UNIVERSITE PARIS XII- VAL DE MARNE FACULTE DE MEDECINE THESE DOCTEUR DE L UNIVERSITE PARIS XII. DJAMAN Allico Joseph

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1 1 UNIVERSITE PARIS XII- VAL DE MARNE FACULTE DE MEDECINE ANNEE : 2003 N. THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITE PARIS XII Discipline : Parasitologie Présentée et soutenue publiquement par DJAMAN Allico Joseph Le 24 juillet 2003 Titre : Évaluation de la chimiorésistance de Plasmodium falciparum à différents antipaludiques (chloroquine, sulfadoxine-pyriméthamine, quinine) et profil génétique des isolats correspondants Directeur de thèse : André MAZABRAUD JURY Monsieur Martin DANIS Président Monsieur Philippe DELORON Rapporteur Monsieur Pascal RINGWALD Rapporteur Monsieur Léonardo BASCO Examinateur Madame Michèle DENIAU Examinateur Monsieur André MAZABRAUD Examinateur

2 2 AVANT PROPOS Un sage de l'antiquité a dit : «Faire des livres est un travail sans fin et beaucoup d'étude fatigue le corps». Mais, il a ajouté : «Tout labeur donne du profit et c'est un arbre de vie et douceur pour l'âme que le désir satisfait» L'étude sur l'agent majoritairement causal du paludisme en Afrique subsaharienne m'a toujours passionné. À présent, elle m'apporte certes une satisfaction personnelle mais elle me permet de mieux comprendre le vivant, depuis le mammifère jusqu'au microbe. A mon avis le comportement des êtres vivants face au danger peut se résumer ainsi : «Face à ce qui peut menacer son existence et entraîner son extinction, le vivant réagit, soit en évitant instinctivement le danger, soit, en lui faisant front tout en sachant qu'il est capable de tenir tête par divers mécanismes». Plasmodium falciparum résiste aux médicaments en empruntant la deuxième voie, il est donc instinctivement sage et son extinction n'est pas certainement pour demain. «De ce fait, sans être alarmiste, il sera difficile à l'homme d'enrayer le paludisme et le Plasmodium de la carte du monde par voie médicamenteuse».

3 3 REMERCIEMENTS Au terme de ce travail, qu'il me soit permis d'exprimer mes remerciements à tous ceux qui ont œuvré pour qu'il puisse connaître un heureux dénouement. Ainsi, je remercie sincèrement le Docteur André Mazabraud, affectueusement appelé "chef" pour l'honneur qu'il m'a fait de m'accueillir dans son laboratoire et d'avoir assuré la direction scientifique de ce travail. Je remercie particulièrement le Docteur Léonardo Basco, qui a été le maître d'œuvre dans la conception pratique de ce travail. Il a gagné ma sympathie par sa rigueur scientifique concernant les trois aspects de la surveillance de la chimiorésistance des plasmodies. Cette thèse a lieu parce que le Professeur René Houin a accepté mon inscription dans la filière : hôte-parasite de l'école doctorale SVS de Paris XII, puis a été mon correspondant durant toutes ces années. Merci Professeur pour votre sollicitude à mon égard. Je voudrais exprimer mes remerciements à Monsieur le Professeur M. Danis qui n'a pas hésité à être le président de jury pour juger ce travail. Toute ma reconnaissance à Messieurs les Docteurs Pascal Ringwald et Philippe Deloron pour avoir accepté de corriger et de juger ce travail malgré les charges qui sont les leurs. Je tiens à remercier Madame le Professeur Michèle Deniau qui n'a pas hésité un seul instant à faire partie du jury de thèse pour juger ce travail. Je remercie celui qui m'a donné le goût à la parasitologie, le Professeur Koné Moussa pour ses conseils pour mener à terme cette étude et pour la confiance toujours renouvelée dans l'encadrement des étudiants en thèse d'exercice et de DEA de Biologie humaine et Tropicale (BHT). Merci à mon Ami le Docteur Gnagbomon Jacob, 1 er médecin chef du FSUCOM "Toit rouge" qui malheureusement a perdu la vie accidentellement alors que j'étais en France dans la première phase d'exécution de la partie moléculaire de la présente étude. Je remercie et suis reconnaissant à ceux qui m'ont aidé à persévérer dans ce travail et qui m'ont prodigué leur expérience et encouragement (Dr P. Eldin de Pécoulas, Dr Rachida Tahar, Dr Myriam De Chalendar, Dr David Dupasquier, Dr Jerôme Valin, Dr Nicolas Pollet). Je souhaite bon courage à Ludvine Sinzelle et à Raphaël Thuret pour la suite de leurs travaux et merci à Mme Chantal Ballagny qui s'est beaucoup investie pour moi au plan administratif. Je remercie toute l'équipe TGA pour leur sympathie durant tout le temps que je suis resté en leur compagnie. Merci à toute l'équipe d'abidjan (les techniciens de labo, le Médecin de l'équipe et tout le personnel du FSUCOM de "Toit rouge" de Yopougon), ainsi que l'ensemble des collaborateurs du laboratoire de Microbiologie de l'institut National de Santé Publique (INSP) d'abidjan pour avoir donné de leur temps et énergie afin de parvenir à la fin des travaux. Je remercie la direction de l'insp pour m'avoir fait confiance et permis que cette étude continue malgré les débuts difficiles à cause du coup d'état de La partie moléculaire de la présente étude a été entièrement financée par le MAE du gouvernement français par l'intermédiaire de la coopération française à Abidjan sous forme d'une bourse en alternance qui m'a été octroyée ; merci pour le soutien financier. Merci également au projet Pal+ de Dr Léonardo pour les quatre mois de bourses qui m'ont permis de finaliser et de soutenir ma thèse.

