Proteinuries : Détection et limites. J.P. Cristol, A.S. Bargnoux, G. Mayoral, B. Canaud.

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1 Proteinuries : Détection et limites J.P. Cristol, A.S. Bargnoux, G. Mayoral, B. Canaud.

2 Filtration / Réabsorption de l albumine Concentration dans l espace de Bowman = (6 x 10-4 ) x albumine plasma = 24 µg/ml soit pour un filtrat de 100 ml/min albumine filtrée : 2.4 mg/min = 3.5 g/j Liaison à un récepteur transport transtubulaire Endocytose dissociation lysosomiale régurgitation de fragments Excretion : moins de 30 mg/j ~ 1/100 de l albumine filtrée Protéinurie Protéines tubulaires (~ 2O mg/j)

3 Protéinurie pysiologique : Aspect qualitatif.

4 Protéinurie : histoire naturelle situations cliniques 30 mg/j 300 mg/j 3 g/j 20µg/mn 200µg/mn 2 mg/mn IRCT Physio -logique µ-albuminurie protéinurie S. néphrotique Dépistage et caractérisation

5 Proteinuries : Détection et limites I) Macroprotéinurie : Aspects méthodologiques

6 Bandelette urinaire: Limites Méthodes instantanées Sans appareillages urines non centrifugées Vérifier le ph urinaire (faux positifs si ph alcalin) et le ramener si nécessaire à ph acide voisin de 4. Faux positifs avec la bilirubne Faible sensibilité ( 150 mg/l) Affectée par la composition protéique: très faible réactivité avec les chaînes légères

7 Méthodes de Laboratoire : Méthodes par précipitation: Dosage de la protéinurie totale en milieu acide (trichloracétique (TCA) ou sulfosalicylique) ou en milieu alcalin (chlorure de benzethonium) avec détection en turbidimétrie ou en néphélémétrie Méthodes colorimétriques: colorants se fixant aux protéines avec modification du spectre d absorption: Bleu de Coumassie, Rouge de Pyrogallol, violet de pyrocathécol

8 Répartition des méthodes en France

9 Méthodes colorimètriques : limites Sous-estimation des gamma globulines (en particulier Interférences (1): réactivité non homogène chaînes légères) avec TK colorimétriques Petits fragments protéiques peu reconnus Pb du choix du calibrant: albumine, globulines ou mélange albumine/globuline Ajout de SDS Faux positifs

10 Sous-estimation des chaînes légères libres par le rouge de pyrogallol 7,5 g/l 7 g/l 4,3 g/l Patient connu avec myélome multiple

11 Influence du calibrant sur le dosage des protéines urinaires Calibrant Abbot : Alb 70%, Globulines 30%

12 Les faux positifs : les solutions colloïdes. 250 Pu (pyrogallol) Mg/mmol créat AlbU (életrophorèse) 50 4, Pré-op (n=6) post-op (n=6) Pré-op (n=6) post-op (n=6) Carys et al. NDT Hordijk et al. NDT

13 Les solutions colloïdes : Interferences analytiques Hordijk et al. NDT Sharkey. Clinical Chemistry

14 Mode d expression : Valeur /24 h ou rapport excrétion protéines/créatinine

15 Analyse qualitative de la protéinurie Analyse du culot urinaire : Méthodes Electrophorétiques : Electrophorése simple : sélectivité (>90% albumine)? Suspicion de paraprotéines Immunoélectrophorése, gammapathie monoclonale, chaînes légères Détermination individuelle de chaque protéine : b2m, a1microglobuline, albumine. Enzymes : N-acetyl-β-glucosaminidase (NAG) Méthode globale (protéomique urinaire) :

16 Protéines «marqueurs» Protéine MM (kda) Valeurs (mg/l) b2m 12 <0,5 Lysozyme 14 <0,5 RBP 21 <0,5 Chaînes légères 25 <10 A1-microgl 33 <15 Albumine 70 <20 Transferrine 80 <2 IgG 150 <10 A2-macrog Tamm- Horsfall 700O <40

