BCPST-Véto 1 Mercredi 8 octobre Devoir n 1 Durée 3h30. Épreuve de type B (partielle) : Étude de documents (40 points) - durée : 1h45

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1 BCPST-Véto 1 Mercredi 8 octobre Devoir n 1 Durée 3h30 Épreuve de type B (partielle) : Étude de documents (40 points) - durée : 1h45 A partir de l'exploitation des documents et de vos connaissances, mettez en évidence un certain nombre de propriétés des lipides de la membrane plasmique et quelques aspects de leur mise en place. Une introduction et une conclusion générale sont attendues. les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d'être légendés, commentés ou exploités. Des croquis légendés peuvent également être proposés. L'exposé doit se limiter aux deux thèmes abordés par les documents, qui font l'objet de deux parties indépendantes THEME I ORGANISATION LIPIDIQUE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE Document 1: observation en microscopie électronique d'une membrane plasmique Une cellule de racine de pois est fixée et des coupes fines sont réalisées. Après coloration métallique, la membrane est observée en coupe par microscopie électronique à transmission. Document 2: immunomarquage des glucides de la membrane plasmique Des anticorps reconnaissant des polyosides particuliers ont été couplés à des billes d'or. Ces anticorps ont ensuite été incubés en présence d'hématies (globules rouges) humaines. Les hématies ont enfin été fixées et coupées, et leur membrane plasmique observée en microscopie électronique à transmission. Page 1

2 Document 3: composition et distribution des phospholipides dans la membrane plasmique Un dosage chimique à partir de la membrane plasmique des globules rouges (hématies) humains, montre qu'elle contient: - 60% de phospholipides - 23% cholestérol - 5% d'acides gras libres - 3% glycolipides. Parmi les phospholipides, on distingue: - 17% de phosphatidylcholine (PC) - 18% de phosphatidyléthanolamine (PE) - 18% de sphingomyéline (SM) - 7% de phosphatidylsérine (PS). On étudie la sensibilité des différents phospholipides en réaction à deux enzymes = - la sphingomyélinase (enzyme qui hydrolyse spécifiquement la sphingomyéline) - la phospholipase de venin de serpent (enzyme qui hydrolyse les phospholipides à base de glycérol). Remarque : une hydrolyse est un fractionnement moléculaire faisant intervenir de l eau. L'action de ces deux enzymes est testée sur - des globules rouges entiers, séparés du reste du sang, et placés dans une solution de concentration équivalente à celle des liquides physiologiques. - Des "fantômes" d'hématies, obtenus en plaçant les globules rouges dans de l'eau distillée, puis en isolant la membrane ainsi obtenue, devenue poreuse à toutes les molécules, y compris les macromolécules. Après action des deux enzymes, on isole et analyse les phospholipides membranaires pour tester si ils ont été (+) ou non (-) hydrolysés par l'enzyme. Les résultats de cette expérience sont résumés dans le tableau ci-dessous: Phospholipide Hydrolyse par la sphingomyélinase Globule rouge entier "fantôme" d'hématie Hydrolyse par la phospholipase de venin de serpent Globule rouge "fantôme" entier d'hématie PC PE SM PS Page 2

3 Document 4: synthèse du phosphatidyléthanolamine Du réticulum endoplasmique lisse (lieu de synthèse des phospholipides membranaires passant par la voie de sécrétion) est isolé à partir de cellules végétales. Les molécules de phosphatidylethanolamine membranaire du REL sont ensuite extraites, et on teste le % de ces molécules qui ont été liées au FDNB ainsi que le % de molécules liées au TNBS. Le REL isolé est mis en présence d'éthanolamine marquée au 14 C pendant 30 minutes, puis l'éthanolamine radioactive est remplacée par de l'éthanolamine non marquée. L'éthanolamine est un précurseur nécessaire à la synthèse du phosphatidyléthanolamine. Après ce pulse d'éthanolamine marquée, le REL est mis en présence de molécules se liant par liaison covalente au phosphatidyléthanolamine: Chase-time (h) - le FDNB (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene), auquel la membrane du REL est perméable - ou le TNBS (acide 2,4,6 - trinitrobenzenesulfonique), auquel la membrane du REL est imperméable. Page 3

