leucémie lymphoïde chronique

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1 la leucémie lymphoïde chronique S.Taoussi, M.T. Abad Service hématologie, EHS ELCC Blida Ce travail a été réalisé au laboratoire hématologie du CAC Blida avec le soutien du CMNG et du laboratoire de recherche sur les maladies génétiques ( directeur professeur Y. Oukaci)

2 Introduction La cytogénétique moléculaire représentée par la FISH est née de la jonction entre la biologie moléculaire et la cytogénétique conventionnelle. Le seuil de sensibilité de la FISH est intermédiaire entre ces deux disciplines. Le pouvoir de résolution de la FISH (dans certaines conditions Le pouvoir de résolution de la FISH (dans certaines conditions moins de 1Kb) permet une analyse fine de la structure des chromosomes.

3 Introduction La cytogénétique moléculaire hématologique est l une des disciplines qui a le plus évolué qualitativement depuis ces trois dernières décennies. Ainsi, 75 % des anomalies cytogénétiques acquises observées au cours des cancers concernent les hémopathies malignes.

4 Aujourd hui hui, l application judicieuse des méthodes de cytogénétique moderne à leur tête l hybridation in situ fluorescente (FISH), apporte un complément déterminant au diagnostic, au pronostic et aux thérapeutiques ciblées dans les hémopathies malignes.

5 Les techniques d'hybridation in situ reposent sur la capacité des fragments d ADN marqués par un ou plusieurs fluorochromes de s hybrider avec un ADN complémentaire Une sonde dénaturée é (ADN simple brin marqué) en solution peut s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible (préparation chromosomique dénaturée sur lame) grâce à la complémentarité des bases nucléotidiques. Les hybrides non spécifiques et les molécules de sonde non hybridées sont éliminés par lavages. Les hybrides spécifiques sont révélés par immunofluorescence.

6 Un microscope à épi fluorescence équipé de filtres appropriés aux nombreux fluorochromes disponibles permet l analyse des mitoses et / ou des noyaux inter phasiques. Les sondes émettent une lumière lorsqu'elles sont excitées par une longueur d'onde donnée, transmise par des filtres appropriés avec plusieurs bandes passantes permettant de détecter plusieurs couleurs durant la même observation. Une caméra numérique haute résolution de capture est couplée au microscope ainsi qu un logiciel d analyse.

7 Le matériel servant à la réalisation d une FISH en hématologie est varié, il peut porter sur : un prélèvement de sang périphérique i suc médullaire un suc ganglionnaire des liquides biologiques riches en cellules ( liquide d ascite, LCR, liquide pleural).

8 L application de cette méthode est réalisée au laboratoire d hématologie du CAC Blida : - à titre diagnostique dans les LMC - dans le cadre pronostique: - dans les LLC - le myélome multiple - les leucémies aigues - les lymphomes non hodgkiniens

9 Nous présentons les résultats de cette procédure d analyse sur 29 patients atteints de Leucémie Lymphoïde Chronique.

10 Méthodes I Pour chaque patient, nous réalisons une FISH inter phasique et métaphasique en utilisant un panel de sondes dédiées à cette pathologie (sondes KREATECH) ) : - SE 12 (D12Z3). - DLEU (13q14)/13q34. - ON p53 (17p13)/ ATM (11q22). - ON 6q21 / SE 6.

11 Méthodes II Les différentes étapes suivantes sont réalisées Culture cellulaire,blocage des mitoses,sortie de culture. Choc hypotonique Fixation des culots cellulaires Étalement des lames Prétraitement Application des sondes Dénaturation à 75 et hybridation à 37 (thermobrite) Lavages des lames Contre coloration au DAPI Lecture au microscope à épifluorescence A partir de l étape prétraitement t le travail se fait dans une chambre noire.

12 centromère du chromosome 12 : CEP 12 Laboratoire hématologie CAC Blida K.B ; LLC : CEP 12 Laboratoire hématologie B.M ; LLC : CEP 12

13 : CEP 12 Laboratoire hématologie CAC Blida O.M ; LLC : CEP 12 Laboratoire hématologie CAC Blida H.M ; LLC : CEP 12 : Tri 12

14 : TRI 12 Laboratoire hématologie CAC Blida A. L ; LLC : Tri 12 Laboratoire hématologie CAC Blida A.L ; LLC : Tri 12

15 : 13q14/ 13q34(q ter) Laboratoire hématologie B.B ; MM : 13q14 normale

16 : del 13q14 Laboratoire hématologie CAC Blida B.E ; LLC : Del 13 biallélique Laboratoire hématologie CAC Blida B.L ; LLC : Del 13 isolée

17 : ATM- P53 Laboratoire hématologie CAC Blida R.M ; LLC : ATM P 53 Laboratoire hématologie CAC Blida K. B; LLC : ATM P 53K.

18 Leucémie Lymphoïde Chronique : del ATM ( 11q22) Laboratoire hématologie CAC Blida K.D ; LLC : Del ATM

19 Leucémie Lymphoïde Chronique : del P 53 Laboratoire hématologie CAC Blida G.R ; LLC : del P 53 Laboratoire hématologie G.R ; LLC : del. P 53

20 : 6q21/SE6 Laboratoire hématologie CAC Blida O.M ; LLC : 6q21

21 : del 6 q21 Laboratoire hématologie CAC Blida A.M ; LLC del 6q21 Laboratoire hématologie CAC Blida H.F ; LLC del 6q21

22 Nous présentons les résultats de cette procédure d analyse sur 29 patients atteints de Leucémie Lymphoïde Chronique.

23 Résultats Les 29 cas de LLC sont classés selon la classification de Binet en : - stade A : 04 -stade B : 09 - stade C : 16

24 Sur ces 29 cas, nous relevons : - 8ti trisomies i 12d dont t6i isolées et t2 associées. - 9 délétions 13q14 isolées dont deux bialléliques et deux bi clonales - 3 délétions 13q14 associées à d autres anomalies: +12, del 6q21 del p53) - 2 délétions ATM (11q22.1) isolées - 2 délétions ATM (11q22.1) associées à une del 6q21 dans un cas et à une trisomie 12 dans un cas - 2 délétions P53 associées ( del 6q21,del 13q14) - 3 délétions 6q21 associées aux délétions( ATM, P53 et 13q14) - Aucune anomalie dans 04 cas.

25 del 13q 50% bon pronostic si isolée mais importance pronostique variable selon hétérozygote ou homozygote isolé ou associé tri 12 15% Associé à cytologie atypique del 11q 10 % très mauvais pronostic, Associé à des formes tumorales, Ré évolutivité rapide après traitement del 17p <10% très mauvais pronostic, p53 non fonctionnelle, résistance à la fludarabine Réévolutivité rapide après traitement Dr Bruno CAZIN, CHRU Lille Octobre 2008

26 Commentaires - Les délétions ATM sont survenues dans les stades B et C. - Les 2 délétions p53 sont survenues dans les stades C. - Les 3 del 6 q21 au stade C. - Dans notre série limitée de patients : les anomalies exprimés sont dans l ordre suivant: - La délétion 13q14 = 41,4% (isolée =31%) - La trisomie 12 = 27,5% - La délétion ATM = 13,8% - La délétion 6q21 = 10,3% - La délétion p53 = 6,8% Par rapport à la littérature,nos malades expriment presque 2 fois la trisomie 12 (15%); un peu plus de del ATM (10%) et de 6q21 (7%),la délétion p53 est comparable.

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