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1 This article appeared in a journal published by Elsevier. The attached copy is furnished to the author for internal non-commercial research and education use, including for instruction at the authors institution and sharing with colleagues. Other uses, including reproduction and distribution, or selling or licensing copies, or posting to personal, institutional or third party websites are prohibited. In most cases authors are permitted to post their version of the article (e.g. in Word or Tex form) to their personal website or institutional repository. Authors requiring further information regarding Elsevier s archiving and manuscript policies are encouraged to visit:

2 Annales de pathologie (2013) 33, Disponible en ligne sur ARTICLE ORIGINAL Accréditation de l activité de pathologie moléculaire selon la norme ISO Principales étapes à respecter et principaux écueils possibles Accreditation of the activity of molecular pathology according to ISO 15189: Key steps to follow and the main potential pitfalls Élodie Long a,1, Véronique Hofman a,b,1, Marius Ilie a,b,1, Kevin Washetine a,b, Virgine Lespinet a, Christelle Bonnetaud b, Olivier Bordone b, Virginie Gavric-Tanga b, Marie Clotilde Gaziello b, Sandra Lassalle a, Éric Selva b, Katia Zahaf a, Aude Lamy c, Jean-Christophe Sabourin c, Paul Hofman a,b, a Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale (LPCE), hôpital Pasteur, CHU, BP 69, Nice, France b Tumorothèque, centre de ressources biologiques, hôpital Pasteur, CHU, BP 69, Nice, France c Laboratoire de pathologie, CHU de Rouen, 1, rue de Germont, Rouen cedex, France Accepté pour publication le 16 novembre 2012 Disponible sur Internet le 30 janvier 2013 MOTS CLÉS Biologie moléculaire ; Pathologie moléculaire ; Assurance qualité ; Accréditation ; Norme ISO Résumé L émergence rapide des thérapeutiques ciblées et personnalisées nécessite de pouvoir répondre rapidement aux attentes des oncologues pour l optimisation de l offre de soin aux patients atteint d un cancer. Cela implique d organiser un secteur de biologie (ou pathologie) moléculaire de grande qualité, afin de rechercher les différents biomarqueurs tissulaires à visée théranostique. Il s agit d une activité nouvelle pour le pathologiste dans le cadre de sa mission «sanitaire», réservée le plus souvent jusqu à présent à une activité de diagnostic morphologique. Cette mise en place impose la connaissance et la maîtrise d une nouvelle spécialité dans les établissements de soins. Ainsi, la pathologie dite «moléculaire» ou «biologie moléculaire adaptée aux tissus ou aux cellules» peut parfaitement s implanter dans l enceinte des laboratoires d anatomie pathologique. Cette nouvelle mission que peut assumer le pathologiste doit se faire dans le cadre d une assurance qualité d excellence devant conduire à l obtention d une accréditation selon la norme ISO Celle-ci sera incontournable à court terme pour pouvoir pérenniser cette activité. Cet article a pour but de décrire les grandes étapes à respecter dans le cadre d une démarche d accréditation en pathologie moléculaire selon la norme Auteur correspondant. Adresse hofman.p@chu-nice.fr (P. Hofman). 1 Ces auteurs ont contribué de façon identique à ce travail /$ see front matter 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

3 Création d un secteur de pathologie moléculaire 13 ISO Les différents chapitres et sous-chapitres de cette norme et leur adaptation à la pathologie moléculaire ne sont pas décrits de façon exhaustive, mais dans leur grande ligne. Nous insisterons sur les principales difficultés à maîtriser dans le cadre de cette démarche d accréditation Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. KEYWORDS Molecular biology; Molecular pathology; Quality assurance; Accreditation; ISO Summary The quick emerging of the several targeted therapies and the concept of personnalized medicine underlie the necessity to develop and to well organize a molecular biology (or molecular pathology) unit of high quality, dedicated to clinical care, in order to look for tissular and cellular theragnosis biomarkers. This new and sudden area of activity for a clinical pathologist is strongly linked to the knowledge of a new medical speciality in health care institutions. Thus, the molecular pathology (or molecular biology made from cellular or tissular samples) can nicely be implemented in a clinical pathology laboratory. This new mission for a pathologist has to be done in respect with a great quality assurance which should allow obtaining in a short-term an ISO accreditation to keep going to perform this activity. The present work aims to describe the main steps to be set up in the order to get an ISO accreditation in molecular pathology. The different chapters of this norm will not be described in their exhaustivity, but