Diagnostic moléculaire des maladies monogéniques ( suite ) Certaines maladies génétiques sont dépistés à la naissance pour tout le monde.

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1 Génétique: 12/10 Dr. Biancalana 16h à 18h Zimmermann Noémie Voltz Raphaël Diagnostic moléculaire des maladies monogéniques ( suite ) IV. Intérêt diagnostic moléculaire et réalisation 1. Dépistage néonatal systématique Certaines maladies génétiques sont dépistés à la naissance pour tout le monde. Méthodes biochimiques, enzymatique... Génétique moléculaire: Phénylcétonurie (PCU) depuis 1972 Hypothyroïdie congénitale (HU) depuis 1978 Drépanocytose (HbS) depuis 1989 dans les DOM-TOM et 1995 en métropole ( population à risque ) Hyperplasie des surrénales (HCS) depuis 1995 Mucoviscidose (CF) depuis 2002 Environ 5000 maladies génétiques Critères : Maladie connue, grave et relativement fréquente Test de dépistage disponible qui soit fiable, applicable au grand nombre et d'un coût acceptable. Bénéfice individuel du diagnostic précoce pour le patient ( permet une meilleure prise en charge de l'enfant ) La mucoviscidose fut l'objet d'un débat au sujet de son dépistage systématique, en effet plus la prise en charge est instauré précocement, plus le taux de survie est meilleure ( séances de kinésithérapie avant même le début des symptômes améliorent la qualité de vie ) mais cela ne va pas guérir la maladie, de plus, le diagnostic de mucoviscidose n'est pas corrélé à la sévérité de la maladie. Pour autant, le bénéfice étant réal, elle est désormais dépistée systématiquement. 2. Dépistage postnatal pour un patient Le dépistage postnatal doit être initié et ciblé sur pré requis clinique, avec plus ou moins d'explorations complémentaires. Intérêt pour le patient : Confirmation du diagnostic clinique ( ex: un enfant avec un retard, on ne sait pas forcément quelle maladie il a, avec le diagnostic moléculaire on saura ) Permet l'arrêt des explorations pour identification de la cause de la maladie Permet le conseil génétique Pronostic (corrélation phénotype-génotype) : savoir si la maladie va empirer ou pas, s'il y a 1/13

2 un risque de récurrence ou pas Prise en charge Amélioration de la qualité de vie En fonction de l'histoire naturelle de la maladie ( risque cardiaque, risque opératoire, risque infectieux,...chirurgie préventive ( cancer du colon, du sein ou de l'ovaire ) ) Traitement Essai thérapeutique Association familial ( aide à la prise en charge d'un enfant malade...) Intérêt pour la famille: Conseil génétique en fonction du mode de transmission ( savoir s'ils sont porteurs de la maladie qui va se déclarer plus tardivement par exemple ) 3. Dépistage postnatal pour la famille Diagnostic pré symptomatique ( = ici la personne est porteuse de la mutation et sera atteinte, mais est trop jeune pour être malade ) Médecin consultation pluridisciplinaire déclarée au ministère Interdit chez les mineurs sauf s'il y a un intérêt de faire de diagnostic avant 18 ans, la maladie surviendra avant Diagnostic porteur asymptomatique ( = personne qui n'aura jamais de signe clinique mais a un risque de transmettre, se voit dans le mode de transmission autosomique récessif ) Médecin consultation de génétique Interdit chez les mineurs 4. Dépistage prénatal Dépistage prénatal Médecin de la consultation de génétique et gynécologue Prélèvement : Biopsie de trophoblaste (12SA), liquide amniotique (17SA), sang fœtal (20SA). Le prélèvement peut se faire à n'importe quel moment de la grossesse. Remarque: Détermination du sexe fœtal dans le sérum maternel (10SA) où circule de l'adn libre du fœtus. Ceci est possible pour toutes la maladies liées à l'x : en amplifiant l'y, on connait le sexe du fœtus. S'il n'y pas de Y, il n'y a aucun risque de maladies liées à l'x, du coup on ne fera pas de diagnostic prénatal par prélèvement du trophoblaste qui peut induire un accouchement précoce. Conséquence: Précaution d'accouchement, prise en charge du bébé IMG ( pas de délais, peut se faire jusqu'au jour prévu de l'accouchement ) 5. Dépistage pré-implantatoire Ce dépistage est fait pour les couples qui ne veulent pas prendre de risque d'avoir un enfant atteint, pour ainsi éviter l'img, mais aussi parce que souvent, il y a une infertilité du couple dû à la maladie génétique. Dans ce cas, on réimplantera seulement les embryons non porteurs de la mutation. 2/13

