Expression de la lipocaline aviaire Ex-FABP, une protéine inhibitrice de l immunité innée, chez les poulets atteints de colibacillose.

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1 Expression de la lipocaline aviaire Ex-FABP, une protéine inhibitrice de l immunité innée, chez les poulets atteints de colibacillose. AMÉLIE GARÉNAUX, SÉBASTIEN HOULE, BENJAMIN FOLCH, GENEVIÈVE DALLAIRE, MÉLANIE TRUESDELL, FRANÇOIS LÉPINE, NICOLAS DOUCET AND CHARLES M. DOZOIS INRS-Institut Armand Frappier, Laval, Canada amelie.garenaux@iaf.inrs.ca Mots clés: colibacillose aviaire, APEC, sidérocalin, sidérophore, immunité innée. Introduction La colibacillose aviaire est une infection respiratoire fréquemment observée chez les poulets ou les dindes d élevage, évoluant en infection généralisée et pouvant conduire à des taux de mortalité de l ordre de 20% par lot (Dho-Moulin et Fairbrother 1999). Ce type d infection est causé par les Escherichia coli pathogènes aviaires (APEC). En condition d infection, les bactéries sont confrontées à un manque de fer disponible. Un de leurs facteurs de virulence essentiels est leur capacité à synthétiser des sidérophores. Les sidérophores sont de petites molécules à très forte affinité pour le fer, leur permettant d aller récolter le fer séquestré par les protéines de l hôte. Les APEC sont capables de produire jusqu à quatre types de sidérophores différents: l entérobactine, les salmochélines, l aérobactine et la yersiniabactine (Garénaux et al. 2011). Chez les mammifères, il a pu être démontré que certaines protéines de la famille des lipocalines, baptisées sidérocalins, étaient capables de capter des sidérophores bactériens, limitant ainsi la capacité des bactéries à survivre et proliférer en conditions d infection (Goetz et al ; Nelson et al. 2005). Un sidérocalin a également été identifié chez la caille (Coudevylle et al. 2010). Le but de cette étude était de déterminer si les poulets étaient capables de produire des sidérocalins en réponse à une infection et, le cas échéant, de déterminer si la production de sidérocalin aviaire pourrait représenter une défense efficace en cas d infection par une souche APEC (Garénaux et al. 2012). Méthodologie Des comparaisons de séquences protéiques ont permis d identifier quatre sidérocalins potentiels chez le poulet. Des modèles bioinformatiques ont été utilisés pour prédire la structure de ces quatre protéines d intérêt et évaluer leur capacité à lier l entérobactine, un sidérophore produit par la majorité des entérobactéries. Le niveau d expression des gènes codant pour ces protéines a également été mesuré par qrt-pcr dans les organes de poulets infectés expérimentalement avec une souche APEC O78 (χ7122). L une de ces protéines, Ex-FABP, a enfin été purifiée pour évaluer sa capacité à inhiber la croissance d un panel de souches APEC produisant différentes combinaisons de sidérophores en milieu pauvre en fer. Résultats Chez le poulet, quatre protéines de la famille des lipocalines semblent présenter des niveaux d homologie importants avec le sidérocalin identifié chez l humain (NGAL): Ex-FABP, Cal(Beta), Cal(Gamma), Ggal-C8GC (présentant respectivement 24.2, 20.3, 27.4 et 20.8% d identité avec NGAL). La modélisation a permis de démontrer que la structure d Ex-FABP était celle qui comportait le plus de caractéristiques communes avec celles des sidérocalins connus. Les données de qrt-pcr démontrent également que le gène codant pour Ex- FABP est fortement surexprimé dans les tissus de poulets infectés par une souche APEC, principalement dans les poumons. Le gène codant pour Cal(beta) est lui aussi surexprimé de façon importante dans le foie et les poumons. Conformément à ce qui a déjà été observé pour le sidérocalin humain NGAL, la présence de lipocaline aviaire Ex-FABP purifiée permet d inhiber la croissance de souches productrices d entérobactine dans un milieu minimal pauvre en fer (Fig.1). En revanche, les tests effectués sur un panel de souches cliniques APEC semblent démontrer que la production d autres sidérophores (aérobactine, salmochélines ou yersiniabactine) permet aux souches pathogènes de pousser normalement en présence de sidérocalin.