in their large lines. Finally, we will describe the potential difficulties and pitfalls to be avoided before getting this accreditation Elsevier Masson SAS. All rights reserved. Introduction : l accréditation d un secteur de pathologie moléculaire selon la norme NF ISO 15189, un véritable enjeu pour le futur des pathologistes Depuis plusieurs décennies, les pathologistes ont acquis différents outils afin d améliorer la prise en charge des patients atteints d un cancer [1]. Mais ce n est qu assez récemment que le pathologiste est devenu un acteur central de cette prise en charge grâce à son implication directe dans la prédiction à la réponse thérapeutique par l observation des modifications moléculaires spécifiques à une tumeur. L administration de thérapies ciblées fondée sur la présence d altérations génétiques identifiables au sein des tumeurs, en particulier des carcinomes, a entraîné une révolution dans le cadre de la gestion des prélèvements tissulaires et cellulaires pris en charge dans les laboratoires d anatomie pathologique [2 11]. Ainsi, après une étape d évaluation morphologique et de diagnostic histologique et immunohistochimique, le pathologiste doit maintenant être capable d orienter, dans les plus brefs délais, les prélèvements dans un secteur spécialisé où seront recherchées les différentes altérations moléculaires. Certaines anomalies génétiques somatiques sont déjà «classiquement» identifiables par le pathologiste grâce aux méthodes d hybridation in situ permettant de les visualiser «à travers des images». Cependant, la plupart de ces altérations génomiques, comme la présence de mutations ponctuelles, sont recherchées et mises en évidence, notamment après extraction de l ADN tumoral réalisée à partir d échantillons tissulaires ou cellulaires, dans une unité spécialisée de biologie moléculaire. Il peut paraître paradoxal qu un bon nombre de pathologistes, faute certainement de temps dédié à réaliser cette activité ou d un niveau d expertise suffisant, aient délaissé cette mission «sanitaire» aux biologistes dont les compétences dans les techniques requises (en particulier, extraction et amplification des acides nucléiques, méthodes de séquençage) étaient acquises depuis longtemps de part leur formation et leur exercice. Il semble toutefois opportun que les «pathologistes morphologistes» puissent acquérir très rapidement des compétences «solides» en biologie moléculaire et devenir ainsi aussi des «pathologistes moléculaires» [12,13]. Les modifications rapides des techniques et de leur indication dans le domaine de l oncologie devraient faire changer la vision du pathologiste dans ses approches diagnostiques, pronostiques et théranostiques. Ainsi, une adaptation rapide pour de nouvelles orientations de la spécialité en anatomie pathologique devrait être inéluctable. Dans ce contexte, plusieurs questions restent encore ouvertes : (1) le pathologiste doit-il ou peut-il gérer de façon concomitante les secteurs du diagnostic morphologique et du diagnostic moléculaire? (2) Doit-on créer un département de pathologie moléculaire dans un laboratoire de pathologie clinique ou morphologique? Cette dernière possibilité peut engendrer une compétition brutale avec les laboratoires de biologie médicale et donc avec les biologistes. La mise en place d un tel secteur de pathologie moléculaire dans un laboratoire d anatomie pathologique est toutefois contraignante, soumise à la parfaite maîtrise des méthodes, à une connaissance approfondie de la génétique moléculaire des tumeurs solides et à des normes d hygiène et de sécurité très rigoureuses. Cette mise en place a également un coût qui doit être évalué. Il semble cependant assez logique qu une vision «transversale» et «globale» du diagnostic histologique, du diagnostic immunohistochimique, de la «qualité» des tissus dédiés aux analyses moléculaires (maîtrise de la phase préanalytique et richesse du matériel tumoral), des contraintes et des limites ainsi que des outils de biologie moléculaire permettent une gestion optimale et renforcent la fiabilité du diagnostic moléculaire en oncologie somatique. La «pathologie moléculaire», contrairement à la biologie moléculaire réalisée à partir des fluides biologiques, est relativement difficile à standardiser. Dans ce contexte, il est