3 Comment? Examen clinique Arbre généalogique (mode de transmission, consanguinité) Origines géographie et ethnique (dans les maladies où les spectres de mutations dans les gènes varient en fonction de l'origine ethnique) +/- Tests complémentaires => Orientation vers un diagnostic => Orientation choix du/des gène(s) à tester => Recherche en laboratoire (organisée en réseaux en France) ex: Site Orphanet (européen) : on y trouve une page pour les professionnels et une pour les familles, tout les modes de transmission liés à la maladie, les laboratoires qui font le diagnostic, les projets de recherche, etc... Prescription et Législation Consentement éclairé Attestation de consultation - confirmation du diagnostic - asymptômatique, présymtômatique, prénatal, préimplantatoire Prescription par consultation génétique Laboratoire de diagnostic génétique => Agrément ministériel : organisation, matériel, expérience, équipe médicale et technique Résultat validité par biologiste agrée (agrément ministériel) envoyé uniquement au clinicien qui figure sur le consentement il revient au patient d'informer les membres de sa famille «à risque» V. Myopathie de Duchenne et Myopathie de Becker. Essais cliniques. Un même gène responsable de deux maladies Clinique Dystrophie musculaire progressive proximale 2 formes : - Duchenne (DMD): sévère - Becker (BMD): moins sévère 1. Clinique Myopathie de Duchenne Remarque : les signes cliniques ne sont pas à apprendre par cœur, ils sont donnés juste pour informations Premiers symptômes: Age: 2-3 ans Anomalies de la démarche, chutes fréquentes, difficultés à se relever Évolution clinique: Faiblesse musculaire prédominant sur la ceinture pelvienne et les cuisses. Hypertrophie des mollets (régénérescence) puis amyotrophie Extension de l'atteinte musculaire: muscles distaux, membres supérieurs, muscles para-vertébraux, respiratoires ( intercostaux, diaphragme) 3/13

4 Perte de la marche: 7-10 ans. Avant 13 ans par définition Rétractations tendineuses des membres, cyphoscoliose Atteinte cardiaque: cardiomyopathie dilatée Insuffisance respiratoire Retard mental: 1/3 des patients, en général modéré Décès: ans ( insuffisance cardio-respiratoire) 2. Clinique Myopathie de Becker Premiers symptômes : Age de début très variable ( 3 à 77 ans ) Évolution clinique: Forme moins sévère que la myopathie de Duchenne Progression plus lente Pas de perte de la marche avant ans, par définition (souvent plus tard, 30 ans) Insuffisance cardiaque souvent mal tolérée 3. Fréquences et mode de transmission Duchenne: 1/3 500 naissances masculines Becker : 1/ naissances masculines Récessif lié à l'x: atteinte des garçons, transmission par les femmes ( rare +++ que les femmes soient atteintes) 1/3 des garçons atteints = mutation de novo Mode de transmission: Conseil génétique dans la famille Dans cette famille, l'homme 3 est atteint de la myopathie de Becker. Femmes conductrices obligatoire? la femme 7 ( a hérité du X muté de son père ) sauf s'il ne s'agit pas de sa fille. Statut de 1 : dans 1/3 des cas, il s'agit d'une mutation de novo, donc dans 2/3 des cas, elle est conductrice. Femmes non conductrice? La femme 8 n'a aucun risque d'être atteinte ( son père n'étant pas malade 4/13

