ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES

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1 Cours de DCEM1 - Faculté de Médecine de Créteil ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES Dr Vincent CATTOIR Laboratoire de Bactériologie-Virologie-Hygiène Vendredi 17 Novembre Amphi 3

2 Définitions = atteinte de la croissance bactérienne = destruction des bactéries

3 Paramètres de bactériostase CI50 = Concentration Inhibitrice 50 : Conc. d ATB qui de 50 % le nbre de bactéries Peu utilisée en pratique CMI = Concentration Minimale Inhibitrice : Conc. d ATB la plus faible inhibant tte croissance bactérienne visible Très utilisée en pratique CMI 50 et CMI 90 : Conc. minimales inhibant la croissance de 50 % ou 90 % des souches testées CMI modale : Valeur de CMI la plus fréquente dans un panel de souches testées

4 Paramètres de bactéricidie CMB = Concentration Minimale Bactéricide : Conc. d ATB laissant subsister moins de 0,01 % (0,1 % chez les anglo-saxons) de survivants Soit n.10-4 de bactéries viables survivantes Rapport CMB/CMI : Utilisé pour distinguer - ATB bactéricides (CMB/CMI < 2) - ATB bactériostatiques (CMB très éloignée de la CMI) Définit la tolérance d une souche (CMB/CMI 32) Ex. Bactéries à Gram positif et ATB actifs sur la paroi (Streptocoques et β-lactamines) Cinétique de bactéricidie : Epreuve dynamique qui prend en compte du facteur temps Méthode lourde

5 Cinétiques de croissance/bactéricidie ATB temps-dép. : vitesse de bactéricidie indép. de la conc. ; conc. sérique doit être maintenue élevée en permanence ATB conc.-dép. : vitesse de bactéricidie dép. de la conc. ; pics sériques élevés doivent être obtenus régulièrement Effet post-atb : Mesuré par le temps mis par une souche à retrouver une croissance normale après arrêt de l ATB

6 Utilité en pratique courante Evaluation des paramètres de bactériostase : Suffisante pour les infections aiguës chez les IC Faite par la mesure directe ou indirecte de la CMI Evaluation de la bactéricidie : Parfois nécessaire pour infections sévères (endocardites, septicémies), chroniques (ostéites) ou sur terrain fragilisé (aplasiques) NB : ATB les + bactéricides : β-lactamines Aminosides (rapides +++) Quinolones Glycopeptides

7 Catégorisation clinique SIR (1) Basée sur le choix de valeurs critiques dép. de la CMI Valeurs proposées par des comités nationaux : CA-SFM en France, CLSI (ex-nccls) aux E-U, BSAC au R-U, DIN en Allemagne Selon l OMS : 2 définitions de la R :. Souche capable de supporter une conc. d ATB notablement plus élevée que celle qui inhibe la majorité des autres souches de la même espèce Catégories de populations bactériennes. Souche capable de supporter une conc. d ATB notablement plus élevée que celle qu il est possible d atteindre in vivo Catégories cliniques

8 1. Bactériologiques : Distribution de CMI pour des populations de souches définies et appartenant à chacune des espèces bactériennes impliquées en pathologie humaine 5. Pharmacocinétiques : 9. Cliniques : Catégorisation clinique SIR (2) Critères Conc. sériques et tissulaires obtenues aux posologies usuelles (RCP) A comparer à la CMI de la souche Confrontation des résultats obtenus in vitro et des résultats obtenus in vivo (essais cliniques) avec notion de succès ou d échec thérapeutique PROPOSITION DE CONCENTRATIONS CRITIQUES : BASSE (c) ET HAUTE (C)

9 Catégorisation clinique SIR (3) 3 catégories de souches :. Sensible S : Probabilité de succès thérapeutique acceptable dans le cas d un traitement systémique avec la posologie recommandée (RCP). Résistante R : Forte probabilité d échec thérapeutique. Intermédiaire I : Succès thérapeutique imprévisible (ensemble hétérogène qui sert de zone tampon) En pratique : Catégorie S I R CMI (µg/ml) CMI c c < CMI C CMI > C