4 THEME II SYNTHESE ET TRANSPORT DU CHOLESTEROL DANS LES CELLULES ANIMALES Le cholestérol est un composant essentiel des membranes cellulaires. Une partie du cholestérol des cellules animales est fourni par l'environnement (alimentation), mais les cellules sont également capables de synthétiser le cholestérol à partir de précurseurs, dont l'acétate. Cette synthèse a lieu au niveau du réticulum endoplasmique lisse (REL), et le cholestérol synthétisé est ensuite transporté dans la cellule. Document 1: Synthèse du cholestérol dans les cellules Expérience de pulse-chase Des cellules animales de rein de hamster (cellules) BHK ont été cultivées dans un milieu appauvri en cholestérol pendant 48h. Passé ce délai, les cellules sont mises en présence d'acétate marqué avec de la thymidine tritiée 3 H pendant 15 minutes, puis l'acétate radioactive est supprimée du milieu et remplacée par de l'acétate non marquée. Les cellules sont conservées ainsi en culture pendant un temps variable, puis les lipides cellulaires sont extraits, et la radioactivité présente dans l'extrait est dosée. Les résultats sont indiqués dans la courbe cicontre: Document 2 : Intégration du cholestérol à la membrane plasmique Une deuxième expérience de pulse-chase identique à la précédente est réalisée. Aux différents temps de chasse, la membrane plasmique des cellules est extraite et la radioactivité présente dans cette membrane est mesurée et rapportée à la quantité de radioactivité présente dans l'ensemble de la cellule. Page 4

5 Document 3 : Voie de transport du cholestérol à la membrane plasmique La Bréfeldine A (BFA) est une drogue qui provoque la désorganisation et le dysfonctionnement de l'appareil de Golgi. L'effet de la BFA est testé sur l'export membranaire du cholestérol. Une expérience de pulse-chasse identique à celle du document 2 est réalisée en présence ou en absence de BFA. Les résultats sont exprimés par un rapport: Cholestérol radioactif présent dans la membrane plasmique à un temps t de chasse / Cholestérol radioactif présent dans la membrane plasmique à la fin de la chasse et en absence de BFA. Dans une expérience parallèle, on peut observer que la BFA inhibe à plus de 90% le transport des protéines nouvellement synthétisées vers la membrane plasmique. DS n 1 du 8/10/08 - Corrigé de la partie de type B 40 points =1 Introduction : cellules limitées par une membrane, composition majoritairement lipidique, étude portant sur la disposition de ces lipides, leur diversité, leur répartition, leur synthèse et leur mise en place. I. Organisation lipidique de la membrane plasmique 1. Aspects de l organisation détectable par la microscopie électronique à transmission Membrane montre 3 parties : 2 couches sombres et une claire Ceci est du à des composants de propriétés comparables (affinité pour colorant) vers l extérieur et vers l intérieur de la cellule et composants ayant d autres propriétés (pas d affinité pour le colorant) au cœur de la membrane. 2 couches de lipides : têtes hydrophiles => bandes sombres Queues hydrophobes => bande claire = bicouche lipidique La dissymétrie observée traduit une dissymétrie des constituants des deux couches ou hémimembranes constituant la membrane 2. Mise en évidence de glucides membranaires La fixation des anticorps anti-polyosides rendus visibles par les billes d or conduit à des taches sombres repérables uniquement sur face externe. Il existe donc des polyosides sur cette face. Il s agit de polyosides reliés à des lipides. La membrane contient donc des glycolipides membranaires localisés dans l hémimembrane externe. Page 5