5 donc il n'a pas de X muté, qui a été transmis à sa fille ) Pour les femmes 4 et 5: tout dépend si la femme 1 est conductrice ou pas. Le risque est donc = 2/3 x ½ (risque d'avoir le X muté ) + risque que la mutation survienne de novo et que le gamète transmis soit porteur de la mutation ( environ 15%) 4. Le gène Anomalie du gène codant pour la dystrophine (= protéine assurant la «charpente» du muscle) Le gène de la dystrophie (3685 AA): Xp21 Très grand gène : 79 exons (grands introns) 2300kb génomique; nombreux transcrits donc si on travaille avec de l'arn, faire attention à être dans le bon tissu (cérébral, musculaire, cérébelleux...). Ces différentes formes sont obtenues par usage de promoteurs différentiels = explique que certains enfants ont des atteintes cognitives et pas d'autres. (ex: si mutation au début = dans la forme musculaire et pas cérébrale, si mutation à la fin du gène = atteinte musculaire et cérébrale) 5. Les mutations Représentation de chaque exons, avec une fin droite ou en flèche pour montrer s'ils sont en phase (droite) ou pas (flèche), un exon ne se termine pas forcément pas un AA pile. Ex: la première base du codon sur un exon et les deux suivantes sont sur l'exon suivant. Si on enlève l'exon 4 = délétion en phase et le reste n'est pas modifié. Si on enlève le 17 = hors phase, tout le reste est mal lu. Délétions : - 60 à 70% - Concentrées sur deux régions = «hot spot» de délétions en E3-8 et E44-48 Duplications : 5-10% Mutations ponctuelles : 30-35% ( mutations non sens, mutations faux-sens, mutations d'épissages, etc...) 6. Différence entre DMD et DMB DMD : ~ absence de dystrophine ( 0 à 3% ) BMD : quantité normale ou diminuée et/ou taille anormale de la dystrophine Délétion et duplication «hors phase» : pas un multiple de 3 ce qui entraîne un décalage du cadre de lecture et l'apparition d'un codon stop. La protéine est donc absente. => DMD Délétion et duplication «en phase» : multiple de 3, il a donc un respect du cadre de lecture, la protéine est raccourcie ou allongée. => BMD 7. Démarche diagnostique Un gène de 79 exons qui peut être l'objet de plusieurs mutations (délétions, mutations ponctuelles...) 5/13

6 Tests de première intention : 60-70% de délétions ( recherchés en premier car plus fréquents) 5-10% de duplications On effectue un PCR du gène de la dystrophine par PCR multiplex. Tests de seconde intention = recherche de mutations ( MS, NS...) dans 79 exons Recherche de variants par DHPLC,HRM.. RT-PCR Ceci est très long et couteux. Seulement deux laboratoires spécialisés en France (savent tout d'un point de vue technique et interprétation) La démarche diagnostique consiste à : tout d'abord rechercher les signes cliniques puis le mode de transmission effectuer un dosage des CPK (créatine phosphokinase = enzymes musculaires sériques) qui lorsque celui ci est élevé ( >> 10x ) signe une anomalie biologique (destruction du muscle). Mais attention, ce n'est pas spécifique de DMD et BMD mais doit être présent!!! biopsie musculaire: histologie : anomalies évocatrices mais non spécifiques (aspect dystrophie musculaire) immunohistochimie : soit grâce à des anticorps spécifiques anti-dystrophine, on observe alors un marquage de la dystrophine à la périphérie des fibres musculaires. Chez les personnes atteintes de DMD, il n'y a pas de marquage et chez celles atteintes de BMD, le marquage est plus faible et discontinue. Ceci permet un diagnostic de certitude. Western-blot = étude extrait de protéine que l'on met à migrer, grâce à un contrôle normal on sait où est attendu la protéine et on regarde si elle est présente ou pas chez le patient. Ceci permet une estimation semi quantitative de la dystrophine et une mesure de la taille de la dystrophine présente. absence totale de marquage ( 0 à 3% ) permet le diagnostic de certitude pour DMD dystrophine diminuée en taille, diminuée en quantité ou augmentée (duplication) permet un diagnostic de certitude pour BMD 8. Intérêt diagnostic moléculaire Voies thérapeutiques : exemples essais thérapeutiques Pharmacothérapie : Le patient a une mutation stop (sévère car pas de protéine), mais tout les acides aminés ne sont pas très important, alors on essaye d'insérer un acide aminé (un fauxsens est préférable à un non-sens) PTC124, molécule qui ressemble à un ARN de transfert et amène un acide aminé au niveau des codons stop prématurés et anormaux: «trans lecture» des codons stop Production de protéines avec un faux sens mais plus ou moins fonctionnelle selon l'acide aminé inséré Biothérapie : PRO-051 (mars 2010): «saut d exon» (exon skipping) par oligonucléotide anti-sens qui vont masquer les sites d'épissages d'un exon Les mutations les plus fréquentes sont les délétions, qui décalent le cadre de lecture Restauration du cadre de lecture et production d'une protéine tronquée mais plus ou moins fonctionnelle 6/13

