METHODES DE SEPARATION DE PROTEINES : PURIFICATION DE LA GST PAR AFFINITE AU GLUTATHION
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- Renaud Lanthier
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1 Laboratoire de Physiologie Végétale Université de Neuchâtel (2005) Travaux pratiques METHODES DE SEPARATION DE PROTEINES : PURIFICATION DE LA PAR AFFINITE AU GLUTATHION INTRODUCTION: Les protéines tiennent un rôle important. Par exemple, elles peuvent : servir de catalyseurs pour maintenir les processus métaboliques (enzymes) dans la cellule, constituer des éléments de structure, ou encore intervenir dans les voies de signalisation. L étude des protéines et de leurs fonctions est donc indispensable pour comprendre le fonctionnement des cellules et des organismes. Dans leur environnement naturel, les protéines sont souvent présentes en petites quantités et sont associées entre elles et/ou à des carbohydrates, lipides, acides nucléiques ; il est donc difficile d isoler en grande quantité des protéines pures et actives, or cette étape est nécessaire pour étudier leurs structures et leurs fonctions. Les biochimistes ont ainsi tendance à produire et purifier des protéines d une autre façon. Par clonage, l ADN codant pour une protéine d intérêt est inséré dans un vecteur d expression (par ex. pgex), cette construction est alors introduite dans une cellule hôte (bactérie, levure ou cellule d insecte). Le vecteur d expression contient un promoteur fort inductible (ex. promoteur Ptac) ce qui permet d activer l expression du gène cloné et de produire la protéine correspondante en grande quantité dans la cellule hôte. Afin de faciliter leur purification, les protéines sont souvent exprimées en fusion avec une étiquette (tag) qui permet d effectuer une purification par affinité. Par exemple, la Glutathion S-transferase ( ) est une protéine utilisée comme étiquette pour ce type de purification. En effet, la a une forte affinité pour son substrat, le glutathion. Pour purifier les protéines d intérêt, on utilise une matrice composée de glutathion (par ex. Glutathion Sepharose 4B, Amersham). Les protéines de fusion à la vont se fixer sur cette matrice. Cette fixation est réversible, ce qui permet d éluer les protéines fixées à l aide d un tampon qui contient du glutathion réduit (voir figure 1). But du TP : Lors de cette séance vous allez purifier la seule et une protéine fusionnée à la (-Toc159G), à partir de bactéries E.coli transformées par les constructions codant pour ces deux protéines. Vous verrez que la facilite grandement la purification de la protéine voulue parmi toutes les protéines présentes dans les extraits bactériens. 1
2 Pour réaliser ce TP, nous avons cloné une partie de l ADNc codant pour une protéine de plante (A. thaliana Toc159) dans le vecteur d expression pgex (pgex-toc159; voir TP d avant : «extraction et digestion de plasmides d E.coli»). Dans ce vecteur, le gène codant pour la est sous le contrôle d un promoteur (promoteur Ptac) inductible à l IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). Nous avons transformé des bactéries (E.coli BL21) par le vecteur pgex vide et le vecteur pgex contenant Toc159. Les bactéries sont mises en culture à 37 C dans du milieu LB supplémenté par de l ampicilline. 3 heures avant de «récolter» les bactéries on ajoute l inducteur (IPTG) dans la culture. Le principe de l induction des protéines d expression par ajout d IPTG est illustré dans la figure On récupère ensuite les bactéries par centrifugation et on conserve le culot bactérien qui résulte de cette centrifugation à -80 C. Sans IPTG Une protéine represseur est attachée à l opérateur et empêche la transcription. La RNA polymérase peut se lier au promoteur mais ne peut pas débuter la transcription. Avec IPTG L IPTG se lie au represseur et l inactive. Le represseur est libéré. Maintenant la RNA polymerase peut commencer la transcription. promoteur Ptac Ptac pgex pgex operateur transcription mrna (+ ribosomes) traduction RNA polymérase Protéine répresseur protéine Inducteur IPTG Figure 2 2
