Diagnostic virologique des infections virales digestives

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1 Diagnostic virologique des infections virales digestives DCEM1 - Université Paris 7 Dr Diane Descamps Dr Thomas Mourez Dr Bénédicte Roquebert

2 Généralités Une gastro-entérite est une infection inflammatoire caractérisée par l'émission brutale et fréquente de selles liquides et abondantes (diarrhée) pouvant être causée par un multitude d agents pathogènes. La diarrhée s'accompagne souvent de vomissements et parfois de poussées de fièvre mais les symptômes varient en fonction des individus. Le risque principale de la gastro-entérite est la déshydratation de l'organisme.

3 Généralités Les gastro-entérites virales représentent l un des premiers motifs de consultation en médecine et principalement en pédiatrie. (3 millions/an en France) Les gastro-entérites virales surviennent souvent chez les enfants de moins de trois ans. Dans les pays développés, la prise en charge reste un coût économique important. Dans les pays en développement, les conditions socioéconomiques et une mauvaise prise en charge conduit au décès de personnes /an.

4 Incidence Incidence des gastro-entérites virales et mortalité selon le niveau économique des pays. D après Parashar et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 9, No. 5, May 2003

5 Mortalité Estimated global distribution of 440,000 annual deaths in children caused by rotavirus diarrhea. One dot=1,000 deaths Parashar et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 9, No. 5, May 2003

6 Généralités Les gastro-entérites ont des origines multiples : virales : 80% des enfants de moins de un an bactériennes : Salmonella, Shigella, Campylobacter, E. coli, Yersinia, Vibrio cholerae parasitaires : Giardia, Cryptosporidium, amibes... toxiques : champignons, coquillages infectés par algues toxiques

7 Généralités La diarrhée peut également être un signe d autres pathologies : infections systémiques (septicémies ) intolérances digestives (aspartam, lactose ) maladies auto-immunes (Crohn ) secondaire à un traitement antibiotique (C. difficile). Par un interrogatoire précis et le contexte clinique, il sera possible d'éliminer ces autres hypothèses.

8 Gastro-entérites virales Les gastro-entérites virales sont : très fréquentes, d incubation courte, troubles digestifs aigus et de courte durée, signes généraux discrets, spontanément résolutives

9 Gastro-entérites virales : épidémiologie Zoonose? Transmission fécaleorale ou par aérosols Voie de transmission des virus des gastro-entérites virales

10 Gastro-entérites virales : épidémiologie Modes de contamination des eaux Rejet de 1010 particules virales/g de selles, résistant dans le milieu extérieur

11 Gastro-entérites virales : épidémiologie 2 modes épidémiologiques 1) Endémique avec dans les pays tempérés, une nette prédominance hivernale. La contamination est inter-humaine par voie fécale-orale principalement ou par aérosols. Evolution saisonnière des cas de gastro-entérites virales

12 Gastro-entérites virales : épidémiologie 2 modes épidémiologiques Les virus le plus souvent en cause sont par ordre de fréquence: Rotavirus Calicivirus Astrovirus Adenovirus 40/41

13 Gastro-entérites virales : épidémiologie 2 modes épidémiologiques 2) Epidémies localisées : notamment dans les collectivités d enfants ou d adultes ont souvent à leur origine une source commune de contamination : eau, aliment, coquillage une transmission inter-humaine secondaire permet l extension de l infection. Les virus en cause sont principalement : - Calicivirus du genre Norovirus - Rotavirus et plus rarement - Astrovirus - Adénovirus 40/41

14 Gastro-entérites virales : épidémiologie et clinique Les gastro-entérites concernent toutes les tranches d âge, mais elles sont plus sévères chez le jeune enfant (< 3 ans). Cette différence liée à l âge pourrait, au moins partiellement, être expliquée par des phénomènes physiologiques Par ailleurs, les infections successives survenant durant l enfance permettent l acquisition d une immunité protectrice. D autres facteurs tels que malnutrition et coinfections bactériennes seraient également des éléments intervenant dans la gravité des gastroentérites.

15 Gastro-entérites virales : quels virus? Virus Population cible Importance Rotavirus Enfants < 2ans Sujets âgés 1er agent 50% des cas Calicivirus Norovirus Sapovirus Adultes Enfants 2ème agent 8 à 14% Origine alimentaire Astrovirus Sujets agés ID 2 à 9% Adenovirus (40, 41) Enfants < 2ans ID 2 à 6% Virus Aichi Picornaviridae (Parechovirus 1) Adolescents Adultes? Torovirus Coronaviridae Enfants Adultes? Picobirnavirus?

