TAG, protéases et acides aminés modifiés

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1 TAG, protéases et acides aminés modifiés Les TAG Ce sont des protéines ou des peptides qui permettent la production, la détection, la stabilité et la purification aisée des protéines recombinantes lorsqu'elles sont ajoutées en fusion à la. Elles permettent souvent une meilleure production, en effet l'expression d'ar messager eucaryote dans E. coli se heurte à de nombreux problèmes dus en particulier à la mauvaise initiation de la traduction. i la protéine de fusion est placée en amont de la, on aura normalement une bonne initiation de la traduction. La surexpression de protéines dans E. coli s'accompagne souvent de formation de corps d'inclusion dans lesquels la protéine surexprimée est mal repliée. La fusion avec une autre protéine qui se replie correctement aide souvent à avoir une protéine bien repliée. La protéine de fusion joue alors le rôle de chaperonne intramoléculaire. Elles permettent la détection de la protéine de fusion. En effet on dispose d'anticorps pour les protéines de fusion mais de plus certaines d'entre elles sont des enzymes qui peuvent être détectées par leur activité. Elles permettent une stabilisation de la protéine. Les petits peptides sont rapidement dégradés chez E. coli. Un des moyens pour éviter cette dégradation est donc de les produire en fusion. Les TAG les plus utilisés : Epitopes: Des petites séquences, d'une dizaine d'acides aminé, sont ajoutées généralement à l une des deux extrémités de la protéine, plus rarement à l intérieur. Ces séquences sont reconnues par des anticorps monoclonaux. Ceci permet de localiser la protéine sur des filtres, de la quantifier par ELIA ou de la purifier après immunoaffinité avec un anticorps spécifique. n utilise des épitopes

2 pour lesquels on dispose d'anticorps très efficaces et très spécifiques qui n'ont pas de crossréactivité dans le système utilisé. Il existe plusieurs séquences et les anticorps correspondants commercialisés Xpress : DLYDDDDK (invitrogen) cmyc : EQKLIEEDL (invitrogen). L anticorps a une très bonne affinité pour ce tag, il est donc principalement utilisé pour la détection de la protéine de fusion. FLAG : DYDDDDK (sigma). L anticorps n a pas une très bonne affinité, il est principalement utilisé pour la purification de la protéine de fusion, en effet la liaison anticorpsantigène peut facilement se dissocier. (Hopp et al., 1988) V5 : GKPIPPLLGLDT ((in vitrogen) HA : YPYDVPDYA de l'hémagglutinine d'influenza : (Roche Molecular Biochemicals) épitope de la protéine C : 1 acides aminés (Roche Molecular Biochemicals) L'anticorps présente l'avantage de ne se fixer qu'en présence de calcium, ce qui permet d'éluer la protéine de fusion en présence d'edta. taphylococcus protein A (ilsson et Abrahmsen, 1990). Lac Z : i la séquence est insérée en amont de LacZ en fusion. LacZ garde son activité. Il est donc possible de faire une protéine bifonctionelle, ayant les deux activités, en amont la et en Cterminal l'activité βgalactosidase. La fusion dans l'autre sens n'est pas possible, il faut que l'extrémité Cterminale de la βgalactosidase soit libre pour garder son activité. Cette fusion permet en outre de suivre la protéine lors de la purification. La calmodulinebinding peptide (tofkohahn et al., 199). Cette protéine très acide présente une forte affinité pour certains peptides en présence de calcium. La maltose binding protéine (MBP) de E. coli peut être purifiable sur une colonne d'amylose et éluée avec du maltose. La fusion est généralement effectuée en Cterminal de la MBP, si bien que le peptide signal de la MBP permet de plus d'adresser la protéine de fusion dans le périplasme (Guan et al., 1988).

