TP chimie physique I Page 1 Semestre d automne Elliott Croset Alexandre Dumoulin (Groupe E) CINÉTIQUE

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1 TP chme physque I Page 1 Ellott Croset Alexandre Dumouln (Groupe E) CINÉTIQUE I. But de l expérence Etude de la cnétque d une réacton catalysée par la trypsne, une enzyme dgestve du suc pancréatque. II. Notons théorques La catalyse par le bas de la trypsne permet d abasser l énerge d actvaton d une réacton donnée, en l occurrence, l hydrolyse d une lason peptdque dans le BAPNA (N-benzoyl-argnne-p-ntroanlde) qu est soluble dans le DMS. Cette réacton nous donne un équvalent carboxylque de la N-benzoyl-argnne et une molécule de p-ntroanlne de couleur jaune: N2 H N (CH2)3 N H Trypsne H 2 H N H (CH2)3 + N 2 H 2 N N-benzoyl-argnne-p-ntroanlde (BAPNA) H 2 N 2 p-ntroanlne (jaune) L exemple de mécansme que nous allons étuder c est le mécansme de Mchaels-Menten : Consdérons une réacton enzymatque qu passe par la ormaton d un complexe ntermédare (ES) : ka(k' a) kb E+ S ES + E P n admet qu au début de la réacton, la vtesse de réacton est constante : V 0 = k [ES] b Ellott Croset Alexandre Dumouln

2 TP chme physque I Page 2 n peut obtenr l équaton suvante, en consdérant les dérentes vtesses de ormaton, ans qu en consdérant la concentraton de l enzyme comme beaucoup plus able que celle du substrat : ka([e] total [ES])[S] [ES] = k' + k a b ka[e][s] [ES] = Avec [ES] = concentraton de complexe ntermédare = k' a+ kb [E]total = concentraton totale d enzyme = [E] + [ES] k' a+ k KM = Posons ka b = constante de Mchaels. S la concentraton du substrat est beaucoup plus grande que KM, on obtent l équaton de Mchaels-Menten : V = V 0 max [S] K + [S] M n peut réarranger l équaton de la manère suvante : 1 V = K M 0 Vmax [S] Vmax En traçant 1/V0 en oncton de 1/[S], on obtent une drote avec 1/Vmax comme ordonnée à l orgne et -1/KM lorsque y=0. Cette représentaton s appelle «Lnearweaver Burk plot» Nous allons donc détermner les V0 de réactons avec des concentratons de substrat dérentes, an de pouvor tracer le graphque. III. Parte expérmentale Nous avons utlsé dérentes ppettes (1,2,5 ml), une serngue et des oles de 5 ml pour procéder aux conceptons des dérentes solutons que l ont a ms dans une cuve de 1 cm de large dans un spectrophotomètre réglé à 400 nm an de calculer les dérentes absorptons. Le prncpe de mesure est le suvant. Il aut pour chaque concentraton du mélange BAPNA/DMS eectué une mse à zéro de l absorbance à 400 nm avec une soluton tampon dans une cuvette. Ensute on met dans une autre cuvette 2,5 ml (avec une ppette) de la soluton d enzyme, on y ajoute 0,5 ml d une des solutons préalablement préparées (avec une serngue) on met un lme de paralm dessus pour pouvor homogénéser et l ont dspose la Ellott Croset Alexandre Dumouln

3 TP chme physque I Page 3 cuve dans la machne an de suvre l absorpton à 400 nm en oncton du temps pendant 4 mnutes. Les solutons : Solutons V sol. Mère BAPNA V DMS ppettes utlsées A ml B ml C ml D ml E ml F ml G ml mère ml NB : à savor que la soluton «mère» est de 0.06M et a été préparée à l avance. Les erreurs sur les nstruments de mesure de quanttés sont les suvantes : Instruments V (ml) ppette de 1 ml 0.01 ppette de 2 ml 0.02 ppette de 5 ml 0.02 serngue 0.01 oles 5 ml 0.08 ppette de 2,5 ml 0.02 L absorbance par mnute a donc été mesurées pour les 8 solutons : Solutons [BAPNA] Pente (mol/l) (Abs/mn) A B C D E F G mère n a ben noté qu une os les mélanges réactonnels at, la couleur de la soluton vre au jaune ce qu dénote ben que la réacton a leue (présence de p-ntroanlne). IV. Résultats et dscusson Le tableau c-dessous comporte la concentraton de BANPA ([S]) calculées dans les cuves, par la relaton suvante : C V = C V où C = [BAPNA], C = [S],V = Volume de soluton mère de BAPNA et V = volume nale de la cuve sot 3 ml Ellott Croset Alexandre Dumouln