4 14 É. Long et al. indispensable d homogénéiser le plus possible les pratiques, d harmoniser les procédures et de participer activement aux démarches d assurance qualité. La maîtrise du système de management de la qualité (SMQ) dans le domaine de la pathologie moléculaire associée à la maîtrise des techniques ou du «processus métier» propre à ce secteur doivent inciter les équipes travaillant avec du tissu tumoral et transmettant aux cliniciens des résultats de pathologie moléculaire à envisager très rapidement une démarche d accréditation. La norme la plus adaptée pour cela est la norme ISO [14 17]. Cette norme vient en complément des recommandations formulées antérieurement dans le guide de bonne exécution des analyses, ou GBEA [18]. L accréditation est définie dans le chapitre 3.1 de cette norme comme étant «une procédure selon laquelle un organisme faisant autorité fournit une reconnaissance formelle qu une personne ou une organisation est compétente pour réaliser des tâches spécifiques». Toutefois, les standards décrits dans la norme ISO s appliquent de façon très générale à tous les laboratoires de biologie, et les différents points des chapitres et sous-chapitres de cette norme concernant la qualité et les compétences ne prennent pas en compte les spécificités des tests de biologie moléculaire. Ainsi, le périmètre (ou portée) de la pathologie moléculaire à accréditer est particulièrement difficile à appréhender, car souvent moins adapté à la norme, s éloignant des pratiques automatisées des analyses de biologie médicale plus conformes pour pouvoir obtenir une accréditation ISO En France, les tests moléculaires sont accessibles à tous les patients en fonction des indications posées par les oncologues, grâce au travail considérable réalisé par l Institut national du cancer (INCa) et au développement de 28 plateformes hospitalières de génétique moléculaire réparties sur l ensemble du territoire national. Ces tests moléculaires actuellement non remboursés par la sécurité sociale, sont pris en charge grâce au financement perenne octroyé par l INCa à ces différentes plateformes. L accréditation de ces plateformes n est pas actuellement une nécessité pour réaliser ces tests. Inversement, dans certains pays européens, comme la Belgique, les tests moléculaires ne sont remboursés que s ils sont réalisés dans des laboratoires accrédités selon la norme ISO On peut donc raisonnablement envisager que ce principe puisse s étendre à la France dans un futur assez proche. Après un bref rappel sur les grands chapitres de la norme ISO 15189, et avoir abordé quelques remarques et points sensibles, nous détaillerons les principaux points susceptibles de faire l objet de critiques et de discussions lors des audits du Comité français d accréditation (Cofrac) dans un secteur de pathologie moléculaire. Ces points seront décrits en fonction de certains sous-chapitres des chapitres 4 et 5 de la norme ISO Ces sous-chapitres paraissent «plus délicats» et/ou très importants à maîtriser dans le cadre d une activité de pathologie moléculaire. Il s agit notamment de la prescription des actes et des contrats avec les prescripteurs, de la gestion des phases préanalytique, analytique et postanalytique, de la métrologie, de la gestion documentaire, de la formation, de l habilitation et de l évaluation du personnel, de la gestion des contrôles de qualité intralaboratoire et interlaboratoire, de la validation/vérification des méthodes et la dynamique d amélioration continue. Enfin, les principaux pièges possibles dans la pratique de la pathologie moléculaire «en routine hospitalière» seront rapidement exposés. Bref rappel sur la norme ISO et de ses grands principes La démarche qualité en pathologie (biologie) moléculaire doit être celle de la norme ISO 15189:2007, sachant qu une version 2011 devrait voir le jour rapidement. L ISO (organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d organismes nationaux de normalisation (comités membres de l ISO). L élaboration des normes internationales est confiée aux comités techniques de l ISO. L ISO a été élaborée par le comité technique ISO/TC 212, des laboratoires d analyses de biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 140, des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro. Au final, la norme a été adoptée par le Comité européen de normalisation (CEN). Cette norme a donc une reconnaissance européenne. Toutefois, une certaine ambiguïté persiste en ce qui concerne l activité d anatomie pathologique (à partir de laquelle seront transmis les échantillons tissulaires et cellulaires pour réaliser l activité de biologie moléculaire), puisque cette norme est surtout bien définie pour les activités des laboratoires de biologie médicale. Une seule certitude est que les laboratoires de pathologie pratiquant en leur sein une activité de «biologie» médicale comme la biologie moléculaire doivent être accrédités pour ce secteur selon la norme ISO Il faut préciser ici que les termes de «certification» et «d accréditation» ne signifient pas la même chose, alors que ces termes sont parfois employés à tort de façon indifférente. La certification (norme NF en ISO 9001:2008 ou norme NF S :2011 pour les biobanques en France) repose sur la maîtrise du système de management de la qualité (SMQ), alors que l accréditation impose une double maîtrise, celle du SMQ et celle des exigences techniques. La norme