10 Techniques de bactériologie courante (1) Antibiogramme standard (1) = Méthode par diffusion en milieu gélosé ou méthode des disques Technique simple, rapide, fiable et visuelle Protocole : Utilisation de disques imprégnés d une conc. donnée d ATB (en µg) Dépôt de ces disques à la surface d une gélose uniformément ensemencée avec une suspension calibrée de bactéries à étudier Diffusion concentrique de l ATB dans la gélose pendant l incubation Lecture à h (zones d inhibition) : Plus ce Ø est grand, plus la bactérie est S à l ATB Plus ce Ø est petit, plus la bactérie est R à l ATB

11 Techniques de bactériologie courante (2) Antibiogramme standard (2). Corrélation du Ø avec la CMI avec une courbe de concordance. Catégorisation de la souche étudiée selon les Ø critiques (d, D) : Catégorie S I R CMI (µg/ml) CMI c c < CMI C CMI > C Ø (mm) Ø D d Ø < D Ø < d

12 Techniques de bactériologie courante (3) Antibiogramme standard (3) Exemples d antibiogrammes : Exemples d antibiogrammes : Ex. Proteus mirabilis résistant à l amoxicilline (AMX) et Ticarcilline (TIC) ; Résistant aux aminosides (KTG), aux cyclines (TE) et au Bactrim Résistant naturellement à la colistine (CS) et aux furannes (FT)

13 Techniques de bactériologie courante (4) Antibiogramme automatisé Micro-galeries avec cupules contenant conc. d ATB adaptées aux groupes bactériens (staphylocoques, BGN, ) Ensemencement avec inoculum standard Résultats rapides (ex. 4-6 h pour les entérobactéries) Couplage à un système informatique d expertise

14 Techniques de bactériologie courante (5) Détermination de la CMI 3 méthodes principales :. Dilution en milieu gélosé : Appareil de Steers. Dilution en milieu liquide : Macrodilution. Méthode E-Test (bandelettes imprégnées d un gradient de conc. d ATB) CMI = 4 µg/ml Microdilution

15 Techniques de bactériologie courante (6) Recherche de β-lactamase Détection de β-lactamase par test chromogénique : Pour la détection de pénicillinase (TEM) de certaines espèces comme Haemophilus, Neisseria, Moraxella ou Staphylococcus Utilisation de disque avec substrat chromogénique (si hydrolyse virage de couleur) : Ex. Nitrocéfine (Oxoïd), Céfinase (biomérieux), Padac (Bio-Rad) Détection de β-lactamases à spectre élargi (BLSE) : BLSE = Dérivées des pénicillinases capables d hydrolyser la quasitotalité des β-lactamines (sauf imipénème et céphamycines) Souvent R associées (plasmide) aux aminosides, phénicolés Utilisation du test de synergie entre inhibiteurs de β-lactamases et C 3 G : IMAGE EN «BOUCHON DE CHAMPAGNE»

16 Techniques de bactériologie courante (7) Lecture interprétative de l ATBg D après les connaissances des mécanismes de résistance (supports génétiques et moléculaires) :. Inactivation enzymatique. Diminution d affinité par modification de la cible. Imperméabilité / Efflux actif Existence de phénotypes de résistance bien individualisés MAIS nécessite une identification correcte de la bactérie étudiée Se déroule en 3 étapes : - lecture brute des résultats - détermination des mécanismes de R - établissement de la R clinique

17 Associations d antibiotiques (1) Indications Elargissement du spectre (traitement d urgence, d infection mixte) Infections sévères souvent chez patients en USI, onco-hémato. Prévention de l émergence de mutants R Ex. tuberculose Obtention d une synergie Ex. endocardites infectieuses, infections sévères à P. aeruginosa, infections à BMR Diminution de la durée du traitement Ex. endocardites (pénicilline + aminoside vs pénicilline seule) Association de 2 ATB pour leur diffusion Ex. péfloxacine + rifampicine dans infections osseuses

