Diagnostic des infections bactériennes : quelle place pour la biologie moléculaire?

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1 Diagnostic des infections bactériennes : quelle place pour la biologie moléculaire? Dr Ghislaine Descours Laboratoire de Bactériologie, Centre de Biologie Est DUCIV, 15 octobre 2014

2 Objectifs! Connaître le principe des techniques moléculaires PCR universelle versus PCR spécifique PCR en point final versus PCR en temps réel! Comprendre le délai de rendu des résultats! Savoir cibler une demande de PCR Apport par rapport aux autres techniques en Bactériologie Quand? Quoi? Comment?! Avoir un regard critique sur la prescription & les résultats

3 Méthodes diagnostiques en bactériologie Culture TROD Tests rapides à orientation diagnostique Biologie moléculaire

4 Culture! Avantages Examen direct préalable Sensibilité théorique : 1 UFC Isolement des souches " Sensibilité aux antibiotiques " Recherche de facteurs de virulence " Typage, enquêtes épidémiologiques Coût limité! Limites Bactéries nécessitant un milieu spécifique, fragiles, intracellulaires Bactéries à croissance lente : retard au diagnostic Infections décapitées par une antibiothérapie préalable

5 TROD! Réactions immunologiques Tests immunochromatographiques, ELISA, agglutination, fluorescence!! Avantages Délai de réalisation < 1h Ajustement thérapeutique immédiat! Limites Dépendance du développement par fournisseurs Sensibilité / spécificité Utilisation détournée sur des prélèvements profonds

6 Biologie moléculaire! Avantages Bactéries à croissance lente, difficilement ou non cultivables Non influencée par antibiothérapie / transport! Limites Contraintes techniques (locaux dédiés) Délais incompressibles Mais développement de techniques «clés en main» " Pas de problématique de locaux ou de délais " Coût élevé

7 Légionellose Culture : 4 à 10 j Milieux spécifiques Enquête épidémio. Ag urinaire : 1h Sensibilité : 90% L. pneumophila sg1 PCR spécifique : < 24h Détection de toutes les espèces Se < AgU si Lp1

8 Méningite à pneumocoque Culture : 24h Antibiogramme Recherche d Ag solubles : < 1h (si ED+) PCR spécifique < 24h Intérêt si antibiothérapie préalable

9 Biologie moléculaire en pratique Unité de Biologie moléculaire CHU, personnel dédié PCR maison ou trousses commerciales Unité conventionnelle CHG, personnel polyvalent Techniques clés en main

10 Principe des techniques moléculaires Détection et/ou identification d un ADN bactérien dans un prélèvement biologique PCR universelle Gène commun à toutes les eubactéries : ARN ribosomique 16S Sans a priori sur le résultat Identification par séquençage du produit de PCR en h PCR spécifique Gène amplifié ciblant une espèce, un genre, un génogroupe bactérien! Présomption clinique forte Résultat : positif / négatif en 24 h

11 PCR réalisées au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

12 Quel prélèvement?! Potentiellement tout type de prélèvement! PCR universelle Site initialement stérile Pas sur les prélèvements pour lesquels il existe des seuils de pathogénicité (urines, LBA!)! PCR spécifique Bactérie non commensale " Biopsie cutanée : pas de PCR spécifique Staphylococcus " Gorge : pas de PCR Streptococcus

13 Quelles conditions?! Recueil du prélèvement Liquide de ponction, pus, tissu, biopsie, sang! Bannir les écouvillons Volume " 200 µl Sang sur EDTA (héparine = inhibiteur) Ne rien ajouter (liquide, fixateur, milieu de transport!)! Nombre de prélèvements Conditions identiques à la culture " Multiplier le nombre de prélèvement en orthopédie " Culture et PCR sur un même prélèvement! Acheminement au laboratoire t ambiante, +4 C, -20 C

14 Du prélèvement au résultat!

15 Différentes étapes Prélèvement Lyse cellulaire + extraction d ADN manuelle ou automatisée Amplification et détection de l ADN amplifié Séquençage (PCR universelle) et analyse de la séquence Simultanée : heures Validation du résultat 10 min 4 heures 1 série quotidienne Après : PCR en point final 3 heures PCR en temps réel 1 heure

16 Polymerase Chain Reaction ADN cible : 1 copie Dénaturation Hybridation des amorces Elongation (dntp, polymérase) 30 à 40 cycles soit 2 30 à 2 40 copies

17 Détection de l ADN amplifié Détection en point final Gel migration Nombre de copies Détection en temps réel Marqueur fluorescent Cycle Seuil Cycle threshold (Ct) Quantité d ADN Nombre de cycles