7 Kinali et al, Lancet Neurol 2009, 8 : Délétion et résultats prédictifs de l exon skipping : En cas de délétion avec décalage du cadre de lecture, utilisation d un oligomère modifié qui «courtcircuite» l exon 51 ou plus si nécessaire comme dans certain cas de Becker. Il y a donc une restauration de la phase et une production de protéines plus courtes mais stables. On passe donc d'une forme de myopathie de Duchenne à celle de Becker qui possède un phénotype plus modéré. Expérience : «saut d exon» par oligonucléotide antisens L'essai a été réalisé sur des souris et on voit qu'on bout de quelques semaines de traitement, la dystrophine a été resynthétisé en partie. Donc ça marche. Maintenant il faut essayer chez l'homme. 7/13

8 Pour réaliser un essai chez l'homme, une boite pharmaceutique doit contacter la boite européenne, qui contactera les curateurs nationaux. Aux niveau de la France, il y a une base nationale de 2400 patients présentant la maladie. Cette base contactera tous les CHU qui font le diagnostique, dans le but de pouvoir inclure des patients à l'essai. Et tout cela peut se faire en 2 semaines. Pour retrouver tout les patients, on utilise les banques de données de mutation d'un gène, où les patients y sont inscrits avec toutes leurs données clinique et autres (spectre de mutation, corrélation génotype/phénotype, épidémiologie...) de manière anonyme via un code. Et pour finir, les patients doivent consentir à l'essai pour y être inclut. Exemple de l'essai à Strasbourg pour la maladie de Duchenne: Sur 191 patients à Strasbourg, 17 qui présentaient une anomalie dans un exon qu'on pouvait faire sauté Critère d'inclusion: entre 6 et 14 ans, doit pouvoir marcher 75 mètres... Au final, seulement 5 remplissaient tout les critères Tout les patients n'acceptent pas pour divers raison Remarque : Il existe d'autres essais avec des virus recombinants où le type de mutation n'est pas très important. VI. Mucoviscidose «fibrose kystique du pancréas» (Cystic Fibrosis) 1. Clinique Il en existe plusieurs formes : une classique et plusieurs atypiques a) Forme classique (pas à savoir dans le cadre de ce cours, mais toujours bon à savoir) Début dès la naissance ou dans les premiers mois de vie Médiane de survie a ~ ans en France actuellement Atteinte respiratoire = Facteur majeur du pronostic et de la qualité de vie Sécrétions visqueuses infections chroniques + destruction progressive du parenchyme pulmonaire Kiné respiratoire, Antibiothérapie, Oxygénothérapie Atteinte digestive Insuffisance pancréatique avec syndrome de mal absorption (85%) Diabète plus fréquent chez les adultes Cirrhose biliaire (5%) (pronostic vital majeur) Obstruction intestinale distale Iléus méconial (15-20%) en période néonatale Hyperéchogénicité intestinale anténatale (3 a 10% sont des mucoviscidoses) Stérilité 98% des hommes atteints sont stériles par Agénésie Bilatérale des Canaux Déférents (ABCD) Les femmes sont fertiles b) Forme atypique 8/13