18 Associations d antibiotiques (2) Nombreuses méthodes (certaines simples et d autres compliquées) Résultats parfois difficiles à interpréter voire discordants 2 catégories :. méthodes en point fixé. méthodes cinétiques 4 effets antibactériens observables : - indifférence : AB = A + B - addition : AB # A + B - synergie : AB > A + B - antagonisme : AB < A + B

19 Méthodes en point fixé : Associations d antibiotiques (3) Techniques d étude (1) Diffusion en gélose Diffusion en gélose (disques ou bandelettes) Dilution en milieu liquide («carré», «échiquier», «damier»)

20 Associations d antibiotiques (4) Techniques d étude (2) Méthodes cinétiques : Dénombrement à intervalles réguliers (2 h) les bactéries survivantes dans 4 tubes :. Tube contenant l association. 2 tubes contenant un seul ATB. Tube sans ATB NB : Synergie = % survivants < 2 log 10 Appréciation de la bactéricidie quantitative et la vitesse de bactéricidie Ex. d associations synergiques : β-lactamines + aminosides Glycopeptides + aminosides Sulfamides + Triméthoprime = Cotrimoxazole (BACTRIM )

21 Méthodes génotypiques Mise en évidence des gènes de résistance (mais expression?) Méthodes basées sur la PCR Détection par RFLP, séquençage, sonde Méthodes rapides mais chères et limitées Intéressantes pour les germes à croissance lente ou difficile Exemples d applications : Exemples d applications : - Mycobactéries (BK) : R à la rifampicine, à l isoniazide - Helicobacter pylori : R à la clarithromycine - Staphylococcus aureus : R à la méticilline (meca)

22 Choix d une antibiothérapie probabiliste Choix initial guidé par : Données cliniques précoces : - site du foyer - sévérité de l infection - terrain (ID, n-né, femme enceinte, personnes âgées ) Données bactériologiques précoces : - ED +++ (bactéries, leucocytes, PNN) Données de la littérature, recommandations de consensus : - spectre d activité (SIR) - diffusion - taux de R

23 Surveillance bactériologique d un traitement ATB (1) Détermination des concentrations sériques et tissulaires : Prélèvement au pic (30 après adm. IV) et en résiduelle (5 avant adm.) NB : POUR ETRE ACTIF : IL FAUT CONC. LOCALE > CMI +++ o Dosage par méthodes immuno-enzymatiques : Ex. Aminosides Glycopeptides Aminoside Amikacine 2x/j 1x/j Gentamicine 2x/j 1x/j Pic (µg/ml) Résiduelle (µg/ml) < 4 < 2 < 2 < 1 Glycopeptide Situations usuelles Situations particulières :. Endocardites. Méningites. Ostéites. Souche de sensibilité diminuée Résiduelle (µg/ml) Tobramycine (CMI > 4) 2x/j 5-12 < 2 Isépamicine 2x/j < 35 < 10

24 Surveillance bactériologique d un traitement ATB (2) Détermination des concentrations sériques et tissulaires (suite) : o Dosage par méthodes chromatographiques : Ex. certaines β-lactamines (ceftazidime) o Dosage par méthodes microbiologiques : moins rapide (18-24 h) mais adaptée à tous les ATB Rq : Surveillance de la toxicité (ex. néphrotoxicité pour les aminosides) NB : Foyers où les ATB ne diffusent pas ou peu : foyers enkystés, collection purulente (anaérobiose et acidité pour les aminosides)

25 Surveillance bactériologique d un traitement ATB (3) Etude du pouvoir inhibiteur : Sur le sérum (ex. pouvoir bactéricide du sérum ou PBS) Sur le LCR Sur les urines Série de tubes avec dilutions du sérum (raison 2) + inoculum bactérien Incubation h à 37 C Détermination de l effet bactériostatique puis bactéricide NB : Effet inhibiteur valable si la plus grande dilution 1/8e Possibilité d étude de la cinétique de bactéricidie