La Molécule Unique. Athel Cornish-Bowden et María Luz Cárdenas

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1 SORBONNE UNIVERSITÉS enzymologie moléculaire et mécanistique 2014 Lundi 10 novembre à Paris La Molécule Unique Athel Cornish-Bowden et María Luz Cárdenas CNRS, Marseille «L industrie opérationnelle de la Nature est tellement prolifique que l on va trouver éventuellement des machines non seulement inconnues à nous mais aussi inimaginables par nos cerveaux» Marcello Malpighi, De Viscerum Structura, 1666

2 introduction général Quelques références utiles Carlos Bustamante important. Ni l un ni l autre de nous n est expert dans la domaine de la. Donc pour aller plus loin dans le sujet il est nécessaire de lire des articles pertinents, par exemple : C. Bustamante (2008) «In singulo biochemistry : when less is more» Annual Review of Biochemistry 77, J. R. Moffitt et C. Bustamante (2014) «Extracting signal from noise : kinetic mechanisms from a Michaelis Menten-like expression for enzymatic fluctuations» FEBS Journal 281, R. Grima, N. G. Walter et S. Schnell (2014) «Single-molecule enzymology à la Michaelis Menten» FEBS Journal 281, C. J. Bustamante, C. M. Kaiser, R. A. Maillard, D. H. Goldman et C. A.M. Wilson (2014) «Mechanisms of cellular proteostasis : insights from singlemolecule approaches» Annual Review of Biophysics 43, K. C. Neuman et A. Nagy (2008) «Single-molecule force spectroscopy : optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy» Nature Methods 5, G.-W. Li et X. S. Xie (2011) «Central dogma at the single-molecule level in living cells» Nature 475,

3 pourquoi travailler avec la? Comparaison entre les études «in singulo» et «in multiplo» In multiplo : Caractéristiques des expériences sur des grands ensembles de molécules (typiquement >10 15 à la fois) : Robustes ; Les mesures sur la population donnent des résultats moyens ; Les populations doivent être considérées comme homogènes (même si on sait que ce n est pas vrai). In singulo : Caractéristiques des expériences sur une : Il y a des fluctuations ; Le comportement est stochastique ; Le comportement d une peut être très loin de la moyenne ; On peut étudier des populations non-homogènes ; Il y a des pauses et des recules : le progrès n est pas continu.

4 pourquoi travailler avec la? Proteínas expuestas a fue Beaucoup de systèmes dans les êtres vivants sont des moteurs, qui génèrent ou répondent à des forces mécaniques. Activation de Arf/Sar Récepteur Liberación Libération de vésicules vesículas Recrutement des protéines bar et des adaptateurs bar Transporteur Tubulation de la membrane Excision Compartement source Éloignement de la vésicule

5 pourquoi travailler avec la? Beaucoup de systèmes dans les êtres vivants sont des moteurs, qui génèrent ou répondent à des forces mécaniques. Moteurs moléculaires Motores moleculares moteur de myosine filament d actine vésicule

6 pourquoi travailler avec la? Beaucoup de systèmes dans les êtres vivants sont des moteurs, qui génèrent ou répondent à des forces mécaniques. estas a fuerzas mecánicas in vivo ulas Séparation des chromosomes Separación de cromosomas

7 pourquoi travailler avec la? Beaucoup de systèmes dans les êtres vivants sont des moteurs, qui génèrent ou répondent à des forces mécaniques. Emballage de virus Empacamiento de virus

8 pourquoi travailler avec la? et nombres de molécules Why single Molecule Methods? Cellule d Escherichia coli : 1 µm 3 approximativement 1 molécule One molecule dans 1 in µm an 3 : E. 1/6 coli 23 = cell 1.7 (about x mol µm 3 dans in volume) l, is c est-à-dire at a 1.6 nm Cela concentration c est approprié of ~ pour, 1.6 nm. par exemple, le contenu en adn, mais d autres types de molécules peuvent être présents à des concentrations très variables des dizaines de molécules jusqu à des milliers. Par exemple, une concentration de 1.6 µm signifierait 1000 molécules. Mais dans la cinétique classique on travaille habituellement avec des volumes beaucoup plus grande que 1 µm 3 : 1 nm dans 1 ml représente molécules.