4 4 PLAN LISTE DES ABREVIATIONS LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES RESUME I- INTRODUCTION I-1 Définition et historique du paludisme I-1.1 Définition I-1.2 Historique I-2 Maladie, symptômes I-2.1 Épidémiologie du paludisme I-2.2 Symptomatologie I-3 Diagnostic biologique I-4 Antipaludiques I-4.1 Lysosomotropes I-4.2 antimétabolites I-4.3 Antibiotiques I-4.4 Mode d action des antipaludiques I Métabolisme du Plasmodium I Mode d'action des lysosomotropes I Mode d'action des antimétabolites I-4.5 Schéma de l utilisation des antipaludiques I-5 Chimiorésistance I-5.1 Définition I-5.2 Mécanismes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques I Mécanismes de résistance aux lysosomotropes I Mécanismes de résistance aux antimétabolites I-5.3 Conditions d apparition de la résistance I-5.4 Facteurs favorisant la résistance I-5.5 Etude de la chimiorésistance I Test de l'efficacité thérapeutique

5 5 I Test in vitro I Généralités I Culture in vitro de P. falciparum I Test moléculaire I Génome de P. falciparum I Étude des gènes impliqués dans la résistance I Dosage de médicament I-6 Justification de l'étude I-7 Objectifs II- ZONE D ETUDE, MATERIEL ET METHODES II-1 Zone d étude II-2 Matériel II-2.1 Sélection des sujets II-2.2 Prélèvement d'isolats de P. falciparum II-2.3 Milieux de culture et réactifs pour le test in vitro II-2.4 Gènes à amplifier, oligonucléotides et endonucléases utilisés II Gènes de P. falciparum à amplifier II Oligonucléotides utilisés II Endonucléases utilisés II-3 Méthodes II-3.1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum II-3.2 Chimiosensibilité in vitro de P. falciparum II Préparation du milieu de culture II Dilution de drogues et chargement des plaques II Préparation de l'échantillon de globules rouges parasités II Mise en culture de l'inoculum II Collecte cellulaire et comptage II Interprétation du test II-3.3 Techniques moléculaires II Extraction de l ADN plasmodial à partir du sang total parasité

6 6 II Extraction de l ADN plasmodial à partir du sang déposé sur confettis II Préparation et purification des oligonucléotides II Protocole d'amplification II Digestion du produit de PCR ou PCR-RFLP II Protocole de purification des produits de PCR et séquençage II-3.4 Méthodes d'analyse des résultats III- RESULTATS III-1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum aux antipaludiques III-1.1 Efficacité thérapeutique de la chloroquine III-1.2 Efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine III-2 Chimiosensibilité in vitro à la chloroquine, sulfadoxine-pyriméthamine et quinine III-3 Tests couplés efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro III-3.1 Efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine III-3.2 Efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum à la pyriméthamine III-4 Profil génétique des isolats de P. falciparum III-4.1 Digestion enzymatique ou RFLP III-4.2 Acides aminés de la DHFR, DHPS, PFMDR-1 des isolats de P. falciparum III-4.3 Prévalence de la mutation et sensibilité des isolats aux antipaludiques III Mutation K76T et sensibilité de P. falciparum à la chloroquine III Mutation du gène pfmdr-1 et sensibilité de P. falciparum à la quinine et à la chloroquine III Mutations des gènes dhfr, dhps et sensibilité de P. falciparum à la sulfadoxine-pyriméthamine IV- COMMENTAIRES, DISCUSSION ET CONCLUSION IV-1 Surveillance épidémiologique de la résistance IV-2 Aspects moléculaires de la résistance plasmodiale IV-3 Conclusion V-REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES VI- ANNEXES

7 7 LISTE DES ABRÉVIATIONS ACD : BET : BSA : acide citrique-dextrose bromure d'éthidium albumine sérique de boeuf CI 50 : concentration inhibitrice à 50 % DHFR-TS : DHPS : DNTP : DTT : EDTA : ECT : EPT : ETP : ETT : HEPES : PABA : pb : PCR : PFCRT : PFMDR : dihydrofolate réductase thymidilate synthétase dihydroptéroate synthétase désoxyribonucléotide triphosphate dithiothreitol éthylène diamine trétraacétate échec clinique tardif échec parasitologique tardif échec thérapeutique précoce échec thérapeutique tardif acide N-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-n'-(2-éthanesulfonique) Acide para-amino-benzoïque paire de bases polymerase chain reaction Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter Plasmodium falciparum multidrug resistance RPMI 1640 : Roswell Park Memorial Institute 1640 TBE : Tris ou Tris base, Acide borique, EDTA, ph 8,3