17 Electrophorèse des protéines urinaires 1 : Nle 2 : Tubulaire 3 : Chaînes légères + trace Igl 4 : Chaînes légères 5 : marqueurs de poids 1 : Nle 2 : Tubulaire 3 : Mixte + Chaîne légère 4 : Mixte 5 : Chaînes légères

18 Identification des paraprotéines

19

20 Dosage pondéral des protéines: adaptation graphique normal tubular complet Glomerular selective

21 Marqueurs urinaires et sepsis creat Diagnosis Prerenal/NTA Detect subclinical or Predict AKI Predict mortality α-1-microgl +? +? β-2-m + + +? RBP +??? Cystatine C +??? NAG Métaanalyse sur 14 articles, 683 patients dont 337 septiques Bagshaw et al., Avril 2007 Intensive care Med

22 NAG et pronostique rénal dans les glomérulopathies Probabilité de maintenir une fonction rénale normale Idiopathic membranous nephropathy Focal Segmental glomerulosclerosis Bazzi et al., 2002 NDT

23 Une approche protéomique est-elle possible? 7 = transferrin; 11 = albumin; 17 = a1-antitrypsin; 30, 63 and 68 =albumin homolog fragment; 31, 36 and = kininogen; 66 = leucine-rich a2- glycoprotein; 72 = tissue-specific transplantation antigen P35B; 86, 87 and 91 = phorbolin-3; 130 and 131 = E-cadherin; 145 = hypothetical protein; 193 = growth hormone; and 230 = unidentified V Thongboonkerd and P Malasit, Proteomics 2005

24 Proteinuries : Détection et limites I) Aspects méthodologiques : - La protéinurie se determine par des méthodes colorimétriques (rouge de pyrogalolle) - Variabilité selon la nature de la Pu, le calibrant, interferrences analytiques - Expression des résultats : mg/mmol de créat - Le dosage pondéral de protéines spécifiques (tubulaires) est accessible II) Microalbuminurie :

25 Microalbuminurie: Aspects méthodologiques Immunoanalyse: Ac spécifiques Radioimminologie Néphélémétrie, turbidimétrie Bandelettes réactives: +Sb et + Sp utilisant le principe de la chromatographie et de l immunoanalyse

26 Microalbuminurie : Méthodes Immunoturbidimétriques 1,8 + 4,3 Watts GF et al., Clim Chem, 1986

27 Expression des résultats Urines de 24 H: mg/24h Urines de la nuit: µg/min Spot urinaire: mg/l ou ratio albumine/créatinine en mg/mmol

28 Spot urinaire du matin : Expression en g/l ou en ration sur créatinine? mg/l ratio Prevent GANSEVOORT et al., KI, 2005

29 Spot urinaire du matin : Expression en g/l ou en ration sur créatinine? mg/l Derhaschnig et al., NDT, 2002

30 Screening methods Microalbuminuria testing Marshall et al., Clin Chem 1992

31 Détection de la microalbminurie par bandelette : DSII Incerti et al, NDT 2005

32 Screening methods Microalbuminuria testing Croal et al., Clinica Chemical Acta 2001

33 Screening methods Microalbuminuria testing Croal et al., Clinica Chemical Acta 2001

34 L utilisation des bandelettes réactives doit rester prudente : l exemple de la grossesse Waugh et al., BJOG: an International Journal of Obstetrics and Gynaecology, 2005

35 HPLC: surestiation de la microalbuminurie. Détection de fragments? Brinkman et al., NDT, 2004

36 Proteinuries : Détection et limites I) Aspects méthodologiques : - La protéinurie se determine par des méthodes colorimétriques (rouge de pyrogalolle) - Variabilité selon la nature de la Pu, le calibrant, interferrences analytiques - Expression des résultats : mg/mmol de créat - Le dosage pondéral de protéines spécifiques (tubulaires) est accessible II) Microalbuminurie : - Les méthodes immunonéphélémétriques et imunoturbidimétriques sont équivalentes - Expression doit prendre en compte le ratio alb/créat - Le dépistage par bandelette est possible III) Microalbuminurie : au-delà des néphropathies