18 Détection en point final! Gel migration des produits de PCR! Vérification de la taille attendue

19 Détection en temps réel! Reporter fluorescent SybrGreen E1"3&U(%)V) Liaison non spécifique à l ADN db 0671#")"%F) Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db # ADN sb) E1"3&U(%)V) 0671#")"%F) Economique et facile

20 Détection en temps réel! Reporter fluorescent SybrGreen Liaison non spécifique à l ADN db Sondes spécifiques Liaison spécifique des sondes à l ADN db Spécificité par amorces et température de fusion (1/2 ADN db # ADN sb) Economique et facile Multiplexage (! cibles) Coût plus élevé Développement plus délicat

21 La PCR universelle

22 L ARNr 16S! Codé en opéron! Nombre de copies du gènes variable en fonction de l espèce bactérienne (1 à 10)! Structure et fonction conservée chez toutes les bactéries! Pas de transfert horizontal! Nombreuses séquences déposées dans les bases de données

23 L ARNr 16S 2$$$$$$$$$$$$322$$$$$$$$$$$$422$$$$$$$$$$$$$522$$$$$$$$$$$$$622$$$$$$$$$$$$$$7222$$$$$$$$$$$$$$7322$$$$$$$$$$$$7422$$$$$7822$$$$9+$ Séquences conservées chez toutes les bactéries Amorces Séquences spécifiques d un genre / d une espèce Signature après séquençage du produit de PCR

24 L ARNr 16S <$462$9+$ :77$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$7;:2$ 2$$$$$$$$$$$$322$$$$$$$$$$$$422$$$$$$$$$$$$$522$$$$$$$$$$$$$622$$$$$$$$$$$$$$7222$$$$$$$$$$$$$$7322$$$$$$$$$$$$7422$$$$$7822$$$$9+$ Séquences conservées chez toutes les bactéries Amorces Séquences spécifiques d un genre / d une espèce Signature après séquençage du produit de PCR

25 Etape 1. PCR en point final! PCR Migration des produits de PCR Témoin négatif Patients Marqueur de poids moléculaire Témoin positif

26 Etape 2. Séquençage des positifs! Technique Big Dye Terminator! PCR avec produit de PCR + amorce + polymérase + dntp (3 OH) en compétition avec ddntp* interrupteurs (3 H) : ddatp, ddttp, ddctp, ddgtp Pool de brins d ADN de taille variable! Purification du produit de PCR! Électrophorèse capillaire

27 Etape 2. Séquençage des positifs! CTTGCACTGC! CTTGCACTGCG! CTTGCACTGCGA! CTTGCACTGCGAT! CTTGCACTGCGATT! CTTGCACTGCGATTA! CTTGCACTGCGATTAC Séquence ARNr 16S : CGATTAC Chromatogramme

28 Etape 3. Comparaison avec une base de données = alignement de la séquence! Le Bibi PQB BioInformatic Bacterial Identification Prokaryote Quick Identification https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibipqp/lebibipqp.cgi Incrémentée tous les 3 mois (GenBank) Informations contrôlées (espèce) : DSMZ database

29 Etape 4. Interprétation des séquences Identification de genre si > 97 % Identification d espèce si > 99 % (T : sequence type, TT : strain type, GenBank ID) Prevotella spp

30 Un abcès pulmonaire stérile en culture > 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis

31 Un abcès pulmonaire stérile en culture PCR spécifique Streptococcus (gène tuf) > 99% avec S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. porcorum, S. hyointestinalis Streptococcus gordonii

32 Un LCR stérile PCR 16S très faiblement positive! Double voire triple séquence Ininterprétable Pluri microbien? Contaminé? Rendu négatif

33 Une biopsie osseuse stérile chez une patiente aux antécédents d infection à S. epidermidis! Double séquence! Alignement : S. aureus, 96% Similarité < 97%, non rendue! PCR spécifique Staphylococcus Double séquence! PCR spécifique S. aureus +

34 Des nodules pulmonaires stériles chez une enfant de 12 ans Séquence non répertoriée dans notre base de données Famille des Bacteroidetes Amplification et séquençage d un autre fragment de l ADNr 16S, mais pas plus d information à partir des banques de données

35 Etape 5. Rendu des résultats! Contrôle négatif et positif de PCR 16S Détection de contaminants et inhibiteurs dans le mix! Contrôle d extraction Amplification parallèle du gène de la $-globine (eucaryote) Toujours positif Si négatif " Prélèvement acellulaire : intra-oculaire, LCR " Présence d inhibiteurs de PCR! Interprétation de la séquence Confrontation des données cliniques et biologiques Distinguer un contaminant d un pathogène Une PCR négative d exclut pas un diagnostic

36 PCR universelle! Avantages Amplification de tous les ADN bactériens! Inconvénients Pouvoir discriminant inter-espèces parfois limité " Staphylococcus et Streptococcus Pouvoir discriminant inter-genres parfois limité " Mycobactéries, entérobactéries! Amplification des contaminants Biais des banques de données " Séquences surreprésentées, erronées, inconnues Solution = PCR spécifiques