16 Les Rotavirus Morphologie Virus non enveloppés. Diamètre : 70 nm. Capside : icosaédrique en forme de roue (d où son nom «rota»), caractéristique en microscopie électronique. Résistance physico-chimique Virus très résistants, notamment aux concentrations de chlore utilisées pour traiter l eau potable. Particules de rotavirus au microscope électronique en coloration négative (x ) Cliché : collection du Pr. M. Castets, service de microscopie électronique (Pr. Ph. Rabin) CHU de Poitiers, France

17 Les Rotavirus Famille des Reoviridae, ils appartiennent au genre Rotavirus. 7 groupes A à G. seuls, les groupes A (surtout), B et C sont impliqués dans des infections humaines et animales. Classification des Reoviridae et du genre Rotavirus

18 Les Rotavirus : caractéristiques génomiques Virus à ARN bi-caténaire segmenté en 11 segments, chacun codant pour une protéine virale. Ils sont produits en quantité équimolaire.

19 Les Rotavirus : caractéristiques génomiques Les protéines structurales - VP1 à VP7 - s organisent en 3 couches entourant le génome. La capside externe est constituée de : la glycoprotéine VP7 : antigène majeur de neutralisation, détermine 14 sérotypes G dont seulement 10 infectent l homme : G1 à G10. Ces sérotypes correspondent à autant de génotypes. la protéine VP4 (spicules : rôle dans l attachement du virus aux cellules, la neutralisation, et la virulence) détermine 13 sérotypes dont 9 infectent l homme. Il n y a pas de concordance entre sérotypes et génotypes. La majorité des souches humaines sont de sérotype 1A et 1B (respectivement génotypes P[8] et P[4]). La capside intermédiaire constituée par la seule protéine VP6 (antigène de groupe et de sous-groupe, protéine majeure du virion). La capside interne ou core : 1 protéine majoritaire VP2, 2 protéines minoritaires VP1 et VP3. Ces trois protéines du core permettent la transcription et la réplication.

20 Les Rotavirus : caractéristiques génomiques Les protéines non structurales NSP1 à NSP5 - apparaissent durant le cycle de multiplication, elles ne sont pas présentes dans le virus mature. NSP4 rôle important dans le mécanisme de la diarrhée. Les Rotavirus : classification On distingue : 7 groupes de Rotavirus (A à G) déterminés par la protéine VP6. 14 sérotypes G (dont 10 humains) dont la spécificité antigénique est portée par VP7. 20 sérotypes P (dont 14 humains) dont la spécificité antigénique est portée par VP4. VP4 et VP7 étant situés à l extérieur de la capside, ils sont à l origine de la synthèse d anticorps neutralisants.

21 Variabilité génétique et antigénique Les rotavirus présentent une très grande diversité génétique et antigénique. Les souches les plus courantes en Europe et aux USA sont : G1P[8]; G2P[4]; G4P[8] ; G3P[8] et G9P[8]. D autres souches sont observées dans certains pays : P[8];G5 au Brésil; P[8]; G8 en Afrique et P[11];G10 ou P[4]/P[6];G12 en Inde. Comparaison des distributions des génotypes de rotavirus entre l Europe et l Afrique

22 Variabilité génétique et antigénique Rotavirus du groupe A: agent étiologique majeur des gastro-entérites infantiles. Épidémies hivernales dans les pays tempérés. Elles touchent principalement les enfants entre 6 et 24 mois. Ces virus sont incriminés dans plus de 50% des gastro-entérites infantiles et plus de 90% des enfants ayant atteint l âge de trois ans ont été en contact avec ce virus et ont acquis des anticorps. Enfants plus âgés et les adultes (sauf chez les vieillards et les immunodéprimés): infections en règle asymptomatiques et contribuent à la dissémination du virus.

23 Variabilité génétique et antigénique L épidémiologie des infections à rotavirus des groupes B et C est encore mal définie. Le groupe B est trouvé en Chine et les études sérologiques ne semblent pas impliquer ce groupe de rotavirus dans d autres pays. Au contraire, la diffusion des rotavirus du groupe C est beaucoup plus large et des épidémies de gastro-entérites ont été décrites en Europe, Asie et Amérique : épidémies hivernales, symptomatologie bénigne, incidence modeste, surviennent plus tardivement. Les groupes D à G ne sont impliqués que dans des pathologies en médecine vétérinaire.