8 8 Tableaux LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES Tableau I : Séquences des amorces utilisées pour amplifier les différents fragments d'adn des gènes de résistance Tableau II : Gamme de concentrations finales de médicaments lors du test in vitro Tableau III : Conditions d'amplification des fragments d'adn des gènes de résistance Tableau IV : Principaux polymorphismes des codons impliqués dans la résistance de P. falciparum des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr-1 avec les acides aminés résultant de ces changements Tableau V: Méthode de réalisation des tests Tableau VI : Résultats de l efficacité thérapeutique de la chloroquine Tableau VII : Résultats de l efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine Tableau VIII : Résultats du test couplé efficacité thérapeutique / in vitro à la chloroquine Tableau IX : Résultats du test couplé efficacité thérapeutique à la SP / in vitro à la pyriméthamine Tableau X : Répartition du nombre d'isolats par rapport au type de mutation de chaque gène Tableau XI : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfcrt Tableau XII : Répartition des isolats pfcrt mutants dans la population des sujets traités à la chloroquine et dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue Tableau XIII : Sensibilité in vivo et in vitro à la chloroquine et profil génétique (pfcrt) des isolats Tableau XIV : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfmdr Tableau XV : Répartition des isolats pfmdr-1 mutants dans la population des sujets traités à la chloroquine et dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue Tableau XVI : Influence de la nature des gènes pfmdr-1 et pfcrt dans la population des sujets traités à la chloroquine

9 9 Tableau XVII : Réponses in vivo à la sulfadoxine-pyriméthamine et in vitro à la pyriméthamine (PYR) et mutation des gènes dhfr et dhps Tableau XVIII : Répartition des isolats dhfr mutants dans la population des sujets traités à la SP et dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue Tableau XIX : Répartition des isolats dhps mutants dans la population des sujets traités à la sulfadoxinepyriméthamine et dans la poppulation des isolats à sensibilité in vitro connue Tableau XX : Chimiosensibilité et profil génétique (dhfr-ts et dhps) des isolats de P. falciparum Tableau XXI : Résultats de la surveillance de la chimiorésistance de P. falciparum dans quelques pays africains Tableaux en annexes Tableau i : Sujets ayant un ETP ou une RCPA lors du test de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine et de la sulfadoxine-pyriméthamine Tableau ii : CI 50 des isolats de P. falciparum résistants à la chloroquine (CQ) et à la pyriméthamine Tableau iii : Nature des isolats après PCR-RFLP du gène dhfr de P. falciparum Tableau iv : Acides aminés de la PFCRT, DHFR et DHPS des isolats de P. falciparum Tableau v : Acides aminés de la PFMDR-1 des isolats de P. falciparum Figures Figure 1: Répartition des réponses cliniques et parasitologiques aux antipaludiques Figure 2 : Sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine, à la pyriméthamine et à la quinine Figure 3 : Répartition des isolats selon les génotypes Figure 4 : fréquence de mutation des codons des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr

10 10 RESUME Le paludisme, infection parasitaire mortelle dans sa forme grave, est très répandu en zone intertropicale où il sévit de façon endémique. Le traitement de cette pathologie est rendu difficile ces dernières années à cause de l'émergence des souches résistantes de P. falciparum, agent majoritairement causal du paludisme en Afrique subsaharienne, aux antipaludiques usuels (amino- 4-quinoléines, antifoliques et antifoliniques) accessibles à la plupart des familles à revenu modeste. Depuis la constatation en 1986 des premiers cas de résistance du parasite en Côte d'ivoire, relativement peu d'études ont été consacrées à l'évaluation de la chimio-résistance de P. falciparum dans ce pays. Il nous a donc paru nécessaire de mettre en place un système de surveillance de la résistance de P. falciparum aux antipaludiques au moyen des tests d'efficacité thérapeutique, in vitro et moléculaires, basés sur l'évaluation des marqueurs génétiques de la résistance aux antipaludiques. Le test d'efficacité thérapeutique a concerné la chloroquine (CQ) et la sulfadoxinepyriméthamine (SP) selon le protocole de l'oms de 14 jours de suivi, deux années consécutives pour chaque médicament. La classification des réponses au traitement s'est faite selon le nouveau protocole de l'oms 2002, en termes d'échec thérapeutique précoce (ETP), tardif (ETT) et de réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA). Dans l'étude in vitro, les isolats de P. falciparum prélevés des sujets atteints de paludisme ont été mis en culture en présence de concentrations variables d'antipaludiques (chloroquine, pyriméthamine, quinine). Pour chaque isolat mis en culture, nous avons déterminé sa sensibilité à chaque molécule en fonction de la concentration inhibitrice 50 % (CI 50 ). Le seuil de résistance varie selon qu'il s'agit de la chloroquine, 100 nm ; de la pyriméthamine (PYR), 100 nm ; de la quinine (QU), 800 nm. À l'exception de la chloroquine, les seuils de résistance n'ont pas encore été validés et restent arbitraires. Les techniques de biologie moléculaire offrant de nouvelles possibilités de recherche en parasitologie, l'approche plus fondamentale basée sur l'évaluation des supports génétiques de la résistance a été