37 Les PCR spécifiques! Amorces spécifiques d un genre / d une espèce bactérienne

38 PCR spécifiques! PCR «semi-spécifiques» Staphylococcus & Streptococcus Gène tuf Gel migration Suivie d un séquençage pour identification d espèce Patients : 400 pb Témoin + : 600 pb! PCR spécifique En point final ou en temps réel

39 PCR spécifiques en temps réel! Développement de techniques clés en main Lyse, extraction, PCR et interprétation dans un système automatisé et fermé de paillasse en % 1 heure Détection par des sondes spécifiques Intégration au secteur de Bactériologie conventionnelle! Domaines divers Infections associées aux soins SARM, ERV, carbapénémases, toxines de C. difficile Résistance du BK à la rifampicine (rpob) Portage de S. aureus, Streptocoque du groupe B! IST : Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae! Evaluer les performances et le coût

40 Exemple : GeneXpert MTB/RIF

41 PCR spécifiques en temps réel au GHE!"#$!.,#*/0*+,!.,$30*4(35#0,!.,$&(1030+, /5#, , ;5+"0/5#,4(3()&"(1030+, <5310''#,=531#0, ;015(30''#,$30*4($%5'#,?,'55) 6(/90"0''#,$0/"*++5+,?,$#/#$0/"*++5+, 6#/"(30''#,%03+0'#0,?,A*53"#3#, D/($%0/&4#,E%5$$'05, C(>50''#,B*/3085, C'(+"/595*4,95G)5'0,! Apport PCR sur prélèvements plurimicrobiens " Complément de 16S si double séquence " Bordetella " Clostridium difficile PCR combinées " Francisella / Bartonella henselae Sensibilité > PCR 16S " S. aureus > Staph > 16S " K. kingae > 16S

42 Cas cliniques & données de la littérature

43 Une polyarthrite bien particulière!! Homme de 61 ans! PAR atypique diagnostiquée en 2005 Mono-arthrite genou droit Extension aux mains, poignets, épaules, genoux, pieds, chevilles, sans lésion structurale érosive typique FR, anti-ccp, ACAN + Corticothérapie + méthotrexate! Consultation en cardiologie sur avis du rhumatologue Dyspnée d effort + œdèmes MI depuis un mois Important syndrome inflammatoire biologique Doute sur un souffle cardiaque systolique apyrétique

44 Une polyarthrite bien particulière!! Endocardite infectieuse Echographie cardiaque : Végétation cardiaque massive de 24 mm Body-Scan normal Anémie à 10,9 g/dl! Indication chirurgicale de RVA en urgence pour risque embolique

45 Une polyarthrite bien particulière!! Suites rapidement favorables Muté en chirurgie à J4! Laboratoire Anatomopathologie : absence d EI Bactériologie " Examen direct : pas de germe " Culture : stérile " Hémocultures négatives EI silencieuse à hémocultures négatives chez un patient immunodéprimé Augmentin + gentamycine

46 Une polyarthrite bien particulière!! PCR universelle Tropheryma whipplei (bactérie intracellulaire cultivable sur fibroblastes) Relecture anapath de la végétation avec colorations spéciales (PAS) : négative! Relais Bactrim Forte + Plaquenil, 12 mois! Arrêt corticoïdes et méthotrexate! Disparition totale des douleurs articulaires! Autres prélèvements Biopsie duodénale à J7 : négative Biopsie digestive, sang, selles, salive : négatives à 12 mois

47 Apport de la PCR dans le diagnostic des EI à hémocutures négatives! 759 patients présentant une EI à hémocultures négatives Etiologie dans 62,7 % des cas Sérologie (principalement Coxiella et Bartonella) : 47,7 % PCR sur valve ou sang (sérologie négative) : 14,4 % " Streptococcus, T. whipplei, Bartonella, Staphylococcus " Sensibilité PCR sur valve : 66,1 % " Sensibilité PCR sur sang : 13,6 % Immunohistochimie Etiologies non infectieuses! Coxiella : sensibilité sérologie > PCR

48 Limites de la PCR dans les EI!

49 Limites de la PCR dans les EI! 66 % 60 % Persistance de PCR positives sous antibiothérapie Particulièrement Streptococcus

50 Limites de la PCR dans les EI!! et jusqu à plusieurs années après!

51 Cas n 2

52 Une fièvre résistante aux anti-pyrétiques! Enfant de 9 ans! Consultation MT Hyperthermie (39,2 C), céphalées intenses depuis 48h, raideur de nuque, photophobie Transport privé en urgences vers les urgences pédiatriques sans antibiothérapie : méningite?! Urgences pédiatriques Purpura pétéchial non nécrotique (pied) Constantes hémodynamiques stables Glasgow 8, mutation en réanimation Injection de C3G

