DS n 2. Thème 1 - La vasopressine. 1A1) L inositol est un sucre inclus dans les phospholipides membranaires de type PIP2.

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1 DS n 2 Thème 1 - La vasopressine 1A1) L inositol est un sucre inclus dans les phospholipides membranaires de type PIP2. Le but de cette expérience est de révéler l influence de la vasopressine sur la teneur en une petite molécule cytosolique, l IP3. La culture sans vasopressine sert de témoin : la teneur en IP3 radioactif est alors stable à une valeur de zéro. L ajout de vasopressine provoque l apparition d IP3 radioactif dans le cytosol des hépatocytes. Le taux d IP3 est augmenté de 150 % en 8-10 secondes : cette valeur se stabilise ensuite autour de 160 %. Les barres d erreurs étant larges, les variations observées entre 10 et 30 minutes ne sont pas significatives. Cet IP3 étant radioactif, il provient des phospholipides marqués à l inositol radioactif. => hypothèse : IP3 serait issu de l hydrolyse du PIP2 membranaire, suite à l ajout de vasopressine. 1A2) Le but de cette expérience est de connaître un autre effet de la vasopressine sur la composition de la membrane des hépatocytes. Sans vasopressine (étude témoin), il y a dans la membrane plasmique environ 3 DAG pour phospholipides. Cette valeur est stable dans le temps. Lors de l ajout de vasopressine à 10-8 M, le rapport de DAG pour 1000 phospholipides augmente de façon importante, passant de 3,5 à 11 nmol de DAG pour nmol de phospholipides. Il y a donc eu un rapport multiplié par 3. Le rapport entre DAG et phospholipides étant multiplié par 3, on peut imaginer que : - il y a eu apparition de DAG dans les membranes ; - il y a eu disparition de phospholipides ; - les deux. De l étude des molécules, on peut imaginer que le PIP2 hydrolysé et libérant IP3, il reste, dans la membrane, le DAG. L annexe nous permet d écrire la réaction suivante : PIP2 -> DAG + IP3 et cette réaction serait déclenchée par la présence de la vasopressine. 1B1) Cette étude vise à préciser l action de l IP3 apparu dans le cytosol suite à l arrivée de l hormone. L étude témoin montre que la phosphorylase kinase reste sous forme inactive, b, dans une cellule non soumise à la vasopressine. La quantité de phosphorylase a (active) augmente au cours du temps après ajout de vasopressine. La quantité passe de 9 à 22 unité.g -1 en environ 15 secondes, soit une augmentation d un facteur proche de 2,5.

2 La vasopressine induit l activation de la phosphorylase kinase. Cette activation est postérieure à l apparition de l IP3 dans le cytosol des hépatocytes (qui apparaît dès 8 secondes d après 1A1). On peut donc émettre l hypothèse de l action de l IP3 comme un second messager qui, en relais de la vasopressine, va activer l enzyme. Une autre voie pourrait aussi être envisageable. 1B2) L expérience montre la corrélation entre la vasopressine et l IP3 dans le taux de calcium intracellulaire. La fluorescence est proportionnelle à [Ca 2+ ]intracellulaire. L ajout d IP3 et de vasopressine conduisent au même résultat : la fluorescence passe de 0 à 175 DmV.s. Il y a une forte augmentation de la fluorescence, reflet de la hausse de [Ca 2+ ]intracellulaire très importante (x 175). Le maximum est atteint au bout de 6 secondes dans les deux cas, ce qui est un peu plus rapide que dans les expériences précédentes (mais non expliqué). Vasopressine et IP3 conduisent tous deux à une forte hausse de [Ca 2+ ]intracellulaire. Celui-ci pourrait provenir du reticulum où il est stocké. La précision des mesures n est pas suffisamment indiquée pour savoir si on peut interpréter le léger décalage entre les deux courbes : la vasopressine semble avoir un retard de moins d une minute par rapport à l injection directe d IP3. Cette information irait dans le sens d un relais d IP3 vis à vis de la vasopressine. Ce serait alors IP3 qui induirait la libération du Ca 2+ du reticulum vers le cytosol. 1B3) Afin de relier les deux résultats 1B1 et 1B2, une étude in vitro est menée sur une solution pure de phosphorylase kinase, avec différentes concentrations de CaCl2 (c est-à-dire Ca 2+ et Cl - ). Sans calcium, l activité de la phosphorylase kinase est de 10 3 cpm. Cette valeur nous sert de référence (témoin). À une valeur de [Ca 2+ ] = 10-6 M, l activité est de puis elle augmente de façon importante aux alentours de [Ca 2+ ] = 10-5 M pour atteindre une valeur qui semble maximale, cpm pour [Ca 2+ ] = 10-4 M, soit 14 fois plus que sans calcium. La forme de la courbe est une sigmoïde. Les ions Ca 2+ constituent un activateur de l enzyme phosphorylase kinase. Cet ion semble avoir un effet d activateur allostérique : il pourrait se lier à l enzyme. Il faudrait quelques informations supplémentaires sur la biochimie de cette enzyme pour confirmer ou non ce comportement allostérique, à relier à une éventuelle structure IV aire. Bilan L ensemble de ces 3 études semble montrer que la vasopressine provoque l apparition d IP3 cytosolique et que celui-ci pourrait libérer des ions Ca 2+ depuis le reticulum. Cette hausse de [Ca 2+ ] dans le cytosol provoquerait alors l activation de l enzyme phosphorylase kinase.