4 TP chme physque I Page 4 La vtesse ntale V 0, a pue être calculée avec la ormule de l absorbance : A = ε b c Ayant l absorbance nous pouvons tourner l équaton de la sorte : c = A/( ε b) Avec ε = 10'000 M -1 cm -1 et b = 1 cm Nous pouvons soulgner que la vtesse ntale augmente en avec la concentraton de BAPNA dans la cuve car plus l y en a plus les molécules de trypsne ont de chance de rentré en contacte avec et ans d hydrolyser les lasons peptdques. Tableau avec les valeurs calculées ou mesurées permettant de tracer la courbe de la cnétque de Mchaels-Menten : Solutons [BAPNA] Pente (Abs/ V [S] (mol/l) 0*10-6 ppettes V 0 th (mol/l) mn) (mol/mn) utlsées (mol/mn) A E E-06 1 ml 3.228E-05 B E E-06 1 ml 4.114E-05 C E E-05 1 ml 4.501E-05 D E E-05 1 ml 4.718E-05 E E E-05 2 ml 4.884E-05 F E E-05 2 ml 5.050E-05 G E E-05 2 ml 5.313E-05 mère E E-05 5 ml 5.444E E-05 Cnétque de Mchaels-Menten V0 mol/mn 4. 00E E E E E E E E-06 y = x R 2 = V0*10-6 (mol/mn) V0 théorque Pussance (V0*10-6 (mol/mn)) Pussance (V0 théorque) 0. 00E E E E E E E E-06 [S] mol/l Cette courbe ne nous permet pas aclement de détermner la constante de Mchaels (Km) ans que la valeur de la vtesse maxmale. Pour cela, nous pouvons tracer un graphe de 1/[S] en oncton de 1/[V 0 ] (Lnweaver - Burk plot) et ans obtenr une répartton des mesures plus lnéare. n obtent pour 1/V 0 = (1/[BAPNA]) une drote de régresson ayant les caractérstques suvante : y = ax + b Ellott Croset Alexandre Dumouln

5 TP chme physque I Page 5 1/[S] 4.000E E E E E E E E+05 1/V o 2.463E E E E E E E E+04 Vmax (mol/mn) = 5.925E-05 Km = 3.393E-06 Graphe : Lneweaver - Burk plot 3.000E+05 1/V0 [s/mol] 2.500E E E E+05 y = x R 2 = /Vo -1/Km 1/Vmax 5.000E E+ 05 = - 1/Km = 1/Vmax 0.000E E E E E E E E+06 1/[S] [1/M] Grâce donc à cette régresson lnéare on peut trouver par l ordonnée à l orgne 1/Vmax et -1/ Km par le pont coupant l axe des x. y = x R2 = 0,9996, ce qu montre que notre drote expérmentale est relatvement bonne et donc utlsable. n en dédut donc Vmax = 1/ordonnée à l orgne = [M s-1] et Km = -1/(-2, ) = [mol L-1] n peut auss très ben assmler que plus la concentraton de BAPNA est basse plus la vtesse est élevée ce qu est logque vu que la trypsne se trouve ans en soluton avec un rapport mole de BAPNA/mole de trypsne plus avantageux. Calculs d erreurs : Malgré la bonne lnéarté de la courbe trouvée, on peut touteos are une estmaton des erreurs, selon les équatons suvantes : C V = C V C C V C V = = V(total) V + V ajouté Ellott Croset Alexandre Dumouln

6 TP chme physque I Page 6 ln(c ) = ln(c) + ln(v) ln(v + V) dc C d[s] dc = = [S] C dv dv + dv + V V + V Δ[S] ΔC ΔV ΔV + ΔV % = = + + [S] C V V + V soluto n C ntale[mol/ml] "+/-" [mol/ml] V V V ajouté V ajouté Erreur sur la conc. des solutons [%] Erreur sur la conc. des solutons dans la cuvette [%] A 3.00E E E B 6.00E E E C 9.00E E E D 1.20E E E E 1.50E E E F 2.10E E E G 4.20E E E Mère 6.00E E E NB : les erreurs sont dvsées en deux partes : transert erlenmeyer-ole et celu de la olecuvette. (Les concentratons et autres volumes pour la deuxème parte ne gurent pas sur le tableau. Il aut ben sûr noter que ce ne sont que des estmatons plus où mons précses des erreurs seulement sur la précson du matérel de mesure utlsé. Cela ne prend pas en compte les possbles erreurs de manpulatons ou même de calculs. V. Conclusons Cette expérence a ben permt de constater que le pouvor catalytque d une enzyme est prmordal pour une réacton de la sorte. S l on compare notre Km (Km(exp)= ) à celu théorque : Km(théorque) = 9,4 10-4, l y a tout de même un acteur 100 de dérence. Cela peut être explqué d une part, par l erreur des nstruments et d une autre, à la vtesse d exécuton entre le mélange avec l enzyme et la mesure de l absorbance. n peut remarquer auss que les valeurs de vtesse en mol/mn sont très pettes ce qu maxmse l erreur lorsqu l y a un pett écart Ellott Croset Alexandre Dumouln

7 TP chme physque I Page 7 EXERCICE ANNEXE Ln(k) = ln(a) Ea(RT 1 ) - Ln(2k) = ln(a) Ea(RT 2 ) Ln(2k/k) = -Ea/( RT 2 ) + Ea/( RT 1 ) Ln(2) = Ea/R ( 1/T 2-1/T 1 ) Ea = ln (2) R (1/T 2 1/T 1 ) = ln(2) 8,31 (J mol -1 K -1 ) = -3, J/mol= 3,32 KJ/mol ( 1/121-1/100) (K) Ellott Croset Alexandre Dumouln