3 PARTIE EXPERIMENTALE A. PREPARATION DES EXTRAITS BACTERIENS o Resuspendre complètement le culot bactérien (environ 0.5g) dans 5 ml de tampon 1 froid (dans la glace). o Ajouter 500 µl de lysozyme (10 mg/ml) o Incuber 30 min dans la glace Le Lysozyme (muramidase) est une enzyme qui détruit les parois des cellules des bactéries par hydrolyse des polysaccharides qui les composent. On trouve cette enzyme chez les plantes et les animaux. Par exemple on en trouve dans les œufs de poule, les tissus et sécrétions des mammifères, la salive, les larmes, le lait, où le lysozyme est une sorte d antibiotique naturel. o Après incubation avec les lysozymes les bactéries sont complètement lysées par sonication (4 x 30 sec sur glace). Attention! Etape réalisée par un assistant! o Prendre un échantillon de l extrait bactérien pour l analyser par SDS-PAGE : pipeter 40 µl dans un tube eppendorf de 1,5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation. Volume de l extrait bactérien : ml B. SEPARATION PROTEINES INSOLUBLES / SOLUBLES o Transférer 1,8 ml de l extrait bactérien dans de nouveaux tubes eppendorf de 2 ml o Centrifuger 10 min à vitesse maximale ( rpm) o Transférer avec précaution les surnageants (=protéines solubles) dans de nouveaux tubes eppendorf de 2 ml o Prendre un échantillon de protéines solubles pour analyser par SDS-PAGE : tranférer 40 µl dans un tube eppendorf de 5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation o Resuspendre le culot (protéines insolubles) dans 8 ml de tampon 1 o Prendre un échantillon de protéines insolubles pour analyser par SDS-PAGE : tranférer 40 µl dans un tube eppendorf de 5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation 3
4 C. PURIFICATION PAR AFFINITE (BATCH) DE LA ET DE - TOC159G A L AIDE DU GLUTATHION SEPHAROSE 4B LIAISON AU GLUTATHION SEPHAROSE o Ajouter 100 µl de Glutathion Sepharose 4B dans chacun des eppendorfs contenant les proteins solubles (utiliser les cônes jaunes coupés à leur extrémité!) o Incuber 30 min à 4 C sous agitation (liaison de la et de -Toc159G au Glutathion Sepharose) o Centrifuger 1 min à 500 x g (4 C) o Transférer avec précaution les surnageants dans de nouveaux tubes eppendorfs (cette fraction contient les protéines qui ne se sont pas liées au Glutathion Sepharose = protéines non liées). Attention de ne pas perdre de billes de Sépharose, il vaut mieux laisser un peu de surnageant dans le tube que de perdre des billes! o Prendre un échantillon de protéines non liées pour analyse par SDS-PAGE : tranférer 40 µl dans un tube eppendorf de 5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation LAVAGES o Laver les billes de Glutathion Sepharose : ajouter 1,8 ml de tampon 1, mélanger avec précaution, centrifuger 1 min à 500 x g, enlever avec précaution le surnageant. o Répéter cette étape 3 fois (pas besoin de garder les surnageants) ELUTION DES PROTEINES LIEES o Ajouter 500 µl de tampon d élution (50 mm TrisHCl ph 8,0, 10 mm glutathion) aux billes de Sépharose o Incuber 5 min à 4 C sous agitation o Centrifuger 1 min à 500 x g (4 C) o Transférer avec précaution le surnageant dans de nouveaux tubes eppendorfs. Cette fraction contient les proteins purifiées = éluat 1 4
5 o Prendre un échantillon de l éluat 1 pour analyse par SDS-PAGE : tranférer 40 µl dans un tube eppendorf de 5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation. Conserver le reste de l éluat 1 dans la glace o Répéter l étape d élution: ajouter 500 µl de tampon d élution (50 mm TrisHCl ph 8,0, 10 mm glutathion) aux billes de Sépharose o Incuber 5 min à 4 C sous agitation o Centrifuger 1 min à 500 x g (4 C) o Transférer avec précaution le surnageant dans de nouveaux tubes eppendorfs = éluat 2 o Prendre un échantillon de l éluat 2 pour analyse par SDS-PAGE : tranférer 40 µl dans un tube eppendorf de 5 ml et laisser dans la glace jusqu à utilisation. Conserver le reste de l éluat 2 dans la glace D. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN PROTEINES (TEST DE BRADFORD) La concentration des protéines des éluats va être déterminée par test colorimétrique de Bradford (test de Bradford, voir TP : Isolation d Igy à partir de jaune d oeuf de poule ). o Courbe étalon: préparer 5 dilutions de protéine BSA [concentration (80 µg / ml)] dans un volume final de 800 µl dilutions BSA BSA (80 µg / ml) H 2 O concentration finale 1 0 µg / ml 0 µl 800 µl 2 2 µg / ml µl µl 3 4 µg / ml µl µl 4 6 µg / ml µl µl 5 8 µg / ml µl µl o Dilutions des échantillons : préparer des dilutions des éluats au 1:200 et au 1:400 (2x!) Dilution 1:200 : 50 µl éluat + 9,95 ml H 2 O Dilution 1:400 : 500 µl de dilution 1: µl H 2 O Transférer 800 µl des dilutions dans un tube eppendorf 5
6 Ajouter 200 µl de réactif de Bradford à chacun des échantillons de 800 µl, bien mélanger o Incuber à température ambiante pendant au moins 5 min o Mesurer l absorbance à 595 nm (blanc = dilution 1) o Dessiner une courbe étalon et déterminer les concentrations de vos éluats. Attention aux facteurs de dilution! Estimer la quantité de / -Toc159 que l on peut purifier à partir de 0,5 g de bactéries. Courbe etalon : Concentration en BSA (µg/ml) Absorbance (595 nm) Echantillons: Echantillons: Eluat 1 1:200 Absorbance (595 nm) Concentration protéique (µg/ml) Concentration protéique (µg/µl) Quantité de protéines purifiées (µg) Eluat 1 1:400 Eluat 2 1:200 Eluat 2 1:400 Echantillons: Eluat 1 - Toc159 1:200 Absorbance (595 nm) Concentration protéique (µg/ml) Concentration protéique (µg/ml) Quantité de protéines purifiées (µg) Eluat 1 - Toc159 1:400 Eluat 2 - Toc159 1:200 Eluat 2 - Toc159 1:400 6
7 E. SDS-POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS (SDS-PAGE) (pour le principe de SDS-PAGE voir TP : Isolation d Igy à partir de jaune d oeuf de poule ) o Ajouter 10 µl de 5x SDS-PAGE sample buffer (tampon de charge) à chacun des échantillons de 40 µl que vous avez mis dans la glace au cours du TP pour l analyse SDS-PAGE o Dénaturer les échantillons de protéines pendant 4 min à 95 C o Remplir la cuve d électrophorèse avec du tampon de migration pour SDS-PAGE o Déposer 5 µl de protein standard et les échantillons : 5 µl Protein standard extrait bactérien protéines insolubles protéines solubles protéines non liées éluat 1 éluat 2 Protein standard -Toc159 extrait bactérien -Toc159 protéines insolubles -Toc159 protéines solubles -Toc159 protéines non liées -Toc159 éluat 1 -Toc159 éluat 2 o Electrophorèse : au départ 100V, augmenter à 200V quand les échantillons entrent dans le gel de séparation. o Quand l électrophorèse est finie (le bleu sort du gel) le gel est coloré dans la solution de coloration (Coomassie staining solution) o Le gel est décoloré dans la solution de décoloration 7
8 o Vos gels séchés vous attendront dans notre labo! (vous pouvez les récupérer 2 jours après le TP) QUESTIONS: Pourquoi a-t-on fait pousser les bactéries dans du milieu LB contenant de l ampicilline? (voir aussi TP Extraction et digestion de plasmides d Escherichia coli ) Citez différentes techniques / stratégies pour purifier une protéine. Quels sont les avantages de la purification par affinité? Quels pourraient être à votre avis les désavantages? (voir aussi TP "Isolation d IgY à partir de jaune d oeuf de poule ") 3. Pourquoi lors de la purification de protéines doit-on travailler à 4 C (dans la glace)? 4. Qu est-ce qu un tampon? 5. Expliquer les bandes obtenues sur les gels SDS-PAGE. 6. Avez vous les mêmes résultats pour la seule et -Toc159 durant les différentes étapes de purification? Expliquez ces résultats. Matériel: - culots bactériens (BL21-DE3 + pgex où BL21-DE3 + pgex-toc159), environ 0,5 g - tampon 1 : 20 mm TrisHCl ph 7,4, 200 mm NaCl, 1 mm DTT - lysozyme 10 mg/ml (dans tampon 1) - Glutathion Sepharose - tampon d élution : 50 mm TrisHCl ph 8,0, 10 mm glutathion - BSA (80 µg / ml) - réactif de Bradford - 5x SDS-PAGE sample buffer (tampon de charge) - tampon de migration pour SDS-PAGE - solution de coloration (Coomassie staining solution) - solution de décoloration 8
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