3 1C1) L autre produit de l hydrolyse du PIP2 est le DAG, qui reste membranaire. Son implication dans le mode d action cellulaire de la vasopressine est étudié ici. Sans DAG, la phosphorylase kinase n est pas phosphorylée. L ajout progressif de DAG montre une relation entre la [DAG] et le degré de phosphorylation de l enzyme, jusqu à atteindre plus de 90% pour [DAG] = 20 µg.ml -1. La courbe ne semble pas sigmoïde mais la précision et le nombre de points de mesure (4!) ne sont pas très fiables. Le DAG stimule la phosphorylation de la phosphorylase kinase. Le DAG n est pas une enzyme donc n est pas responsable directement de la phosphorylation. Le DAG activerait une voie de phosphorylation par une enzyme, probablement de type kinase. 1C2) Cette étude vise à relier l activité de la protéine kinase C (PKC) et les résultats obtenus avec le DAG. Ici, l activité de la PKC est testée sur un substrat différent de la phosphorylase kinase : il s agit d une protéine nucléaire basique, une histone. Le témoin sert de valeur de référence : 100 %. En présence de Ca 2+, la PKC est plus active : 125 %. Les barres d erreur sont réduites et cette augmentation d activité est significative. En présence de PIP2, phospholipide membranaire non hydrolysé en IP3 et DAG, la PKC montre une activité identique à celle du témoin. Enfin, la présence de DAG à 2,5 µg.ml -1 augmente fortement l activité de la PKC : + 170%. La PKC est une enzyme qui peut phosphoryler un substrat. Elle est activée par la présence de Ca 2+ mais plus encore par le DAG. En appliquant ces résultats aux hépatocytes soumis à la vasopressine, on peut imaginer que le DAG va stimuler l activité de la PKC qui va alors phosphoryler la phosphorylase kinase. 1D) La phosphorylase kinase semble, d après les documents précédents, activée à la fois par le Ca 2+ et par son état de phosphorylation. Pour préciser l implication de ces deux facteurs, une étude cinétique est menée. La phosphorylase kinase est inactive sous sa forme b, non phosphorylée. Sans Ca 2+, l activité catalytique est faible (<1 µmol.min -1.mg -1 ). Les autres formes sont actives : la forme la plus active est la forme a, phosphorylée et en présence de Ca 2+, cet ion pouvant se lier à l enzyme. Les formes seulement phosphorylées ou seulement en présence de Ca 2+ donnent des résultats intermédiaires. La phosphorylase kinase est activée : - par les ions Ca 2+ qui pourraient se lier à l enzyme et provoquer un changement conformationnel propice à l activité catalytique ; - par son état de phosphorylation. L enzyme la plus active aurait lié à la fois Ca 2+ et un ou plusieurs groupements phosphate, ajoutés par la PKC.