ISO se décline en cinq grands chapitres (Tableau 1). Le premier chapitre concerne le «domaine d application» de la norme (ici ce domaine est destiné aux laboratoires de biologie médicale). Le chapitre 2 traite brièvement, en les citant, des références normatives. Ces deux premiers chapitres sont très courts. Le troisième chapitre est consacré aux termes et aux définitions utilisés dans le cadre de la démarche d accréditation. Pour un pathologiste, il s agit ici d un nouveau langage à acquérir et il est indispensable de lire ce chapitre et de retenir les définitions avant de se lancer dans une démarche d accréditation, faute de quoi le dialogue avec les ingénieurs qualité et avec l organisme accréditeur deviendra difficile, voire impossible. Ce sont les chapitres 4 et 5 qui constituent en fait «le gros morceau» de la norme. Le chapitre 4 concerne les exigences relatives au management du laboratoire. Il s agit notamment de la responsabilité et de la mise en place d une organisation, du système de management de la qualité, de la gestion et de la maîtrise des documents, de l établissement et de la revue de contrats, des relations avec les services extérieurs et de l amélioration continue. Le chapitre 5 concerne les «exigences techniques». Sous ce terme se cache en fait l activité quotidienne du laboratoire qu il faut formaliser et détailler dans des procédures. Ces exigences techniques englobent non seulement l activité du personnel (dont la compétence est à démontrer), mais aussi la fiabilité et la conformité du matériel, des équipements, des locaux, la gestion des consommables, et la maîtrise des phases préanalytique, analytique et post-analytique. C est à ce niveau qu apparaît un sous-chapitre particulièrement important : la validation des méthodes déployées dans le laboratoire

5 Création d un secteur de pathologie moléculaire 15 Tableau 1 Liste simplifiée des différents chapitres et sous-chapitres de la norme ISO Listing of the different chapters and subchapters of the ISO Chapitres de la norme ISO Sous-chapitres de la norme ISO Intitulés 1 Domaine d application 2 Références normatives 3 Termes et définitions 4 Exigences relatives au management 4.1 Organisation et management 4.2 Système de management de la qualité 4.3 Maîtrise des documents 4.4 Revue de contrats 4.5 Analyses transmises à des laboratoires sous-traitants 4.6 Services externes et approvisionnement 4.7 Prestations de conseils 4.8 Traitement des réclamations 4.9 Identification et maîtrise des non-conformités 4.10 Actions correctives 4.11 Actions préventives 4.12 Amélioration continue 4.13 Enregistrements qualité et enregistrements techniques 4.14 Audits internes 4.15 Revue de direction 5 Exigences techniques 5.1 Personnel 5.2 Locaux et conditions environnementales 5.3 Matériel de laboratoire 5.4 Procédures préanalytiques 5.5 Procédures analytiques 5.6 Assurer la qualité des procédures analytiques 5.7 Procédures post-analytiques 5.8 Compte rendu des résultats pour conduire au diagnostic. Les grandes lignes concernant les chapitres et les sous-chapitres sont exposées de façon simplifiée dans le Tableau 1. Quelques recommandations et remarques générales La démarche pour l obtention de l accréditation d un laboratoire selon la norme ISO doit entraîner l exclusion dans le circuit audité de toute activité de recherche, que cette activité concerne des échantillons biologiques animaux ou humains. Ainsi, les procédures, les équipements et les réactifs doivent impérativement entrer dans le cadre unique et exclusif de l offre de soins aux patients. On sait en effet que beaucoup de laboratoires de pathologie du secteur «académique» ont pour habitude de collaborer avec des équipes de recherche et/ou de développer leur propre sujet de recherche. Dans ce contexte, un certain nombre de manipulations et d utilisation d équipements installés dans les laboratoires ont aussi pour vocation d être utilisés pour réaliser des projets de recherche translationnelle. Il est donc impératif de séparer le circuit des échantillons dédiés à la recherche, de celui dédié au soin et au diagnostic, de sectoriser ces activités et de ne pas utiliser les mêmes équipements ni les mêmes réactifs. Les auditeurs du Cofrac y seront particulièrement vigilants et la recherche translationnelle devra être exclue du périmètre d accréditation. La contamination interéchantillon est l un des inconvénients majeurs des techniques d amplification des acides nucléiques, notamment de l ADN. Il est donc primordial d avoir des locaux totalement adaptés (au mieux avec des salles en pression positive) et un environnement permettant de parfaitement contrôler les risques potentiels de contamination. Cela nécessite de disposer d au moins deux pièces séparées, l une dite de pré-pcr (précédant l amplification) et l autre de post-pcr (suivant l amplification). La manipulation