2 Fig.1. Croissance d une souche d Escherichia coli non pathogène productrice d entérobactine (ent) en présence d Ex-FABP. Les cultures ont été réalisée en milieu RPMI+HEPES+10% FBS en présence de 2,5 µm de protéine purifiée ou de PBS (témoin négatif), avec ou sans fer rajouté (10µM FeCl 3 ). Le même test a également été réalisé après introduction dans la même souche d un plasmide lui permettant de produire des salmochélines en plus de l entérobactine (ent + iro). Les dénombrements ont été réalisés après 18h de culture à 37 C sous agitation. Conclusions Ex-FABP est un sidérocalin aviaire surexprimé dans les tissus en conditions d infection. Cette protéine est capable d inhiber la croissance de souches productrices d entérobactine. Outre l entérobactine, les souches APEC sont cependant capables de produire jusqu à 3 autres types de sidérophores. La diversification de ces systèmes d acquisition du fer pourrait constituer une stratégie leur permettant d échapper aux protéines de l immunité innée de l hôte. En effet, nos tests démontrent que seule l entérobactine semble être captée par Ex- FABP et NGAL, et que la production des trois autres types de sidérophores permet aux APEC de croître normalement en présence de sidérocalin. Des études complémentaires seraient nécessaires pour déterminer si d autres sidérocalins possédant un spectre d activité plus large permettraient de capter toutes les formes de sidérophores produits par les APEC. De tels sidérocalins seraient également efficaces contre d autres souches d Escherichia coli apparentées, comme les souches responsables de septicémies, d infections urinaires ou de méningites néonatales chez les mammifères. Références Dho-Moulin M. and Fairbrother JM Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Vet Res, 30(2-3): Garénaux A., Caza M., Dozois CM The Ins and Outs of siderophore mediated iron uptake by extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Vet Microbiol, 153(1-2): Goetz D.H., Holmes M.A., Borregaard N., Bluhm M.E., Raymond K.N., Strong R.K The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition. Mol Cell, 10(5): Nelson A.L., Barasch J.M., Bunte R.M., Weiser J.N Bacterial colonization of nasal mucosa induces expression of siderocalin, an iron-sequestering component of innate immunity. Cell Microbiol, 7(10): Coudevylle N., Geist L., Hötzinger M., Hartl M., Kontaxis G., Bister K., Konrat R The v-myc-induced Q83 lipocalin is a siderocalin. J Biol Chem, 285(53): Garénaux A., Houle S., Folch B., Dallaire G., Truesdell M., Lépine F., Doucet N., Dozois C.M Avian lipocalin expression in chickens following Escherichia coli infection and inhibition of avian pathogenic Escherichia coli growth by Ex-FABP. Vet Immunol Immunopathol, 2012 Sep 26 [Epub ahead of print].

3 Expression de la lipocaline aviaire Ex-FABP, une protéine inhibitrice de l immunité innée, chez les poulets atteints de colibacillose. AMÉLIE GARÉNAUX, SÉBASTIEN HOULE, BENJAMIN FOLCH, GENEVIÈVE DALLAIRE, MÉLANIE TRUESDELL, FRANÇOIS LÉPINE, NICOLAS DOUCET AND CHARLES M. DOZOIS Drummondville, le 27 février 2013 Diversité des Escherichia coli pathogènes Pathogènes intestinaux Entérotoxigénique Entéroaggrégatives Entéroinvasives Entérohémorragiques Pathogènes extra intestinaux (ExPEC) Infections urinaires (UPEC) Méningites (MNEC) Septicémies Infections respiratoires chez la volaille (APEC) = colibacillose aviaire. aérosacculite. sep cémie, infec on généralisée. Risque de zoonoses Belanger et al., 2011, FEMS Immunol Med Microbiol. 1