11 11 réalisée après extraction de l'adn plasmodial et l amplification par PCR des gènes pfcrt, dhfr, dhps et pfmdr1. La digestion enzymatique ou RFLP à l'aide d'endonucléases spécifiques Apo I pour le codon 76 du gène pfcrt, et Alu I, Bsr I et Scr FI pour le codon 108 du gène dhfr ont permis d'évaluer rapidement sur un grand nombre d'isolats la proportion de parasites sauvages et mutants. Le séquençage des fragments d'adn des gènes dhfr, dhps, pfmdr-1 de chaque isolat de P. falciparum a été réalisé après purification de l'amplifiat et a permis de rechercher d'éventuelles nouvelles mutations en plus des mutations habituelles impliquées dans la résistance de P. falciparum aux antipaludiques. Les résultats du test de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine ont révélé 44,6 % d'échecs thérapeutiques dont 21,7 % d'échecs thérapeutiques précoces et 22,9 % d'échecs thérapeutiques tardifs contre 55,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates. Les nombreux cas d'échecs thérapeutiques tardifs sont répartis en échecs parasitologiques tardifs (19,3 %) et en échecs cliniques tardifs (3,6 %). En ce qui concerne la sulfadoxine-pyriméthamine, 23,6 % d'échecs thérapeutiques contre 76,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates ont été observés. La différence entre les pourcentages d'échecs thérapeutiques à la chloroquine et à l association sulfadoxine-pyriméthamine est significative : pour χ 2 = 5,6 ; ddl = 1 ; p = 0,02. Par ailleurs, aucun cas d'échec thérapeutique tardif à la sulfadoxine-pyriméthamine (incluant les échecs parasitologiques tardifs) n'a été observé dans cette étude. L'étude de la chimio-sensibilité in vitro a révélé quant à elle, 63,8 % d'isolats chloroquino-sensibles (CQ-S) et 36,2 % d'isolats chloroquinorésistants (CQ-R). La classification arbitraire des réponses in vitro à la pyriméthamine en sensible : en dessous de 100 nm ; résistance modérée : entre 100 et 2000 nm ; forte résistance : plus de 2000 nm, a donné 8 % d'isolats sensibles, 53 % d'isolats modérément résistants et 39 % d'isolats hautement résistants. Il n'existe aucune différence significative entre le groupe des isolats chloroquino-résistants et des isolats hautement résistants à la pyriméthamine, (χ 2 = 0,09 ; ddl = 1 ; p = 0,76). Aucun isolat quinino-résistant n'a été mis en évidence dans cette étude. L'analyse du

12 12 polymorphisme des fragments d'adn des isolats de P. falciparum a révélé 100 % d'isolats K76T chez les enfants ayant un échec thérapeutique à la chloroquine et 71 % d'isolats K76T au sein des isolats chloroquino-résistants. Cependant, 12 % des enfants ayant une réponse clinique et parasitologique adéquate à la chloroquine portaient également des isolats K76T. Les mutations affectant les gènes dhfr et dhps ont concerné respectivement 26,4 % et 93,4 % des isolats étudiés. Si les isolats dhfr mutants étaient portés par 86 % des enfants ayant un échec thérapeutique à la sulfadoxine-pyriméthamine, les mutants dhps étaient présents chez 100 % de ces enfants. 85 % de ces isolats dhfr mutants étaient, soit hautement résistants, soit avaient une résistance modérée à la pyriméthamine. La mutation au niveau du gène pfmdr-1 n'a concerné que 79 % des fragments d'adn des isolats étudiés. Aucune corrélation n'a été formellement établie entre les mutations affectant le gène pfmdr-1 et la résistance des isolats à la quinine dans cette étude. Les coefficients de kappa déterminés pour rechercher la concordance entre les différents tests (in vivo, in vitro, profil génétique des gènes) montrent d'une part un très bon accord entre les tests in vivo à la chloroquine et le profil génétique de pfcrt (kappa = 0,9), un accord modéré entre le test in vivo à la sulfadoxine-pyriméthamine et le test moléculaire du gène dhfr-ts (kappa = 0,59), d'autre part, une très mauvaise concordance lorsqu'il s'agit du gène pfmdr-1 et l'efficacité thérapeutique de la chloroquine (kappa < 0), puis entre le test in vitro à la pyriméthamine et le profil génétique de dhps (kappa = 0,28). Ces résultats concernant la chimiorésistance de P. falciparum reposent le problème de l'utilisation de la chloroquine et de la sulfadoxine-pyriméthamine comme médicament de première et de deuxième intention en Côte d'ivoire en général, et à Abidjan en particulier. En effet, le nombre d'échecs thérapeutiques précoces et d'échecs cliniques tardifs (25,3 %) observés avec la chloroquine dans cette zone est le même que celui obtenu en 2000 (26,9 %) dans le centre de la Côte d'ivoire. Bien qu'il n'ait pas été observé d'échec parasitologique tardif avec la sulfadoxine-pyriméthamine, ce qui permet une bonne récupération du statut hématologique normal des enfants, le nombre d'échecs