24 Mécanismes de la variabilité génétique Les arrangements génétiques sont fréquents mais ont peu d impacts sur l épidémiologie. Les mutations peuvent entraîner une dérive génétique avec pour conséquence l apparition de mutants d échappement voire de souches épidémiques. Les réassortiments entre génomes humains et entre génomes de différentes espèces sont à l origine de l émergence de nouveaux génotypes humains comme par exemple les rotavirus G9. Réassortiments entre rotavirus d espèces différentes aboutissant à l émergence d une nouvelle souche. Ces échanges sont favorisés par les infections mixtes.

25 Physiopathologie Infection des entérocytes de l intestin grêle Diarrhée provoquée par un mécanisme complexe et multifactoriel, associant une malabsorption et une composante sécrétoire. Le virus, et sa protéine NSP4, sont responsables d une activation du système nerveux entérique (SNE) et d une augmentation du calcium intracellulaire ([Ca2+]i), provoquant une succession d évènements conduisant à une fuite de chlore, une désorganisation de l architecture de la cellule et à sa lyse.

26 Physiopathologie : diarrhée osmotique par malabsorption Destruction des entérocytes du sommet des villosités remplacés par des cellules cryptiques immatures. Atrophie des villosités. Altération des fonctions d absorption des villosités. Aspect des muqueuses de l intestin grêle. (A) Muqueuses non infectées (B) Muqueuses infectées par le rotavirus avec vacuolisation (flèches bleues) et desquamation (flèches rouges) des entérocytes.

27 Physiopathologie : diarrhée osmotique par malabsorption Altération fonctionnelle de la digestion : diminution de l activité enzymatique au niveau de la muqueuse et fermentation des nutriments entraînant une augmentation de la pression osmotique intraluminale. diminution de l activité des systèmes de transport des nutriments qui pourrait être liée directement au virus et/ ou à sa protéine NSP4. Il en résulte une absence de digestion des nutriments et une diminution de leur absorption avec comme conséquence une diarrhée de type osmotique.

28 Physiopathologie : diarrhée osmotique par malabsorption Augmentation de la perméabilité trans-épithéliale aux macromolécules : le virus et la protéine NSP4, directement ou via l augmentation du calcium intracellulaire, désorganisent l architecture cellulaire en agissant sur les protéines du cytosquelette et des jonctions serrées.

29 Physiopathologie : diarrhée secrétoire L'entérotoxine NSP4 du rotavirus induit une augmentation du calcium intracellulaire. Un des résultats est l ouverture d un canal chlore calcium dépendant responsable d une fuite d ions Clet d eau. Induction des sécrétions par le système nerveux entérique. L origine de l activation du SNE pourrait être des médiateurs libérés des myofibroblastes et des cellules inflammatoires lors de l infection.

30 Les Calicivirus Morphologie Virus non enveloppés. Diamètre : 27 à 35 nm Capside : icosaédrique Résistance physico-chimique Virus très résistants, notamment aux concentrations de chlore utilisées pour traiter l eau potable. Culture cellulaire : non Particules de Calicivirus au microscope électronique en coloration négative Cliché : Pr Albert Bosh, Département de Microbiologie, Université de Barcelone, Espagne

31 Les Calicivirus Famille des Caliciviridae Virus à ARN simple brin Polarité positive 4 genres : Vesivirus Lagovirus qui infectent les animaux Norovirus Sapovirus qui infectent hommes et animaux Chaque genre est divisé en plusieurs génogroupes.

32 Calicivirus : clinique Incubation courte (18 à 48 heures) Diarrhée aqueuse, vomissements. Principal agent viral responsable des gastro-entérites survenant dans les collectivités et touchant toutes les tranches d âge. L origine de la contamination peut être commune et souvent hydrique ou alimentaire, notamment par les coquillages, mais elle peut aussi être interhumaine. Dans ces cas, les virus identifiés appartiennent au genre Norovirus avec ces dernières années prédominance du génogroupe II en Europe. Gastro-entérites endémiques hivernales peuvent également être dues aux calicivirus. Elles sont sous estimées. Les calicivirus sont le deuxième agent étiologique après les rotavirus.

33 Les Astrovirus Morphologie Virus non enveloppés. Diamètre : 28 à 30 nm Capside : icosaédrique Résistance physico-chimique Virus très résistants, notamment en ph acide, et vis à vis du chloroforme, des détergents, des solvants des lipides, et à la chaleur. Gardés à 70 C, ils conservent leurs propriétés infectieuses 6 à 10 ans. Culture cellulaire : non Particules d Astrovirus au microscope électronique en coloration négative Cliché : F.P. Williams, U.S. Environmental Protection Agency

34 Les Astrovirus Famille des Astroviridae Virus à ARN simple brin Polarité positive 7000 nucléotides Un seul genre: Astrovirus 8 sérotypes humains (sérotype 1 prédominant)

35 Astrovirus : clinique Incubation courte : 36 à 48 heures Symptomatologie : généralement modérée 2 à 9% des gastro-entérites infantiles communautaires Infections nosocomiales et dans les collectivités. La transmission du virus est interhumaine (voie fécale-orale), et on note une nette prédominance hivernale dans les pays tempérés ou durant la saison des pluies dans les pays tropicaux. Toutes les tranches d âge peuvent être concernées, mais les enfants et les personnes âgées sont les cibles principales; les enquêtes sérologiques de prévalence indiquent que 70% des enfants ont été en contact avec ce virus durant les cinq premières années de leur vie.

