de Médecine (Nord) Campus CNRS (Joseph Aiguier) CRCM (IPC) CIML (Luminy)
8 Synopsis
9 Outils en protéomique : échantillon protéique LYSE : -Mortier -Ultrasons - Lyse enzymatique - Détergents (urée ) - Choc osmotique - Congélation/décongélation ELIMINATION des agrégats (ultracentrifugation), des acides nucléiques (DNAses/RNAses), des protéases (inhibiteurs) et des sels (micro-colonnes)
10 Outils en protéomique : électrophorèse 2D 1 ère dimension = Iso-Electro Focusing (IEF) Séparation en fonction du point isoélectrique (pi)
11 Outils en protéomique : électrophorèse 2D
12 Outils en protéomique : électrophorèse 2D 2 ème dimension = SDS-PAGE Séparation en fonction du poids moléculaire
13 Outils en protéomique : électrophorèse 2D
14 Outils en protéomique : électrophorèse 2D Révélation = diverses colorations Sensibilité et linéarité variables Bleu de Coomassie colloïdal (limite 50 ng) Nitrate d argent (limite 0.02 ng)
15 Outils en protéomique : électrophorèse 2D Fluorescence (limite 1 ng)
16 Outils en protéomique : digestion in gel Excision des spots et digestion protéique
17 Outils en protéomique : spectrométrie de masse Technologies MALDIet ESIconnues depuis plusieurs 10aines d années
18 Outils en protéomique : spectrométrie de masse
19 Outils en protéomique : spectrométrie de masse SOURCE MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
20 Outils en protéomique : spectrométrie de masse SOURCE ESI = ElectroSpray Ionization
21 Outils en protéomique : spectrométrie de masse ANALYSEUR(séparateur d ions) TOF = Time Of Flight
22 Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par obtention d une empreinte peptidique (MS)
23 Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par obtention d une empreinte peptidique (MS)
24 Outils en protéomique : spectrométrie de masse Identification de la protéine par séquençage (MS/MS)
25 Outils en protéomique : spectrométrie de masse
26 Le plus lourd du travail! Outils en protéomique : moteurs de recherche
27 Outils en protéomique : moteurs de recherche Identification des peptides (entiers ou fragmentés) par comparaison avec des banques de données
28 Application : identification de biomarqueurs 1 gel / condition
29 Application : identification de biomarqueurs Ex : Cancer de l oesophage Zhou G et al. Mol Cell Proteomics 2002.
30 Application : identification de biomarqueurs Ex : Leucémies résistantes aux agents anti-microtubules Alterations de la γ-actine Verrills NM et al., J. Nat. Cancer Inst. 2006
31 Application : identification de biomarqueurs Difficulté: matching des gels entre eux et normalisation par rapport à une référence pour quantifier les variations
32 Application : identification de biomarqueurs Solution : DIGE= Differential In-Gel Electrophoresis Cy 3 image mix Cy 5 image Cy 2 image
33 Application : identification de biomarqueurs Solution : DIGE= Differential In-Gel Electrophoresis
34 Application : identification de biomarqueurs Ex : Leucémies résistantes aux agents anti-microtubules Vert = cellules sensibles Rouge = cellules résistantes Identification de 19 protéines altérées (11 en rapport avec actine) Verrills NM et al., J. Nat. Cancer Inst. 2006
35 Et en clinique : aussi facile? Protéomes cliniques - Séquences génomiques partielles - Protéomes «contaminés» Déplétion des IgG et albumine Plasma humain non déplété Reproductibilitéindispensable Standards établis par HUPO (2010) après une étude de contrôle-qualité par 27 laboratoires internationaux (échantillons inconnus)
36 Et en clinique : aussi facile? Etape limitante: validation des biomarqueurs Validation clinique sur des cohortes de population Sur fluides Sur tissus (IHC) Obtention d anticorps spécifiques
37 Application : établir un diagnostic Diagnostiquer la pathologie le plus tôt possible, de façon sensible (avant même toute modification visuelle?) Diagnostic possible à partir de profils de peptides non identifiés
38 Application : établir un diagnostic A partir de biopsies Ex : identification de cas de cancers pulmonaires et cérébraux Yanagisawa K et al., Lancet Schwartz SA et al., Clin Cancer Res 2004 Moreira JM et al., Mol Oncol 2010 A partir d urine Ex : diagnostic de cancers de l estomac et du rein Rogers MA et al., Cancer Res 2003 Mischak H et al., Adv Chronic Kidney Dis 2010 A partir de sérum Ex : diagnostic de stades I de cancer de l ovaire / sein / prostate Ornstein DK et al., J Urol 2004 Kulasingam V et al., Int j Cancer 2008
39 Application : établir un diagnostic Lancet 2002 Panel de biomarqueursdéfini sur 50 femmes avec un cancer de l ovaire et 50 femmes non touchées. Utilisation de ce profil protéique pour classifier 116 échantillons en aveugle : 95% de succès dans la discrimination entre cas sains et cancéreux (dont 20 cas de stade I)
40 Application : personnaliser le traitement Classification fine pour une optimisation du traitement Ex: identification des différents grades de cancers cérébraux et de la prostate Schwartz SA et al. Clin Cancer Res 2004 Skvortsov S et al, J Proteome Res 2010 Ex : classification de cancers du poumon et sein de bons et mauvais pronostics Yanagisawa K et al. Lancet Lai TC et al. J Proteome Res et suivi des effets du traitement au cours du temps Michlmayr A et al. Br J Cancer Thoenes L et al. J Proteomics 2010.
41 Application : recherche de nouvelles cibles thérapeutiques Biomarqueurs menant au développement de nouveaux médicaments, avec l aide de techniques de biologie structurale et de physicochimie (détermination des domaines d interaction de la protéine cible avec le médicament potentiel )
42 Application : recherche de nouvelles cibles thérapeutiques
43 Et maintenant? Puce SELDI-Tof = surface-enhanced
44 Et maintenant? LC-MS/MS = chromatographie liquide
45 Et maintenant? DTP = direct tissue proteomics Normal Tumeur Hwang SI et al. Oncogene 2007
46 Et maintenant? Imagerie MALDI Image MALDI de la tête d un épididyme de rat. Expression différentielle in situ de 3 protéines.
47 Et maintenant? Imagerie MALDI Coupes de tissus (congelés) Observation au microscope Application de la matrice Balayage MALDI-Tof
48 Et maintenant? Imagerie MALDI Revue: Wisztorski M et al. Medecine Sciences 2007 m/z 2028 m/z 2092 Images moléculaires reconstruites de la répartition de 2 protéines au sein d une coupe de cerveau de rat
49 Manon Carré INSERM UMR911 Centre de Recherche en Oncologie biologique et Oncopharmacologie (CRO2)
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