13 13 thérapeutiques (23,6 %) à ce médicament n'est pas loin de 25 % (taux d'échec permettant de décider d'un changement de médicament). De ce fait, son utilisation comme potentiel suppléant de la chloroquine dans cette zone n'augure pas de lendemain meilleur. En définitive, ces résultats qui prennent en compte les différents aspects de la surveillance de la résistance serviront de base de données au programme national de lutte contre le paludisme (PNLP) en Côte d'ivoire pour une meilleure utilisation et une rationalisation des antipaludiques usuels dans le district d'abidjan. Ils vont conduire également à faire un suivi de la chimio-résistance dans les autres régions du pays. Eu égard aux difficultés en termes de coût et de personnels qualifiés pour la réalisation des tests in vitro et moléculaire tout aussi utiles pour surveiller les variations de la sensibilité de P. falciparum aux antipaludiques et offrir un système d'alerte précoce, il conviendrait pour le PNLP en collaboration avec les Institutions de recherche locales et sous régionales qui en ont les compétences de conjuguer leurs efforts vers une centralisation de la recherche sur la nature des isolats en circulation Mots clés : Abidjan (Côte d'ivoire), Dihydrofolate réductase (dhfr), Dihydroptéroate synthétase (dhps), pfcrt, pfmdr-1, Epidémiologie, Plasmodium falciparum, Résistance aux antipaludiques

14 INTRODUCTION 14

15 15 I-1 Définition et historique du paludisme I-1.1 Définition Infection parasitaire mortelle dans sa forme grave, le paludisme ou malaria tiré de l italien «mal-aria» qui veut dire mauvais air est une parasitose due à un protozoaire. Il est transmis à l homme par la piqûre d un moustique du genre Anopheles et se caractérise par l apparition d un accès fébrile provoqué par l hémolyse due à la présence et au développement du parasite dans les hématies. L'agent pathogène de cette érythrocytopathie est un eucaryote unicellulaire appartenant à l'embranchement des Apicomplexa, à la classe des Aconoidasida, à l'ordre des Haemosporida, à la famille des Plasmodiidae et au genre Plasmodium (Levine, 1988). Les plasmodies parasitent divers hôtes dont les reptiles, les oiseaux, les mammifères (rongeurs, primates) et sont transmis par des Culicidés telles que Anopheles pour les Plasmodiums de mammifères et Aedes pour les Plasmodiums d'oiseaux dans les conditions naturelles. En Afrique subsaharienne, les principaux vecteurs du paludisme sont Anopheles funestus, An. arabiensis et An. gambiae (Carnevale et al., 1984 ; Mouchet et al., 1993). I-1.2 Historique L origine géographique de cette maladie est controversée et se perd dans la nuit des temps. Si pour certains auteurs, l Afrique tropicale serait le berceau de cette affection (Knell, 1991), déjà, au deuxième siècle avant Jésus-Christ, les grecs et les romains montraient qu il existait une relation entre les fièvres intermittentes et la proximité de terrains marécageux. De cette façon, Hippocrate et Galien seront les premiers à décrire les symptômes de la fièvre tierce bénigne et de la fièvre quarte (Ambroise-Thomas et al., 1984 ; Brasseur et al., 1987). L agent pathogène de cette maladie est un hématozoaire polymorphe (OMS, 1987) qui ne fut découvert que vers la fin du XIX e siècle (1880) par un médecin français du nom d'alphonse Laveran. Il a été nommé Oscillaria malariae puis Heamanoeba malariae. Successivement, furent mis en évidence après le sous-genre P. falciparum (Welch, 1897) qui n'a qu'une seule génération de

16 16 schizontes exoérythrocytaires et dont les gamétocytes sont falciformes, le sous-genre Plasmodium qui comprend P. vivax (Grassi et Feletti, 1890), P. malariae (Laveran, 1881) et P.ovale (Stephens, 1922). L hypothèse d une transmission par la femelle d'un moustique du genre Anopheles a été d'abord émise puis, en 1887 Ronald Ross déclare que l anophèle était le vecteur du paludisme. Enfin, les travaux de Grassi vont confirmer cette déclaration en Cette même année, Batista et Bignami décrivirent le cycle de reproduction du Plasmodium et en 1900, Schandinu en nomme les différents stades. Les ravages dus au paludisme pendant la Première Guerre mondiale vont susciter la recherche et la mise à disposition de nouvelles molécules antipaludiques telles que les dérivés des amino-8- quinoléines, des amino-9-acridines et des amino-4-quinoléines dont la plus représentative est la chloroquine (Bruce-Chwatt et al., 1984 ; Bryskier et Labro, 1988). Cette molécule sera largement utilisée aussi bien en prophylaxie qu en traitement curatif. En 1950 l OMS lance un programme d éradication du paludisme à l échelle mondiale : «le monde uni contre le paludisme». Ce cri d'alarme va permettre le développement de nombreux antipaludiques de synthèse dont les plus connus sont l'amodiaquine, la pyriméthamine, le cycloguanil et le proguanil. En 1971 l activité antiplasmodiale d un extrait d Artemisia annua L. dont le principe actif est l artémisinine sera mis en évidence (Bryskier et Labro, 1988). Malheureusement, malgré le nombre relativement considérable d antipaludiques disponibles depuis l identification et l isolement des deux alcaloïdes fondamentaux des écorces de quinquina (quinine et cinchonine) en 1820 par Pelletier et Caventou, l OMS met fin au programme mondial d éradication du paludisme à cause de son insuccès car l'enthousiasme thérapeutique est menacé par l apparition dès le début des années 60 des premiers cas de résistance à la chloroquine. Suite à l'échec de ce programme, ainsi qu'à de nombreux cas de paludisme parmi les troupes américaines envoyées au Vietnam, un vaste programme de criblage a été entrepris par l'armée américaine et va permettre de découvrir la méfloquine et l'halofantrine qui seront plus tard développées par les firmes pharmaceutiques.