36 Les Adénovirus 40/41 et 31 Morphologie Virus non enveloppés. Diamètre : 70 à 90 nm Capside : icosaédrique Résistance physico-chimique Virus résistants aux variations de ph, aux détergents, et aux solvants des lipides, mais inactivés par le chloroforme, et le formol. Culture cellulaire : Oui, mais parfois difficile pour les adénovirus des gastro-entérites. Particules d Adénovirus au microscope électronique en coloration négative Cliché : Pr Pierre Lebon, Laboratoire de virologie, Hôpital Saint-Vincent de Paul, AP-HP, Paris, France

37 Les Adénovirus 40/41 et 31 Famille des Adenoviridae Virus à ADN double brin nucléotides Deux genres : Aviadenovirus : infectent les oiseaux. Mastadenovirus : infectent les mammifères dont l homme. Certains antigènes sont spécifiques de genre, d autres spécifiques de type ou de groupe. Chez l homme, on distingue 51 sérotypes regroupés en 6 groupes (A à F). Dans le cas des gastro-entérites infantiles, les virus responsables sont les adénovirus 40/41 (groupe F) et 31.

38 Les virus Aichi Morphologie Virus non enveloppés. Diamètre : 30 nm Capside : icosaédrique Particules de virus Aichi au microscope électronique en coloration négative Résistance physico-chimique Très résistant (> Entérovirus) à la chaleur, à l'éther à 10 % et aux doses de chlore utilisées pour la chloration habituelle des eaux de boissons.

39 Les virus Aichi Famille des Picornaviridae Genre : Kobuvirus Virus à ARN simple brin Les virus Aichi ont été retrouvés pour la première fois en 1989 au Japon dans les selles de patients ayant une gastro-entérite secondaire à la consommation de coquillages. Ces virus seraient à l'état endémique dans le sud-est asiatique où ils seraient responsables de petites épidémies sporadiques, notamment chez l'adolescent et l'adulte.

40 Calicivirus Transmission Rotavirus Astrovirus Adénovirus 40/41 fécale-orale alimentaire et hydrique Incubation 1 à 3 jours 1 à 4 jours 1 à 2 jours 8 à 10 jours Durée des signes 0 à 8 jours 2 à 9 jours 2 à 4 jours 5 à 12 jours Excrétion (ME) Jusqu à 18 jours 10 jours 12 jours 10 à 14 jours élevé inconnu Taux d attaque très élevé élevé dose infectieuse = 10/100 particules virales

41 Calicivirus Signes cliniques Variations saisonnières diarrhée diarrhée +++ fièvre vomissements ++ déshydratation + fièvre vomissements ± surtout hiver Caractéristique majoritairement épidémiologique épidémiques Populations cibles Rotavirus tout âge pic hivernal sporadiques et saisonnières Astrovirus Adénovirus 40/41 diarrhée modérée vomissements ± fièvre ± Hiver Printemps toute l'année épidémiques ou sporadiques jeune enfant jeune enfant personnes âgées personnes âgées immunodéprimés enfant <2 ans

42 Diagnostic des gastro-entérites virales : Indications Aucun signe clinique ne permet de distinguer une infection à un virus plutôt qu à un autre virus. Diagnostic étiologique n est réalisé habituellement que dans les formes sévères ayant motivé une hospitalisation surtout chez les nourrissons ou les immuno-déprimés. IL est utile pour différencier les GE virales, des diarrhées: d origine toxique (surtout médicamenteuse) bactériennes auto-immunes

43 Diagnostic des gastro-entérites virales : Prélèvements SELLES émises en phase aiguë de la maladie 2 à 3 ml dans un récipient stérile, à fermeture hermétique, sont suffisants Transport à température ambiante sans précautions particulières : virus résistants et peu thermo-sensibles. Si l examen doit être différé, conservation entre +2 C et +6 C pendant 72 heures, ou bien à 20 C au delà.