3 Les interaction streptavidinebiotine sont très utilisées en biologie. Un peptide de 10 acidesaminés mimant la structure de la biotine a été sélectionné à partir d'une banque de peptides, le "streptag" (chmidt et kerra, 1993). Une deuxième stratégie a consisté à sélectionner un peptide de 13 acides aminés qui est facilement biotinylé dans E. coli par BirA, l'enzyme endogène de biotinylation chez E. coli. (chatz, 1993). Dans les deux cas les protéines comportant le peptide mimant la biotine ou le peptide biotinylé peuvent être purifiées par affinité sur la streptavidine. La glutathion transférase de shistosome. Cette protéine catalyse la réaction entre un tripeptide, le glutathion (γglucysgly) et un substrat électrophile. i on utilise un seul substrat, on n'a pas de métabolisation mais uniquement fixation du glutathion sur la glutathion transférase. Cette propriété a été exploitée pour fabriquer des chromatographies d'affinité en bloquant du glutathion sur la phase fixe. La glutathion transférase s'accroche sur le glutathion fixé sur la colonne et est décrochée en ajoutant du glutathion au tampon. L'avantage de cette protéine est son activité enzymatique qu il est possible de suivre. Ainsi, on peut connaître au cours de la production la quantité de protéine produite, sans avoir besoin de faire de gel (mith et Jonhson, 1988). Thioredoxine de E. coli (LaVallie et al., 1993). La purification des protéines de fusions avec la thioredoxine utilisent les propriétés de la thiorédoxine qui peut être extraite des bactéries par choc osmotique et qui est résistante à la chaleur. De plus, un mutant présentant une série d'histidine à sa surface a été construit ce qui permet une purification sur colonne de nickel. Les queues homopolymériques. Plusieurs essais ont été effectués, une queue polyarginine permet la purification de la protéine sur une résine d'échange de cation, une queue polyaspartate permet la purification sur résine échangeuse d'anions, une queue de phénylalanine permet la purification sur colonne d'hydrophobicité de type phényl sépaharose et une queue polycystéine permet la purification sur thiopropylsépharose. Dans ce dernier cas, on accroche la protéine par une liaison covalente et on l'élue soit à l'aide de cystéine soit en ajoutant un

4 agent réducteur tel que le dithiotreitol (Persson et al., 1988). La queue actuellement la plus populaire est une queue histidine ou HItag, ce qui crée un site de haute affinité pour les cations divalents tel que le nickel ou le cobalt. La protéine qui a un tel site s'accroche sur colonne d'affinité de i et se décroche spécifiquement en ajoutant de l'imidazole au tampon. Cette séquence de 6 histidines peut se fusionner aux extrémités ou C terminal de la protéine ou être incorporée dans une protéine de fusion. Par exemple dans le cas d'une fusion avec la thioredoxine, protéine servant à solubiliser les protéines recombinantes produites dans E. coli, la mutagenèse de deux résidus (acide glutamique et glutamine) en histidine produit un amas d'histidine conférant à la protéine une bonne affinité pour le nickel. L avantage de cette fusion est que la séquence rajoutée est petite. Cette technique est actuellement la plus populaire principalement parce que ce tag est petit et à priori va moins perturber la fonction de la protéine (Van Dyke et al., 199) Le domaine de liaison à la cellulose qui est un composant de la cellulase de la bactérie clmostridium cellulovorans peut être utilisé (hpigel et al., 1998). La protéine de fusion est purifiée sur colonne de cellulose. Le principal avantage par rapport aux autres protéines est le faible coût de la colonne d affinité utilisée. Les protéines fluorescentes : La Green fluorescent protein (GFP) d'aequorea victoria émet de la lumière verte lorsqu'elle est excitée en UV. Différents variants émettant à différentes longueur d onde ont été générés par mutagenèse. L EGFP est un variant optimisée pour l expression en cellules eucaryotes. La HcRed a été générée par mutagenèse à partir d une protéine non fluorescente du corail, Heteractis crispa. Elle émet dans le rouge. Ces protéines gardent leurs propriétés de fluorescence en fusion ou C terminale. En fusion, elle permet donc la détection et la localisation de la protéine dans les cellules. Le domaine de liaison de la chitine (Chitinbinding domain, CBD) de la chitinase A1 de Bacillus citrulans. La forte affinité du domaine de liaison à la chitine pour les billes de chitine permet de bien purifier la protéine de fusion, en effet la colonne peut être lavée avec un tampon de forte force ionique (1M acl)

5 pour retirer les liaisons non spécifiques. n décroche la protéine avec des agents dénaturants tels que du D (>0.5%) ou des sels de guanidium (6M). Tetracystéine : Les protéines portant le motif CCXXCC à l intérieur d une hélice α où XX est n importe quel acide aminé peuvent être coloré par un dérivé arsénique de la fluoresceine (FlAsHEDT, 4,5 bis(1,3,dithioarsolan yl)fluoresceine). Ce composé rentre facilement dans les cellules et se lie au Tag avec une forte affinité (10 pm) donnant une fluorescence verte (Griffin et al., 1998). n peut aussi utiliser un dérivé arsenique de la resorufine (ReAsHEDT ). Ce composé présente l avantage d émettre dans le rouge ce qui permet de faire des expériences de pulsechase avec la FlAsHEDT. De plus le ReAsHEDT peut être utilisée pour photoconvertir la diaminobenzidine en un composé insoluble permetttant de détecter la protéine en microscopie électronique (Graham et Karnovsky, 1966). Les protéases ouvent on veut enlever des fusions entre deux protéines après une expression in vitro et purification. Dans ce cas, on intercale entre les deux protéines une séquence qui va coder pour un site de coupure. La coupure peut être chimique par exemple en utilisant le bromure de cyanogène qui coupe au niveau des méthionines ou l'acide iodosobenzoique qui oxide les tryptophane. Ces méthodes marchent bien mais on obtient des coupures à des endroits autres que la jonction, problème qui empire avec la taille de la protéine exprimée. n peut utiliser une méthode enzymatique, des protéases spécifiques d'une séquence. L'enterokinase reconnaît et coupe la séquence AspAspAspAspLys/ La thrombine reconnaît et coupe la séquence LeuValProArg/Glyer. elon le positionnement de la fusion à l'extrémité ou en C terminale, on obtiendra deux ou quatre acide aminés.