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5 Thème 2 - Les claudines 2A) Le profil d hydrophobicité montre que, bien que les séquences des 2 protéines soient assez différentes (seulement 72 acides aminés en commun sur 211), le comportement de la chaîne d acides aminés est à peu près le même : on retrouve 4 régions protéiques à indice d hydrophobicité élevé. On peut donc émettre l hypothèse d une protéine à 4 hélice α transmembranaire. On peut donc représenter les 2 protéines comme suit : mais les données de l expérience ne permettent pas d orienter la membrane. Remarquons que là où les aa sont différents dans la séquence des deux claudines, ils sont souvent de même comportement (résidu hydrophile ou hydrophobe). 2B) Le lanthane est une petite molécule extra-cellulaire dense aux électrons. Lorsqu elle est ajoutée du côté apical, on remarque que le lanthane diffuse bien entre les microvillosités mais ne pénètre pas dans les cellules. Il ne diffuse pas non plus entre les deux cellules épithéliales et semble bloqué par le point de contact entre les deux cellules (légende = jonction serrée). Les jonctions serrées semble bloquer le transport paracellulaire du lanthane du côté apical au côté basal. De la même manière, le lanthane ajouté sur la face basale peut diffuser librement dans le milieu extracellulaire mais ne parvient pas à accéder au côté apical car il ne franchit pas les jonctions serrées. Les jonctions serrées constituent donc bien une barrière étanche, même aux petites molécules : mais les ions? Doc 2B2 A - L électrophorèse (technique du Western blot) en haut du graphique permet de visualiser la quantité de claudine 4 exprimée dans les cellules en fonction de la quantité de répresseur (doxycycline). Ainsi, nous voyons qu à 10 ou 1 ng/ml de doxycycline, la claudine n est pas exprimée. A un taux de 0,1 ng/ml, il y a un peu de claudine présente et en dessous de 0,01 ng/ml, on a chaque fois une forte quantité de claudine. En parallèle, le passage des ions par voie paracellulaire est mesuré : il est reflété par la conductance (passage des ions). Nous voyons que plus il y a de claudine présente, moins les ions peuvent passer entre les cellules. La conductance est divisée par 4 lors de l expression croissante de claudine. Présente en forte quantité (à partir de 0,01 ng/ml de doxycycline), la conductance stagne à 7 ms/cm 2. ccl : les claudines constituent un réseau étanche (observé en cryofracture) qui atténue fortement le passage des ions entre les cellules épithéliales. Doc B - Le passage du mannitol est testé en absence de claudine (à 10 ng/ml de doxycycline ) ou en présence d une forte quantité de claudine (sans doxycycline). Quelles que soient les conditions expérimentales, le mannitol franchit l épithélium avec la même vitesse. Donc soit le mannitol passe par la voie transcellulaire (c est un soluté non chargé mais il fait partie de la famille des sucres, donc étant hydrophile, il ne traverse probablement pas les membranes mais peut utiliser des trasnporteurs), soit il peut franchir les jonctions serrées. ccl : les claudines forment une zonula occludens qui empêche le passage des ions mais peut-être pas des petites molécules non chargées.

6 2C) Claudine 4 : un aa à résidu chargé + est remplacé par un aa à résidu chargé - Claudine 15 : 3 aa à résidus chargés - sont remplacées par des aa à résidus chargés + Ces mutations n ont pas perturbé l agencement des zonula occudens. La voie transcellulaire n est pas affectée non plus. Claudine 4 : en forte quantité, elle limite le passage des ions Na + du fait de sa charge + en position 65. Si on ôte cette charge, la sélectivité n existe plus. Donc le domaine *** est extracellulaire et contrôle la voie paracellulaire. Claudine 15 : sa charge - dans le domaine *** augmente au contraire le flux de Na + (par complémentarité de charges). En échangeant la charge - par une charge +, les ions qui traversent sont alors des anions. On a bien interaction de ces aa avec les ions qui passent. Conclusion : le domaine *** extracellulaire des claudines contrôle le passage des ions par voie paracellulaire. Les aa présents servent de filtre de sélectivité (comme pour les canaux ioniques). Schéma.