53 Bilan biologique! Biochimie Hématologie Leucocytes = 10,50 G/L CRP = 288 mg/l Plaquettes = 135 G/L, TP = 36%! TDM cérébrale : œdème diffus! Bactériologie Hémocultures Tube EDTA Pas de ponction lombaire (troubles de la vigilance + troubles hémostase)

54 PCR spécifique N. meningitidis! PCR spécifique en temps réel multiplex Tous génogroupes + B + C + contrôle interne! Réalisée En urgence sur le tube de sang EDTA Sur la PL réalisée à distance " Examen macroscopique : trouble " Examen direct : très rares cocci à Gram négatif " Leucocytes : M éléments/l, PNN : 98% " Protéinorachie : 6,63 g/l " Glycorachie : 0,3 mmol/l " Culture négative! Positive pour N. meningitidis génogroupe B

55 PCR = diagnostic en urgence! Méningites PCR spécifique Méningocoque PCR spécifique Pneumocoque PCR spécifique Listeria! PCR Méningocoque = diagnostic + typage! Délai de rendu des résultats > PCR universelle Retour d expérience de notre laboratoire Jamais positive si leucocytes < 200 /µl

56 Cas n 3

57 Cas n 3! Patient de 28 ans, sans antécédent! Survenue brutale d une douleur basithoracique gauche dans la journée avec dyspnée progressivement croissante! Examen clinique Apyrétique (37,6 C) Ni toux, ni expectoration, ni signe extra-respiratoire Discrets crépitants en base gauche pulmonaire FC = 90/min PA = 110/60 mmhg Sa(0 2 ) = 93%

58 Bilan d entrée! Biologie CRP à 36 mg/l Leucocytes 13,9 G/L avec 11,8 G/L PNN Ionogramme, bilans hépatique, rénal, cardiaque normaux! Imagerie Radiologie pulmonaire : pneumopathie du lobe inférieur gauche associée à des opacités alvéolaires de la base droite Scanner : volumineuse condensation parenchymateuse du lobe inférieur gauche (5 cm de largeur) sans épanchement Amoxicilline per os + hospitalisation en Pneumologie

59 Evolution dans les 72 h Admission 48 h 72 h Température ( C) 37,6 38,4 39,5 Toux Douleur thoracique et dyspnée Fréquence respiratoire (cycles/min) Absence + ++ Apparition d une toux, expectorations blanchâtres +++ morphine normale 38 Saturation (O 2 ) 93% (air) 93% (air) 89% (10 L O 2 ) PAS (mm Hg) Leucocytes (G/L) 13,9 13,1 3 CRP (mg/l) Switch Auhmentin / Tavanic puis C3G / Rovamycine / Tavanic Mutation en USI, puis en Réanimation (CHU) : diagnostic de légionellose, ECMO

60 Evolution en réanimation! Persistance de PCR positives sous antibiothérapie Legionella : PCR habituellement négativée en < 2 semaines (Korosec et al., Scand J Infect Dis., 2006)

61 Abcès pulmonaire! Chirurgie thoracique à J42 et évolution favorable! PCR universelle sur l abcès : double séquence (Fusobacterium / culture)! PCR spécifique Legionella : +++! Antibiothérapie totale : 3 mois Persistance de PCR positives / LBA = complications

62 PCR quantitative sur LBA : un marqueur prognostique dans les légionelloses! Charge bactérienne à l admission corrélée à la sévérité des légionelloses! Limites : standardisation des prélèvements pulmonaires

63 En conclusion!

64 Complémentarité des méthodes diagnostiques en Bactériologie! Connaître les performances de chaque technique Limite de détection, sensibilité et spécificité, indications Degré d urgence clinique La PCR n est pas forcément la technique la plus sensible!! Intégrer les méthodes de biologie moléculaire (BM) dans un algorithme diagnostique! Evaluer les kits commercialisés! Association Techniques «maison» & kits commerciaux Kits «clés en main» & kits conventionnels

65 Connaître les limites de la PCR! Faux positifs Pas de différenciation contaminant / pathogène N est pas toujours le témoin d une infection active! Faux négatifs Un résultat négatif n exclut pas un diagnostic " Cas avec culture + (rares colonies) / PCR! PCR! méthode de vérification d un résultat de culture douteux

66 Au delà d un outil strictement diagnostique! Outil pronostique PCR quantitative! Typage bactérien! Recherche de facteurs de virulence C. difficile / souche épidémique O27 S. aureus / PVL!! Recherche de résistance Sondes détectant les mutations associées à la résistance SARM, BK / rifampicine, H. pylori / clarithromycine!

67 Merci pour votre attention Des questions?

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