17 17 I-2 Maladie et symptômes I-2.1 Épidémiologie du paludisme (Golvan, 1983). La simultanéité des événements suivants concourt à l'apparition du paludisme : i- La présence d hommes porteurs de gamétocytes de Plasmodium dans le sang. En général, les enfants sont porteurs de gamétocytes plus fréquemment que les adultes. L enfant est donc épidémiologiquement considéré comme meilleur «réservoir» de parasites que l adulte. ii- L existence d une population d anophèles vecteurs qui, lors de leur repas sanguin sur l homme impaludé, puisent ces gamétocytes et assurent la multiplication sexuée du parasite. iii- La présence d hommes réceptifs au Plasmodium, en particulier les enfants autochtones et les immigrants en date récente. Les vecteurs infectant inoculeront à l homme sain en le piquant, les sporozoïtes, formes infestantes des plasmodies. iv- Au rang des conditions écologiques nécessaires à la vie de l anophèle et à celle du Plasmodium qu il héberge, il faut citer l exigence thermique. En outre, comme pour toute maladie transmissible, il faut qu il soit atteint un seuil d épidémisation, c est-à-dire une densité critique de réservoir de parasites d anophèles et de sujets réceptifs pour que le paludisme puisse paraître et se manifester ensuite comme cas sporadiques ou cas d épidémies vraies. I-2.2 Symptomatologie (Danis, 1991 ; Gilles, 1991) Les manifestations cliniques du paludisme sont exclusivement liées à la schizogonie endoérythrocytaire. Les principaux signes que sont la fièvre, l anémie et le subictère sont dus à l éclatement des hématies et des rosaces avec libération du pigment malarique. L'expression et la gravité de la maladie dépendent du parasite (espèce plasmodiale et densité parasitaire) et de l état de l individu (prémunition). Ainsi, ces manifestations vont de l'accès palustre non compliqué à l'accès palustre grave. Selon les cas, il est possible de distinguer le paludisme de primo-invasion, l'accès palustre intermittent, l'accès pernicieux ou neuropaludisme, le paludisme viscéral évolutif et la fièvre bilieuse hémoglobinurique.

18 18 Le paludisme de primo-invasion est caractérisé par une fièvre allant de 39 à 40 C qui s accompagne de myalgies et de céphalées frontales. Cette fièvre diminue d intensité (frisson et sueur) après quelque temps. Il est également possible d'observer une hépatomégalie, un subictère et un herpès labial. Bien traitée, la guérison est sans séquelle. Quand la prise en charge est mal conduite, le paludisme de primo-invasion peut évoluer vers l accès palustre intermittent, le neuropaludisme ou le paludisme viscéral évolutif. L'accès palustre intermittent est annoncé par des prodromes tels que les céphalées, les nausées, l asthénie et l herpès labial. Il est caractérisé par les stades de frissons, de chaleur et de sueur. En cas de mauvaise prise en charge, l accès palustre intermittent peut évoluer vers l accès pernicieux ou vers le paludisme viscéral évolutif. L'accès pernicieux ou neuropaludisme est dû à P. falciparum et se caractérise par un coma stade II ou plus avec des convulsions généralisées et répétées, un syndrome de détresse respiratoire aiguë, un œdème pulmonaire, un collapsus circulatoire, une hémoglobinurie, une coagulation intravasculaire disséminée. Au plan biologique, l'accès pernicieux est caractérisée par une anémie grave (sévère), une hypoglycémie, une acidose sanguine, une hyperlactatémie ; la multiplication et la cytoadhérence des hématozoaires sont intenses dans les capillaires cérébraux (WHO, 2000). Le paludisme grave ou compliqué peut conduire à la mort. Son évolution dépend de la rapidité et de la qualité de la prise en charge thérapeutique. Il est fatal en 2-3 jours, voire quelques heures, si le traitement est mal ou non conduit. Le paludisme viscéral évolutif survient chez un sujet vivant en zone endémique et insuffisamment ou non prémuni, mais se soumettant à une chimioprophylaxie incorrecte et se faisant piquer par des anophèles femelles. L évolution de la manifestation clinique dépend du traitement. Bien traité, la guérison est sans séquelle ; dans le cas contraire, ce type de paludisme évolue vers l accès pernicieux.