37 La protéinurie, un facteur de risque cardiovasculaire chez les diabétiques 2 Survie (mortalité toutes causes) Normoalbuminurie (n = 191) Microalbuminurie (n = 86) Macroalbuminurie (n = 51) Suivi (années) P<0.01 normo- vs microalbuminurie; P<0.001 normo- vs macroalbuminurie; P<0.05 micro- vs macroalbuminurie. Gall et al. Diabetes. 1995;44:

38 Microalbimurie : un facteur de risque en population générale (Framinghan study) (n=1568 non diabetiques, non hypertendus) Median : 3,9 µg/mg men 7,5 µg/mg women Arnlov et al, Circulation2005

39 Microalbuminurie et risque de décès N= (85 421, résultats sur non HTA, non dyslipidemique, non fumeur, non diabétique, sans ATCD cardiovascualrie 9.8 mg/l 3.8 mg/l 9.8 mg/l 3.8 mg/l Prevention of Renal and Vascular End Stage Disease, PREVEND Hillege HL et al, Circulation 2002; 106:1777

40 Microalbuminurie et mortalité cause CV Cause non CV 95 %) 95 %) Hillege et al, Circulation 2002; 106:1777

41 Microalbuminuria/Proteinuria Associated With Increased Risk For CV Mortality in Type 2 Diabetics 4 Normalbuminuria Microalbuminuria Proteinuria 3.85 Relative Risk of Death Death due to CHD Death due to Stroke Death due to All CV Causes* * = Heart disease, Ischemic heart disease, Heart failure, and/or Cerebrovascular disease Normoalbuminuria (n=460) <30mg/L; Microalbuminuria (n=208) >30mg/L; Proteinuria (n=172) >300mg/L) Adapted from Valmadrid CT et al. Arch Intern Med. 2000;160:

42 Existe-t-il un lien entre CRP et Microalbuminurie? Répartition de la CRP et de la µalb dans une population apparemment saine Hao et al., «The Takahata Study» internalmedicine

43 Liens entre µalb et CRP CRP (µg/l) 2 1,6 1,2 Femmes (p<0,001) Hommes (p<0,001) 0,8 0,4 0 Q1 Q2 Q3 Q4 Microalb Nakamura, Internal Medicine 43, 2004

44 Liens entre µalb et inflammation Festa et al, Inflammation and microalbuminuria, KI, 2000

45 L inflammation amplifie la microalbuminurie Etude PREVEND Stuveling EM et al. Hypertension

46 L inflammation et la microalbuminurie : Intrication dans le syndrome Métabolique Mean value of log CRP Number of metabolic disorders - No diabetes - Dupuy et al. Gérontology DOI: /internalmedicine

47 Composant du syndrome métabolique et microalbuminurie Palanappian et al., American Journal of Hypertension 2003; 16:

48 Proteinuries : Détection et limites I) Aspects méthodologiques : - La protéinurie se determine par des méthodes colorimétriques (rouge de pyrogalolle) - Variabilité selon la nature de la Pu, le calibrant, interferrences analytiques - Expression des résultats : mg/mmol de créat - Le dosage pondéral de protéines spécifiques (tubulaires) est accessible II) Microalbuminurie : - Les méthodes immunonéphélémétriques et imunoturbidimétriques sont équivalentes - Expression doit prendre en compte le ratio alb/créat - Le dépistage par bandelette est possible III) Microalbuminurie : au-delà des néphropathies - La microalbiminurie est un marqueur de dysfonction endothéliale - L inflammation et la microalbuminurie sont des facteurs de risque intriquées