6 3. Composition et distribution des lipides membranaires Parmi les 60% de phospholipides, on compte des glycérophospholipides dont les molécules sont le résultat d estérifications d un glycérol par des acides gras et un groupement phosphate (relié lui-même soit à de la choline (PC) soit à de l éthanolamine (PE), soit à de la sérine (PS) des sphingophospholipides dont les molécules sont le résultat d une amidification d une sphingosine par un acides gras et d une estérification par un groupement phosphate lui-même relié à de la choline (SM). On doit donc s attendre à ce que la sphingomyélinase n hydrolyse que SM et que la phospholipase hydrolyse les 3 autres phospholipides mentionnés. Or on constate que la PE et la PS ne sont détruites que sur les fantômes d hématies. Ceci s explique par le fait que ces molécules ne sont pas exposées à l enzyme dans le cas de globules rouges entiers parce qu elles ne se trouvent qu au niveau de l hémimembrane interne. Ce résultat montre donc une dissymétrie dans la répartition des phospholipides membranaires. En particulier PE et PS ne se trouve qu un niveau de l hémimembrane interne. 4. Synthèse et mise en place du phosphatidyléthanolamine Avec les 2 molécules permettant le marquage, losqu on augmente de temps de chasse, on constate une augmentation de la quantité de PE marqué dans la membrane, avec une stabilisation au bout de 3h. L éthanolamine marquée a donc été intégrée à la membrane dans du PE. Le TNBS permet la localisation du PE synthétisé à partir de l éthanol amine et se retrouvant à l extérieur de la membrane du REL (vers le hyaloplasme) Le FDNB permet la localisation du PE se retrouvant sur les 2 faces de la membrane (vers le hyaloplasme et vers l intérieur de la cavité). Or, on constate qu il n y a pas beaucoup plus de PE marqué avec la FDNB qu avec la TNBS (moins de 20% de plus). On en déduit donc que la quasi-totalité du PE se trouve sur la face hyaloplasmique du REL. Si on considère que cette membrane s intègre à la membrane plasmique par exocytose, la face contenant le PE se retrouve vers le hyaloplasme, ce qui est bien conforme à ce qui a été mis en évidence dans la partie 3. II Synthèse et transport du cholestérol dans les cellules animales 1. Synthèse du cholestérol dans les cellules Lorsqu augmente le temps de chasse, on constate une augmentation puis une Page 6

7 stabilisation du cholestérol marqué dans les lipides cellulaires. Ceci correspond à l intégration progressive de l acétate fourni dans du cholestérol synthétisé dans la cellule, jusqu à une intégration maximale. Dans les cellules étudiées, (cellules de rein), il y a donc synthèse de cholestérol à partir d acétate. 2. Intégration du cholestérol dans la membrane plasmique On constate que le % de cholestérol marqué repérable au niveau de la membrane plasmique augmente au cours du temps puis se stabilise à 30% du cholestérol marqué. On en déduit que du cholestérol synthétisé rejoint la membrane plasmique mais en une proportion qui correspond à 30% du cholestérol synthétisé. 3. Voie de transport du cholestérol vers la membrane plasmique La destruction de l appareil de golgi par la BFA, réduit l intégration maximale du cholestérol à la membrane plasmique de 25% Avec la BFA la baisse de l intégration des protéines membranaire est de 90% alors que celles-ci empruntent exclusivement la voie du golgi On en déduit que l exportation du cholestérol vers la membrane plasmique ne se fait qu entre 10 et 15% par la voie de l appareil de Golgi. D autres voies sont empruntées entre le réticulum lisse (lieu de synthèse) et la membrane. On peut formuler l hypothèse de vésicules produites directement par bourgeonnement du réticulum endoplasmique lisse. Conclusion-bilan : Diversité des constituants lipidiques membranaires Asymétrie de la composition lipidique des membranes Compartiments voués à la synthèse des lipides membranaires : REL Plusieurs voies dont celle de l appareil de Golgi conduisent les lipides du REL à la membrane plasmique Plan, rigueur du raisonnement Présentation des documents, clarté et soin Page 7