19 19 La fièvre bilieuse hémoglobinurique est une réaction immuno-allergique grave qui survient classiquement chez un sujet qui se soumet irrégulièrement à un traitement ou probablement une prophylaxie aux sels de quinine (Djibo et al., 2000 ; Khandelwal et al., 2001). Plus récemment, la fièvre bilieuse hémoglobinurique a été rapportée après l'administration de l'halofantrine (Vachon et al., 1992 ; Orlando et al., 1996 ; Bruneel et al., 2002). Dans les zones de chloroquinorésistance, cette fièvre est de plus en plus rencontrée (Djibo et al., 2000 ; Bruneel et al., 2002). I-3 Diagnostic biologique En zone d endémie palustre, le traitement du paludisme est le plus souvent donné à la suite d un diagnostic clinique où le symptôme majeur demeure la fièvre. Ce type de diagnostic est pleinement justifié dans la mesure où la plupart des centres de santé sont dépourvus de laboratoire et la majorité de la population est porteuse asymptomatique (WHO, 2000). Néanmoins, si le traitement présomptif de la fièvre apporte une satisfaction surtout chez les enfants de moins de cinq ans, confirmer le diagnostic clinique par un examen biologique permet de réduire l'utilisation des antipaludiques dans le traitement injustifié pour des fièvres non palustres (Yavo et al., 2002). En effet, la mise en œuvre des programmes de lutte contre le paludisme intègre la recherche d'un diagnostic précoce et d'un traitement efficace. La clinique de cette affection n'étant pas toujours évocatrice d'un paludisme, une confirmation biologique est souvent nécessaire. Ainsi, le diagnostic du paludisme comprend les techniques de diagnostic indirect et direct. Les techniques de diagnostic indirect consistent à rechercher la présence d anticorps dans le sérum du malade. Elles sont indicatives d'une infection antérieure et sont par conséquent sans valeur diagnostique réelle dans les zones d'endémie palustre. Parmi ces techniques, il existe l immunofluorescence indirecte, l hémagglutination passive, le test Elisa (Mackey, 1982 ; Ambroise- Thomas et al., 1993 ; Mason et al., 2002). Quant au diagnostic direct, il permet la mise en évidence du parasite. Ce sont la goutte épaisse, le frottis sanguin mince (OMS, 1994), le quantitative buffy coat test (QBC) (Yavo et al.,

20 ), le test parasight, le test optimal. Bien que la plus sensible des techniques de diagnostic, la PCR demande une longue procédure, des équipements et des réactifs spécialisés et coûteux. La cible est constituée du matériel génétique du parasite (WHO, 2000). De toutes ses techniques, l'association goutte épaisse / frottis sanguin demeure la bonne alternative (Thellier et al., 2002) pour le diagnostic biologique du paludisme dans les pays en développement et est surtout recommandée pour le suivi des sujets inclus dans le protocole OMS de l'efficacité thérapeutique des antipaludiques. I-4 Antipaludiques Depuis les découvertes empiriques, il y a plusieurs siècles, de l activité de Artemisia annua L. (Warburton, 1984) en Chine et de l écorce de quinquina sur les «fièvres de marais» en Amérique du Sud, jusqu à nos jours, plusieurs centaines de milliers de médicaments antipaludiques ont été étudiés. À l heure actuelle, moins d une dizaine de ces produits sont disponibles, témoignant de la difficulté d une recherche qui s'avère peu productive et du génie évolutif des plasmodies qui résistent de plus en plus aux médicaments. Dans cette situation, il convient de bien connaître les quelques produits encore utilisables afin de tirer le meilleur profit de leur qualité. Il est possible de classer les antipaludiques en fonction de leur nature chimique (amino-4-quinoléines, amino-8-quinoléines, amino-alcools, sesquiterpènes lactones ), de leur point d impact sur l un des stades du cycle évolutif du parasite (schizonticides, gamétocytocides, sporontocides) et en fonction de leur origine (naturelle, synthèse). De façon générale, les antipaludiques jusque-là mis à disposition par les firmes pharmaceutiques sont tous des schizonticides sanguins, actifs sur les formes asexuées du parasite. Néanmoins, certains exercent une action inhibitrice sur les gamétocytes immatures de P. falciparum (Bryskier et Labro, 1988). Les schizonticides intra-érythrocytaires peuvent être divisés en trois classes selon leur lieu d'action : les lysosomotropes, les antimétabolites et les antibiotiques.

21 21 I-4.1 Lysosomotropes L efficacité sélective de ces antipaludiques est le fait de leur concentration très élevée atteinte dans les hématies parasitées par rapport aux hématies non parasitées. Ils agissent sur le processus ou les produits de digestion de l'hémoglobine (Warhurst et al., 2002). Ce sont essentiellement les amino- 4-quinoléines, les bases de mannich, les amino-alcools, et les dérivés de l'artémisinine. Les amino-4-quinoléines représentent une famille de médicaments dont le plus utilisé est la chloroquine, antipaludique majeur qui a révolutionné le traitement du paludisme en Afrique. Ainsi, par son efficacité, sa tolérance exceptionnelle et sa moindre toxicité par rapport aux autres molécules de la même famille, la chloroquine a pratiquement éclipsé pendant longtemps les autres molécules antipaludiques découvertes dans les années Malheureusement, elle est confrontée à une résistance confirmée des hématozoaires du paludisme du fait de sa moindre accumulation à l intérieur des érythrocytes parasités par les plasmodies résistants. Les bases de mannich comprennent l'amodiaquine, l'amopyroquine et la pyronaridine. L amodiaquine est indiquée dans les cas de chloroquino-résistance. Elle est rapidement et presque totalement absorbée et est entièrement métabolisée dans le foie pour donner un métabolite actif, le monodeséthylamodiaquine. Néanmoins, tout comme la chloroquine, elle entraîne des troubles digestifs (nausées, vomissements), oculaires, visuels, cutanés (prurit, urticaire). De plus l amodiaquine provoque une agranulocytose et une hépato-toxicité. Elle est donc contre-indiquée en prophylaxie. Quant à la pyronaridine, elle a été synthétisée en Chine en 1970 (Chang et al., 1992 ; Zoguéreh et Delmont, 2000) et dérive à la fois de la quinacrine (mépacrine) et de l'amino-4- quinoléine (amodiaquine). Les CI 50 sur les souches sensibles et chloroquinorésistantes sont comparables à celle de la méfloquine (Basco et al., 1999). Néanmoins sa biodisponibilité est faible (35 %) (Debaert, 2000). Les amino-alcools regroupent des composés à structures chimiques diverses. Ils ont en commun un radical carbinol ou méthanol. La connaissance de la structure chimique de la quinine a

