Le phénotype cellulaire : observation microscopique d un frottis de sang drépanocytaire

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1 Caractérisation d un phénotype à différentes échelles : l exemple de la drépanocytose Place dans la démarche explicative Cette activité constat permet de découvrir le phénotype drépanocytaire à différentes échelles et montre le rôle des protéines dans la réalisation de phénotypes alternatifs. Le phénotype général, aspects cliniques Support - Document vidéo : «la drépanocytose» CNDP 1992 (Module 1 : présentation de la maladie et de ses symptômes (4 )). - Tableau comparatif de résultats à renseigner (réutilisé à chaque étape de l activité) : Voir le document Relever les caractéristiques générales de la maladie. La drépanocytose est une maladie sanguine héréditaire qui se traduit par différents signes cliniques tels qu une anémie chronique (défaut de transport de l oxygène par le sang) et des troubles vasculaires (obstruction des capillaires sanguins). Le phénotype cellulaire : observation microscopique d un frottis de sang drépanocytaire - microscopes - préparations microscopiques : frottis sanguins d individu normal et drépanocytaire Observer au microscope des frottis de sang normal et de sang drépanocytaire. Réaliser un dessin des hématies observées. Consigner vous observations dans le tableau comparatif. Justifier le nom de «drépanocytose» ou «sickle cell anemia» donné à la maladie (faucille = «drepanos» en grec et «sickle» en anglais). Les globules rouges ou hématies ont une forme de disque biconcave et une couleur rouge liée à la présence d hémoglobine dans leur cytoplasme. Dans le sang d un individu drépanocytaire une proportion variable de ces hématies est déformée : elles prennent une forme de faucille.

2 Le phénotype moléculaire : comparaison des hémoglobines d un individu sain et d un individu drépanocytaire Temps 1 : Electrophorèse de l HbA et de l HbS - bandes d acétate de cellulose disposées dans une cuve à électrophorèse remplie de tampon - générateur à électrophorèse - solutions d HbA et d HbS, micropipette - fiche laboratoire : Voir le document L électrophorèse est une technique qui permet de séparer des molécules protéiques, dans un champ électrique, en fonction de leur taille et de leur charge électrique (qui dépend de leur composition en acides aminés). L électrophorèse est ici utilisée à la comparaison de l hémoglobine de l adulte normal, dite HbA, et de l hémoglobine d individus drépanocytaire, dite HbS (S pour «Sickle»). - Réaliser une électrophorèse des HbA et S. - Effectuer des dépôts de 5 à 10 µl de chaque solution d hémoglobine sur une bande d acétate de cellulose, disposée dans la cuve à électrophorèse, en prenant soin d aligner et d espacer les dépôts sur une ligne située au tiers de l'extrémité de la bande, côté cathode. - Fermer la cuve ; brancher et mettre sous tension le générateur, programmé à environ 200 V. - Laisser migrer environ 1 heure. - Eteindre le générateur et débrancher la cuve ; retirer les bandes d électrophorèse pour observation. - Schématiser dispositif expérimental et résultats. Interpréter ces résultats. Dispositif d électrophorèse (cuve + bandes + dépôts d Hb A et S) :

3 Résultats de l électrophorèse à l issue de la migration et après coloration au rouge Ponceau : L HbA migre plus rapidement, au cours de l électrophorèse, vers l anode : les 2 protéines diffèrent donc soit par leur taille, soit par leur charge électrique, déterminée par leur composition en AA. Temps 2 : Comparaison des structures et des séquences de l HbA et de l HbS (utilisation des logiciels Rastop et Anagene) - Logiciel Rastop et fichiers de structures moléculaires HbA : Voir le document HbS : Voir le document Betaglobine A : Voir le document Betagobine S : Voir le document Polymère d HbS : Voir le document - Logiciel Anagene et fichier de séquences : Voir le document - Fiche protocole : Voir le document Comparer, à l aide du logiciel de modélisation moléculaire Rastop et du logiciel d analyse de séquences moléculaires Anagene, la taille, la forme (structure) et la composition en acides aminés (séquence) des HbA et HbS. Utiliser pour cela la fiche protocole.

4 Structure des βglobines d HbA et d HbS avec repérage du 7 AA (glu ou val) : Position des valines des βglobines de 2 molécules d HbS polymérisées : L hémoglobine (A ou S) est composée de 4 sous unités protéiques : 2 αglobines et 2 βglobines. Les αglobines A et S ont une séquence identique Les βglobines A et S ne diffèrent que par leur 7 AA (sur 147) : glu pour l HbA ou val pour l HbS. Les βglobines A et S ont une structure (= forme) globulaire identique. Les différences de composition en AA s expriment à la surface de la globine : la valine (val), qui remplace l'acide glutamique (glu), dans la βglobine crée un point de "collage" entre molécules d Hb qui, répété de nombreuses fois, est responsable de la polymérisation des molécules d'hbs.

5 Le génotype : Comparaison des séquences nucléiques des gènes des βglobine A et S Support Logiciel Anagene et fichier de séquences : Voir le document Les gènes des βglobine A et S ont pu être séquencés et comparés. A l aide du logiciel Anagène (Ouvrir le fichier Sauve/drepano.edi), comparer 2 à 2 les séquences des gènes de la betaglobine d individus sain (betaa.adn) et drépanocytaire (betas.adn). Les 2 séquences nucléiques des gènes des βglobine ne diffèrent que par leur 20 nucléotide (sur 441) : A pour l HbA ou T pour l HbS. Bilan Le phénotype drépanocytaire peut se définir à différentes échelles : organisme, cellule et molécule. La substitution d un acide aminé dans une des unités protéiques de l hémoglobine (la βglobine) est responsable de la polymérisation de la molécule qui occasionne une déformation des hématies. Les conséquences en sont une mauvaise circulation dans les capillaires sanguins (troubles vasculaires) et une faible fixation du dioxygène dans le sang (anémie). On peut considérer, pour cet exemple, que le phénotype moléculaire détermine le phénotype cellulaire qui détermine le phénotype général Comment se détermine alors le phénotype moléculaire? Hypothèse : le génotype détermine le phénotype moléculaire (puisque l on peut mettre en relation la substitution d 1 AA dans la séquence peptidique de la βglobine et une substitution d 1 nucléotide dans la séquence de son gène).