44 Diagnostic des gastro-entérites virales : Diagnostic direct +++ Culture Microscopie électronique Détection des antigènes : agglutination immuno-chromatographie ELISA Détection du génome : PCR RT-PCR

45 Diagnostic des gastro-entérites virales : Culture Ne convient pas à tous les virus Techniques chronophages Personnels techniques qualifiés ++ Utile pour la conservation des souches notamment dans les laboratoires de référence Astrovirus très difficiles à cultiver, mais des souches ont été obtenues sur cellules rénales embryonnaires humain. Adénovirus classiques sont cultivables sur cellules épithéliales d'origine humaine (Hela, KB, Hep 2) ou sur cellules embryonnaires (HEK ou MRC5).

46 Diagnostic des gastro-entérites virales : Microscopie électronique Identification des virus par leur structure et leur taille Dans les prélèvements ou les cultures cellulaires Utile pour le diagnostic des Adénovirus et Rotavirus (forme caractéristique), et pour orienter la recherche d autres virus (Calicivirus, Astrovirus, Coronavirus ) Limitations nombreuses : Personnel qualifié +++ (œil expert) Temps Coût (mise de fond et entretien) Ne dispense pas d une identification par d autres méthodes Mauvaise sensibilité (au moins 106 particules/µl)

47 Diagnostic des gastro-entérites virales : Test d agglutination Tests aux particules de latex Principe : particules sensibilisées avec des antisérums spécifiques «latex rotavirus» sensibilité de 85 % et spécificité de 95 % «latex adénovirus» : faible sensibilité de 36 à 86 %, spécificité entre 96 et 100 %). latex «mixtes» adénovirus / rotavirus latex «Astrovirus» Avantages : utilisable par tous les laboratoires, pour un coût raisonnable, mais nécessite des contrôles de spécificité.

48 Diagnostic des gastro-entérites virales : Immuno-chromatographie Diagnostic rapide rotavirus combiné à l adénovirus L échantillon dilué est déposé à la surface d une bandelette test. Migration du complexe AgAC grâce à un tampon de migration. Des anticorps de capture spécifiques de l antigène, fixés sur la membrane vont permettre d arrêter ces complexes. Résultat positif : apparition d une bande colorée. Contrôle interne témoin de bonne migration Lecture en 5 minutes

49 Diagnostic des gastro-entérites virales : ELISA Recherche des antigènes Rotavirus ou Astrovirus Directement à partir des selles. Permet la recherche sur de nombreux échantillons. Méthodes sensibles Matériel nécessaire disponible dans tous les laboratoires de diagnostic virologique.

50 Diagnostic des gastro-entérites virales : Biologie moléculaire PCR et RT-PCR : Diagnostic qualitatif Calicivirus Typage des souches PM type 4 type 3 type 2 type 1 Séquençage : Génotypage Epidémiologie moléculaire Avantage : Applications possibles pour tous les virus Inconvénients : réponse moins rapide (24 à 48h au minimum) coût

51 Diagnostic des gastro-entérites virales : Biologie moléculaire L étude comparative des souches de Rotavirus est possible en réalisant un électrophorétype directement à partir des extraits d acides nucléiques des selles des 11 segments d ARN (segments codant pour des protéines structurales ou non structurales) et en les séparant en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Réservé aux laboratoires spécialisés.

52 Diagnostic des gastro-entérites virales : Sérologie NON ADAPTE AU DIAGNOSTIC DES GASTRO ENTERITES VIRALES Seul intérêt : étude de séroprévalence en épidémiologie

53 Diagnostic des gastro-entérites virales :

54 Diagnostic des gastro-entérites virales d origine alimentaire ou hydrique

55 GEV : Prévention Mesures d hygiène collectives : amélioration du système de distribution et d assainissement des eaux Mesures d hygiène individuelles : lavage des mains!!! isolement des patients infectés en collectivités Prévention vaccinale : Rotavirus But est de prévenir la survenue de GE aiguë sévère chez l enfant de moins de 2 ans (prévenir le premier épisode qui est le plus sévère) Doit être administré tôt pour assurer une protection précoce dès les premiers mois de vie, période où la réponse immunitaire n est pas optimale.

56 Prévention vaccinale anti-rotavirus RotaTeq (Merck) : vaccin vivant réassortant de la souche WC3 pentavalent G1, G2, G3, G4 et P[8] 3 doses administrées par voie orale entre 2 et 8 mois efficacité > 85% Rotarix (GSK) : vaccin vivant atténué dérivé de la souche monovalent G1P[8] 2 doses : 1ère entre 6 et 14 semaines 2nde entre 14 et 24 semaines efficacité entre 90 et 100% contre les GE sévères