9 Mucoviscidose modérée sans atteinte pancréatique et à début tardif (<10%) Formes mono-symptomatiques de l adulte Bronchectasies diffuses Pancréatite chronique de l adulte jeune Stérilité masculine par ABCD isolée (parfois seul signe d'appel chez l'homme) 50 a 80% des ABCD ont une anomalie du gène CFTR Fréquence La plus fréquente des maladies autosomiques récessives graves dans les populations d origine européenne : 1/2500 naissance avec un gradient sud/nord et est/ouest. 3. Mode de transmission et conseil génétique dans la famille Transmission autosomique récessive Exceptionnelles mutations de novo Fréquence des porteurs hétérozygotes (normal muté): 1/25 Le risque pour que l'enfant de gauche soit malade est de 1/50 puisqu'il recevra un allèle muté de son père, et qu'il a 50% de chance d'avoir un allèle muté de sa mère (qui n'est pas malade) tout en sachant qu'elle a 1 chance sur 25 d'être une porteuse hétérozygote de la maladie. 1/50 est considéré comme un gros risque et donc un diagnostique prénatal peut être demandé par les parents s'ils le désirent. Pour l'enfant de droite, comme il n'y a quasiment pas de mutation de novo, le risque est de 1/150 qui est également un gros risque avec possibilité de diagnostique prénatal. La mère a, comme dans le cas précédent, un risque de 1/25. Par contre le père a un risque de 2/3 d'être porteur d'un allèle muté (il n'est pas malade dans ce cas) parce que ses parents (donc les grands-parents de l'enfant) sont normaux mutés. Ils peuvent par conséquent avoir 4 types d'enfants: un malade (homozygote), et 3 sains dont 2 porteurs sains de la mutation (hétérozygotes), et un dernier sans mutation. Le père est sain, il a donc par déduction 2 chances sur 3 d'être porteurs de la mutation. L'enfant a donc une probabilité de ¼ de recevoir la mutation de chacun de ses parents s'ils sont mutés. 1/25 x 2/3 x ¼ = 1/150 9/13

10 Remarque: le losange symbolise un enfant pas encore naît. 4. Le gène CFTR localisation : 7q31 27 exons Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator code pour protéine = un canal chlorure dans les cellules épithéliales glandulaires Anomalies moléculaires : perte de fonction de la protéine Canal chlorure déficient rétention dans la cellule des ions Cl- empêche la sortie passive d eau déshydratation du mucus viscosité du mucus 5. Les mutations Plus de 1200 mutations décrites sur tout le gène Nombreuses mutations privées (appartient à une seule famille) Tous les types possibles (en majorité des mutations ponctuelles) Et environ 200 polymorphismes décrits Corrélation génotype phénotype très fort! 6. Les mutations fréquentes F508del (ΔF508) dans l exon 10 Mutation la plus fréquente : 70% des chromosomes mutés en France Environ 50% des atteints sont homozygotes pour F508del Fréquence due a un effet fondateur (possibilité d'avoir un effet protecteur contre le choléra en étant hétérozygote) Une trentaine de mutations ont une fréquence entre 0,1 et 5% Mutations spécifiques de l origine géographique 10/13