9 pourquoi travailler avec la? et nombres de molécules Mais dans la cinétique classique on travaille habituellement avec des volumes beaucoup plus grande que 1 µm 3 : 1 nm dans 1 ml représente molécules. On doit donc poser la question : est-ce que la cinétique classique, comme décrite au debut de ce cours, est toujours utile? Oui, parce qu elle permit d établir la mécanisme cinétique avec précision, et de proposer les questions qu un étude plus détaillé doit adresser. Si la concentration du substrat est plus plus grand que celle de l enzyme même un facteur de 5 suffit qualitativement l équation de Michaëlis Menten tient toujours. J. R. Moffitt et C. Bustamante (2014) «Extracting signal from noise : kinetic mechanisms from a Michaelis Menten-like expression for enzymatic fluctuations» FEBS Journal 281, R. Grima, N. G. Walter et S. Schnell (2014) «Single-molecule enzymology à la Michaelis Menten» FEBS Journal 281,

10 pourquoi travailler avec la? Une moyenne peut être trompeuse. Quand vous mesurez une propriété moléculaire d un ensemble de molécules vous pouvez être en train de mesurer une population homogène, ou une population où les molécules existent dans plus qu un seul état. «Il y a deux morceaux de pain : vous en mangez deux, moi aucun. Consommation moyenne : un morceau par personne» Nicanor Parra (écrivain, poète et physicien chilien) La personne moyenne a un peu moins d un testicule et un peu moins d un ovaire. Est-ce utile de parler dans ces termes? Regardons l idée d une moyenne de plus prêt

11 pourquoi travailler avec la? Une moyenne peut être trompeuse. Quand vous mesurez une propriété moléculaire d un ensemble de molécules vous pouvez être en train de mesurer une population homogène, ou une population où les molécules existent dans plus qu un seul état. Deux populations moyenne La moyenne ne correspond ni à l une ni à l autre Une population (large) Mieux, mais une gamme large de possibilités n est pas prise en compte Une population (étroite) Beaucoup mieux, mais toujours pas idéal

12 Pausas pauses Une molécule ne travaille pas forcément d une manière continue, et on ignore tout cela si on ne considère que le comportement moyen : adn inséré Cell (2011) 144:480 Temps Pause «Burst» Moteur du virus φ29 pour insérer son adn dans une bactérie

13 pauses Ramón Latorre On trouve exactement la même chose pour des systèmes complètement différents, par example un canal Primeros ionique est estudios parfois de «ouvert moléculas» et parfois individuales «fermé» ouvert fermé Latorre et al. À noter que les changements entre les états sont irréguliers. Profesor Ramón Latorre R. Latorre, G. Ehrenstein and H. Lecar (1972) «Ion transport through excitabilityinducing material (eim) channels in lipid bilayer membranes» Journal of General Physiology 60, 72 85

14 Francis Crick Diferentes métodos de manipulación individuales y aplicación de fu Aimants Extension Rotation Pinzas magnéticas Perle Molécule à Microscopía manipuler de fuerza atóm Pinzas ópticas

15 étodos de manipulación Microscopie de à moléculas force iduales y aplicación de fuerza s Gerd Binnig Laser détecteur Microscopía de fuerza atómica «Position-sensitive detector» detecteur sensible à position Cantilever Molécule à manipuler Scanner piézoélectrique

16 («optical tweezers») Rayon laser Objectives de microscope Arthur Ashkin pticas Perle en polystyrène Molécule à manipuler Rayon laser Micropipette en verre N 5

17 Comparaison entre les : 1. Caractéristiques physiques meilleur moins bon Résolution spatiale (nm) Résolution temporale (s) (électromagnétiques) Microscopie à force (2 10) (10 4 ) 10 3 Rigidité (pn/nm) (10 4 ) Gamme de force (pn) Gamme de déplacement (nm) Taille de la sonde (µm) ( ) ( ) K. C. Neuman et A. Nagy (2008) «Single-molecule force spectroscopy : optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy» Nature Methods 5,