4 APEC (Avian pathogenic E. coli), modèle ExPEC Un problème économique majeur 20% de mortalité par lots croissance ralentie condamnation des carcasses à l abattoir Dho-Moulin & Fairbrother, 1999, Vet Res. Un modèle d étude adapté Possibilité de travailler avec l hôte naturel Souches APEC proches des autres souches ExPEC (facteurs de virulence communs avec UPEC et MNEC). Les facteurs de virulence des ExPEC Protéines de la membrane externe Cellules de l hôte Fimbriae Fe Capsule LPS Fe Toxines Siderophores : acquisition du fer Concentration en fer nécessaire à la survie des bactéries: 10-7 à 10-5 M. Concentration en fer dans le sérum: M. Miethke and Marahiel, 2007, MMBR. 2

5 Les sidérophores produits par les ExPEC Produite par toutes les entérobactéries = entérobactine glycosylée Spécifiques des pathogènes Garénaux et al., 2011, Vet Microbiol. Rôle des sidérophores dans la virulence des APEC Persistance d une souche APEC et de différents mutants dans les organes 48h après infection. Poumon Rate Foie Souche sauvage (salmo+, aéro+); salmo-, aero+; salmo+, aero-; salmo-, aero-. Dozois et al., 2003, PNAS 3

6 La protéine NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin) Lipocalines: protéines en forme de coupe, capable de lier de petits ligands hydrophobes. Grande diversité de protéines impliquées dans de nombreux processus (prolifération et différenciation des cellules, croissance et réparation du système nerveux, signalisation, inflammation, ) Pagano et al., 2004, Gene. Complexe entre la NGAL Humaine (HNGAL) et l éntérobactine Les salmochélines ne peuvent pas être captées par la HNGAL Entérobactine Salmochéline Goetz et al., 2002, Molecular Cell. Fischbach et al., 2006, PNAS. Y a-t-il un équivalent de NGAL chez le poulet? 4 lipocalines dans le génome du poulet (Gallus gallus): Ex-FABP (24,2% d homologie avec NGAL). Calβ (20,3%) Calγ (27,4%) Ggal-C8GC (20,8%) Pagano et al., 2004, Gene. 4

7 Y a-t-il un équivalent de NGAL chez le poulet? Modélisation: Ex-FABP présente une structure comparable au HNGAL et à l équivalent de HNGAL identifié récemment chez la caille (Q83). Ex-FABP Q83 NGAL Entérobactine Garénaux et al., Vet immunol immunopathol, 2012 Expression des lipocalines aviaires en conditions d infection 6 poulets infectés 10 7 UFC, sac aérien 5 poulets non infectés 48h Nécropsies Organes Extraction d ARN Comparaison poulets infectés/sains 5

8 Expression des lipocalines aviaires en conditions d infection Garénaux et al., Vet immunol immunopathol, 2012 Purification d Ex-FABP et tests d inhibition de croissance MG1655 = souche non pathogène (Ent + salmo) (Ent) (Ent + salmo) (Ent) Pas de fer ajouté Garénaux et al., Vet immunol immunopathol,

9 Purification d Ex-FABP et tests d inhibition de croissance Collection de souches sauvages K12 (Ent) K12 (Ent + sal) QT625 (Ent) QT342 (Ent) QT375 (Ent + sal) QT510 (Ent + sal + aero) QT606 (Ent + aero + ybt) QT485 (Ent + salmo + aero + ybt) Conclusions 4 lipocalines aviaires identifiées chez le poulet. Ex-FABP est la lipocaline la plus exprimée dans les organes (en particulier dans les poumons) suite à une infection par une souche APEC. HNGAL et Ex-FABP ont pu être purifiées et leur capacité à inhiber la croissance de souches d Escherichia coli en milieu pauvre en fer a été évaluée: Ex-FABP: même activité inhibitrice que HNAGL sur les souches productrices d entérobactine. la production de sidérophores spécifiques aux pathogènes (salmochélines, aérobactine, yersiniabactine) permet aux APEC d échapper à la séquestration par Ex-FABP. 7

10 Remerciements 8