22 22 servi de modèle au développement et à la synthèse des aryl-amino-alcools (Basco et al., 1994 ; Ridley et Hudson, 1998). Ces derniers comprennent essentiellement les quinoléines méthanols (méfloquine), les phénanthrènes méthanols (halofantrine) et le luméfantrine. L artémisinine est un endopéroxyde naturel issu de la pharmacopée chinoise. La présence du groupe peroxy est essentielle pour l activité antipaludique de l artémisinine et ses dérivés actifs dont la dihydro-artémisinine qui est une forme lactone ou hémiacétal des sesquiterpènes. Elle possède une activité antipaludique élevée en se concentrant dans les érythrocytes parasités. En dehors de ce dérivé, il en existe d'autres tels que l artéméther qui est un dérivé méthyl éther qui s obtient par réduction du carbonyle lactone, l artélinate (acide artélinique), l artééther (dérivé éthyléther) et l artésunate (acide artésunique). Cette dernière molécule résulte de la réduction du lactone, ce qui permet la formation d éther et d ester (Basco et al., 1994). Les schizonticides à action rapide sont le plus souvent utilisés dans le traitement des phases aiguës du paludisme, soit seuls, soit en association avec d autres schizonticides. I-4.2 Antimétabolites (Lau et al., 2001) Ils regroupent les antifoliques, les antifoliniques et les analogues de l'ubiquinone. Les antifoliques et les antifoliniques ne s accumulent pas directement dans le plasma après absorption, mais se lient aux tissus, aux protéines et aux lipides de l organisme. Cette caractéristique leur confère un effet prolongé. Les antifoliques sont les sulfamides et les sulfones. Les sulfamides sont des dérivés du sulfanilamide ou de l amide-4-aminobenzène acide sulfonique. Les deux composés actuellement utilisés comme antipaludiques sont la sulfadoxine et le sulfalène. Ces molécules peuvent entraîner une agranulocytose et une réaction cutanée pouvant aller d un urticaire à une manifestation plus grave réalisant le syndrome de Stevens-Johnson. De ce fait, elles sont contre-indiquées chez le sujet hypersensible, les prématurés et le nouveau-né pendant le premier mois et chez la femme enceinte pendant les trois premiers mois.

23 23 Les antifoliniques sont représentés par les biguanides et leurs dérivés. Les plus utilisés en thérapeutique antipalustre sont le proguanil et la pyriméthamine. Leur bonne activité antipaludique est liée à la présence du noyau chlorophényl et au groupe isopropyle pour le proguanil et à la présence du substituant 5-p-chlorphényl et du groupe éthyle en position 6 pour la pyriméthamine. Le proguanil et ses dérivés sont d absorption rapide mais d élimination lente. Quant aux analogues de l'ubiquinone, ils sont représentés par l'hydroxynaphtoquinone dont l'atovaquone. C'est un produit nouvellement reconnu comme possédant des propriétés antipaludiques (Baggish et Hill, 2002) en plus de son indication dans le traitement de la pneumocystose et de la toxoplasmose cérébrale. Il est actif sur tous les stades du cycle du parasite et sur les souches de P. falciparum résistantes ou non à la chloroquine. L atovaquone est utilisée en association avec le proguanil (Malarone ) afin de réduire les taux de rechutes relativement élevés (30 %). Les effets secondaires qui ont été rapportés sont essentiellement des troubles digestifs (nausées, vomissements), des douleurs abdominales et des céphalées (Laronze et laronze, 2000). I-4.3 Antibiotiques (Zoguéreh et Delmont, 2000) Les antibiotiques les plus utilisés en thérapeutique du paludisme sont les cyclines et les macrolides. Ces antibiotiques sont actifs sur les formes sanguines asexuées et sur les formes exoérythrocytaires primaires de P. falciparum. Ils sont utilisés dans les régions où la sensibilité de P. falciparum à la quinine est diminuée (Asie du Sud-Est) (Bourgeade et Delmont, 1998). Ces antipaludiques sont représentés essentiellement par la tétracycline (macrolides) et la doxycycline (cyclines). La tétracycline est toujours utilisée en thérapeutique en association avec la quinine à cause de son action lente. Quant à la doxycycline, elle est utilisée en chimioprophylaxie chez le sujet intolérant ou en cas de contre-indication à la méfloquine et projetant un voyage de courte durée dans une zone de méfloquino-résistance (Baudon, 1999). Elle est active aussi bien sur les souches multirésistantes que sur les souches chloroquinosensibles. Toutefois, les cyclines sont contreindiquées chez la femme enceinte et le jeune enfant de moins de 11 Kg ou de moins de 8 ans.