18 Comparaison entre les : 2. Généralités Applications typiques Caractéristiques Limitations Manipulations en 3D Essai captif Essai d intéractions Bruit et dérive faibles Dégats photolytiques Chauffage nonspécifique de l échantillon (électromagnétiques) Essai captif Topologie d ADN (Manipulation en 3D) Serrage de force Rotation des perles Intéractions spécifiques Aucune manipulation (Hystérésis de force) Microscopie à force Extension à force élévée et essais d intéractions Imagerie à haute résolution Sonde grande et rigide (Hystérésis de force) Force minimale élevées Non-spécifique K. C. Neuman et A. Nagy (2008) «Single-molecule force spectroscopy : optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy» Nature Methods 5,

19 emballage du phage φ29 dans une bactérie le Empacamiento de virus ADN Particule virale Un virus ne peut pas se réproduire tout seul. Il doit utiliser l appareil de réproduction de son hôte. Pour faire cela il faut introduire son ADN dans l hôte. C. Bustamante et J. R. Moffitt (2010) «Viral DNA packaging : one step at a time» Springer Series in Chemical Physics 96,

20 emballage du phage φ29 dans une bactérie Cellule d'écoulement N S Marqueur fiducial Aimants de terre rare Objective S N Perle paramagnétique ADN C. Bustamante et J. R. Moffitt (2010) «Viral DNA packaging : one step at a time» Springer Series in Chemical Physics 96,

21 emballage du phage φ29 dans une bactérie Chambre Flow cell! de cellule d écoulement chamber! Sam Leachman picture Aimant Dual hybrid hybride magnet double! Appareil CCD! photographique camera! C. Bustamante et J. R. Moffitt (2010) «Viral DNA packaging : one step at a time» Springer Series in Chemical Physics 96,

22 emballage du phage φ29 dans une bactérie 240 C. Bustamante and J.R. Moffitt ADN Capsid Moteur d emballage Connecteur parn gp16 Fig The packaging motor of the bacteriophage ϕ29. (a) Cryo elect microscopy (EM) reconstruction of the capsid with the packaging motor comp The DNA has been modeled in to set the relatively scale. (b) Cyro-EMreconstr tion of the C. different Bustamante et components J. R. Moffitt (2010) of«the Viral DNA packaging motor: : one step the at a time dodecameric» Springer Series connec in gene product Chemical 10 Physics (gp10), 96, the pentameric prna ring, and the pentameric ATP

23 emballage du phage φ29 dans une bactérie Sous-unité active (vert) remettre Phase de pause Phase de «burst» Cette mécanisme explique l alternance entre phases de pause et phases de «burst» que nous avons vues avant. Il aurait été impossible de l éclaircir par des expériences sur des grands ensembles. Sous-unité après transition qui l engage l ATP à l hydrolyse (rouge) Pausas déclencher Pause «Burst» C. Bustamante et J. R. Moffitt (2010) «Viral DNA packaging: one step at a time» Springer Series in Chemical Physics 96,

24 remarques finales L approche de la permet de voir les variations qui se produisent pendant le fonctionnement de n importe quel mécanisme enzymatique. Toutes ces fluctuations se produisent aussi lorsque nous utilisons des classiques qui étudient des grands ensembles de molécules (par exemple, la cinétique de Michaelis-Menten décrite au début de ce cours), mais nous ne les voyons pas parce que nous ne voyons que le comportement moyen. Pour un compte rendu complet des différences entre les classiques et de la les revues de Moffitt et Bustamante et de Grima, Walter et Schnell et collègues répertoriées au début sont très utiles. J. R. Moffitt et C. Bustamante (2014) «Extracting signal from noise : kinetic mechanisms from a Michaelis Menten-like expression for enzymatic fluctuations» FEBS Journal 281, R. Grima, N. G. Walter et S. Schnell (2014) «Single-molecule enzymology à la Michaelis Menten» FEBS Journal 281,

25 fin Nos remerciements chaleureux à Christian Wilson (Universidad de Chile) pour son aide précieuse dans la préparation de ce cours.