6 Le facteur Xa coupe en Cterminal de la séquence de reconnaissance IleGlu GlyArg/ Les TEV protéinase (Tobacco Each Virus Proteinase) reconnaît la séquence Glu XXTyrGln/ avec X symbolisant n'importe quel acide aminé. Cette protéase a l'avantage d'être très spécifique de son site de coupure et de ne pas être inhibée par les inhibiteurs de protéase à sérine (Parks et al., 1994). Il y a plusieurs désavantages à l'utilisation de protéases. la coupure n'est pas toujours spécifique et on peut couper la. La température assez haute nécessaire à la coupure peut affecter la stabilité de la. La coupure est souvent inefficace du fait de l'inaccessibilité du site de coupure dans la protéine de fusion. Après la coupure, il faut retirer la protéine de fusion, qui va s'accrocher sur la colonne d'affinité ayant permis la purification. La protéase est retirée par exemple en utilisant une protéase biotinylée qui va s'accrocher sur une colonne de streptavidine agarose.

7 Intein n peut utiliser des protéines qui sont capables d'autocoupure. C'est le cas par cys cys exemple des sites d'épissages des extein C extein C protéines pour lesquelles on trouve des s (équivalent aux introns) et des extein échange Asn exteins (équivalent aux exons). Ces C extein C épissages ont été trouvés chez des bactéries mésophyles et thermophyles Transestérification extein ainsi que chez la levure. Chez cette dernière, les différentes étapes de Cextein C l'épissage ont été décrites. Clivage n trouve une cystéine au site donneur et une asparagine et une cystéine au site + extein C extein C accepteur. Il y a tout d'abord un échange entre l'azote de la liaison peptidique et le échange H extein C extein C soufre de la cystéine suivi d'une transestérification entre les deux cystéines. Il y a ensuite coupure Exemple de mécanisme d épissage d une intéine. petidique associée à la formation d'un dérivé succinimidique et enfin un nouvel échange entre l'azote et le soufre (Chong et al., 1996). Ce mécanisme a été décrit pour les levure, chez les archéobactéries, il est à peu près équivalent, la cystéine est seulement remplacé par un autre nucléophile, une sérine.

8 Pour obtenir une coupure, on peut utiliser une intéine mutée au site accepteur. La cystéine du site accepteur est alors remplacée par un Tag nucléophile présent dans le milieu (DTT, β échange mercaptoethanol, cystéine...). la est alors placée HCH CH Tag en du site donneur et la coupure par addition du nucléophile sur la colonne d'affinité on obtient une H CH + H Tag élution de la protéine désirée. (Chong H et al., 1997) De la même façon, on peut utiliser le clivage en et C terminal de l'intéine en mutant le site accepteur (Chong et al., tag 1998). En mutant le site accepteur His H proteine 1 intéine C Asn/Cys en GlnAsn/Ala, l induction de la coupure en terminal par des H proteine 1 tag thiols induit le clivage en Cterminal. intéine Dans un tel système le tag est H H H positionné dans une boucle de DTT l e. H H tag proteine 1 H intéine Lors de la production on obtient une H + fusion protéine 1 terminus de C l intéine tag C terminus de l intéine protéine d intérêt. Après induction la protéine de fusion est accrochée sur une colonne d affinité. L action de thiols (cystéine, DTT ou bmercaptoethanol) relarge la protéine 1 et la protéine dans le milieu. Ce système a principalement pour avantage de profiter de la haute traductibilité de la protéine 1. i cette protéine 1 est assez petite, elle peut être ensuite éliminée par dialyse. C

9 Les acides aminés modifiés Comment introduire une sonde dans les protéines à un site spécifique? Une première technique consiste à muter l acide aminé par une cystéine puis à modifier cette cystéine une fois incorporée dans la protéine. n peut substituer un acide aminé par un analogue structural en utilisant une souche auxotrophe (van Hest et al., 000). n peut utiliser une stratégie «non sens». Le but est ici d avoir dans la cellule un aminoacyl tra non sens couplé à l acide aminé non naturel. Un codon ambre est ajouté à l emplacement désirée. Il y a deux possibilités pour fabriquer un aminoacyltra : on peut aminoacétylé un tra suppresseur in vitro (oren et al., 1989) ou on peut ajouter dans la bactérie une aminoacyl tra synthetase modifiée qui ajoute un aminoacid non naturel (Wang et al., 001).