11 W1282X juifs Ashkénazes G551D origine celte 394delTT populations scandinaves. Connaître l'origine permet de bien cibler les analyses! 7. Démarche diagnostique Test de la sueur = Test diagnostic Les enfants atteints se déshydratent plus vite avec un excès de sel dans la sueur Positif chez plus de 90% des patients, après l'âge de 2 mois (avant cette âge, on ne peut pas le faire) Trypsine immunoréactive Trypsine: Enzyme synthétisée par le pancréas Concentration plasmatique augmentée dans la mucoviscidose Utilisée pour le dépistage néonatal Nombreux faux positifs Un gène 27 exons - plusieurs mutations (mutations ponctuelles, ) Test 1ère intention : recherche ciblée des 36 mutations les plus fréquentes par PCR multiplex (87% des mutations dans une population de descendance européenne) On cherche 2 mutations / patient Si une des deux mutations n'a pas été trouvé, ou les deux: Tests 2nd intention: recherche plus lourde Recherche non ciblée 27 exons! Très long et couteux => 3 laboratoires spécialises en France Indication diagnostic moléculaire signes cliniques forme classique ou atypique Anténatal Postnatal dépistage néonatal trypsine immunoréactive + mode de transmission Si deux mutations ne sont pas trouvées avec le test de 1ère intention : il faut risque résiduel > 1/500 pour continuer Importance origine ethnique Turquie : 36 mutations <70% mutations Afrique Noire : 31 mutations extrêmement rares, existe 3 autres mutations Si la personne est originaire d'europe, et que l'on a trouvé qu'une des deux mutations on arrête les recherches, parce qu'on fait le calcul de risque qui doit être supérieur à 1/500. Et ce qui détermine le fait qu'on dépasse ou pas ce 1/500, c'est l'origine ethnique. VII. Diagnostique moléculaire : Démarche actuelle et perspectives 1. Démarche actuelle 11/13

12 Quand on fait un diagnostique moléculaire, on utilise la PCR qu'on fait soit sur de l'adn, soit sur de l'arn, parfois aussi des études protéiques (maladies musculaires). Ces analyses sont soit quantitatives, soit qualitatives et les interprétations sont plus ou moins lourdes, visuelle et/ou a l aide de logiciel de calculs ou de comparaison. On fait une recherche ciblée ou non? Si on se retrouve face à une maladie qui est du à une mutation dans un gène, s'il y a une mutation majoritaire c'est très rapide à faire. Si on trouve la mutation, c'est ça sinon c'est pas ça. Et s'il n'y a pas de mutation majoritaire, il y a une graduation avec des recherches de plus en plus lourdes, chères, longues... Un gène une mutation majoritaire: diagnostique moléculaire simple, indications cliniques larges Un gène plusieurs mutations dont des fréquentes (ex: myopathie de Duchenne et mucoviscidose) Un gène mutations variées (quasiment que des mutations privées) Plusieurs gènes : même maladie (Diagnostic moléculaire lourd = Recherche non ciblée exon par exon : Indications plus strictes) Délai d'analyses : 3 jours à plusieurs mois voire années Si utile pour le patient et/ou pour sa famille Si recherche de mutation lourde : indications strictes : Diagnostic clinique très orienté (ex: DMD BMD) Diagnostic moléculaire justifié (ex: HYP = rachitisme vitamino-résistant) Risque de mutation important Amélioration du diagnostic moléculaire Organisation en réseau des laboratoires en France Développement technique automatisation Nouvelles technologies d analyse du génome en perspective 12/13

13 Remarque: le séquençage à haut débit (pour le génome tout entier) n'est pas une amélioration du séquençage avec la méthode de Sanger (exon par exon). C'est une nouvelle technologie. 2. Perspectives Exemple d'un article emblématique : Article sur la Neuropathie de Charcot-Marie-Tooth : Pour trouver la mutation, le groupe a séquencé le génome entier d'un patient. L'auteur est le patient lui-même: James Lupski qui est atteint d'une forme modérée de la maladie. Après avoir cherché toute sa vie la mutation à l'origine de sa maladie, il s'est séquencé et a finit par trouver mais a également trouvé des mutations normalement responsables d'autres maladies, notamment une maladie très sévère qu'il n'a pas! Donc des patients ont un diagnostique de maladie erroné!! Les nouvelles technologie vont remettre en cause tout un tas de diagnostique. Conclusion: Au lieu de séquencer chaque gène et chaque exon un par un, on peut faire tout le génome, tout les exons,... Mais il y a toujours des problèmes de coût (chère). Il y a également des problèmes d'éthique. Actuellement on fait des recherches ciblées, alors qu'en séquençant tout le génome on peut tout voir, comme d'autres maladies, des prédispositions aux cancers,... Alors on le regarde? Si on le voit, on le dit? 13/13