des produits de PCR (amplicons) ne doit jamais se faire dans la pièce de pré-pcr : c est le principe de la «marche en avant». L utilisation de produits à base d hypochlorite comme agents décontaminants est recommandée dans toutes ces pièces. De même, l utilisation des rayons ultraviolets au niveau des hottes à flux laminaires est importante pour prévenir les contaminations par de l ADN issu d un autre patient. La présence de différents contrôles négatifs et «blancs» de PCR permet de vérifier l absence de contamination pour chaque test. La démarche d accréditation doit se faire dans un effort collectif et dans tous les secteurs du laboratoire de pathologie morphologique et moléculaire. Tous les secteurs professionnels sont concernés : secrétaires, agents de surface, techniciens, ingénieurs, cadre de santé, pathologistes. Il s agit d un projet «global» auquel tous les membres de l équipe doivent participer. La part d activité réservée à la «qualité» doit être intégrée dans le travail hebdomadaire et doit figurer dans la fiche de poste des membres du laboratoire. Ce «temps de qualité» est considéré comme obligatoire et nécessaire. On pourra alors se demander si la démarche d accréditation peut se faire sans ingénieur qualité ou sans temps d ingénieur qualité dédié à

6 16 É. Long et al. cette activité? Probablement pas ou de façon très difficile. L ingénieur qualité grâce à sa formation possède tous les atouts pour faire avancer progressivement et régulièrement l ensemble des processus conduisant vers l accréditation. Il paraît peu concevable que la direction du laboratoire soit totalement responsable de l assurance qualité, se trouvant ainsi un peu trop juge et partie dans la démarche d accréditation. Toutefois, le responsable du laboratoire (responsable opérationnel) a pour mission d entretenir une parfaite harmonie entre l ingénieur qualité et l ensemble du personnel du laboratoire et d afficher fortement sa volonté dans la démarche d accréditation engagée, faute de quoi peu de points d amélioration seront obtenus au fil du temps. L étendue du travail à réaliser pour être accrédité fait parfois «peur» et on a souvent du mal à savoir «par quel bout s y prendre» dans un laboratoire de pathologie. Il faut savoir en fait que la démarche d accréditation est un système visant à mettre en place un fonctionnement d amélioration continue de la qualité (principe de la roue de «Deming») et que nul n est tenu lors de la première visite des auditeurs du Cofrac à avoir un laboratoire fonctionnant de façon optimale et parfaite, ce qui peut paraître impossible. Toutefois, certains points de la norme sont vraiment incontournables à respecter d emblée faute de quoi des écarts majeurs seront dénoncés par les auditeurs, faisant alors échouer l obtention de l accréditation. La démarche et l obtention d une accréditation selon la norme ISO sont différentes sur certains points selon que l on se trouve dans un laboratoire de pathologie moléculaire hospitalier (appartenant à un «pôle hospitalier») ou dans un laboratoire du secteur libéral. En effet, seul un laboratoire de pathologie moléculaire appartenant à un pôle engagé dans la démarche et ayant déposé son dossier de demande d accréditation auprès du Cofrac, peut bénéficier d un audit par le Cofrac. Dans ce système, le laboratoire de pathologie doit utiliser des procédures communes et transversales mises en place par le pôle. Cela peut s avérer plus ou moins difficile selon que le laboratoire soit intégré dans un pôle de biologie-pathologie, un pôle d imagerie, un pôle d oncologie, etc. La gestion du secteur préanalytique est (même si cela reste dans certaines circonstances difficile) plus facile pour un laboratoire de biologie médicale que pour un laboratoire de pathologie moléculaire [19]. En effet, la gestion du prélèvement peut être bien (mieux) contrôlée (prise de sang par un préleveur du laboratoire de biologie), alors que la prise en charge d une biopsie ou d une pièce opératoire passe par plusieurs étapes ou conditionnements différents (bloc d endoscopie ou opératoire, acheminement, laboratoire de pathologie clinique avec la gestion de la fixation, de l inclusion, des coupes, etc.). Ainsi, le secteur de pathologie moléculaire est totalement dépendant du secteur de pathologie morphologique et de la gestion de l étape préanalytique. On peut alors se demander si l accréditation d une activité de pathologie moléculaire peut se faire ou non sans une démarche d accréditation concomitante de l activité de pathologie morphologique dont elle dépend? Certains points de la norme paraissent plus délicats à maîtriser pour obtenir une accréditation, du moins pour un secteur de pathologie moléculaire. Ce sont sur ces points, qui nous ont paru plus difficiles à gérer, que nous insisterons ci-dessous. La norme est bien établie pour les laboratoires de biologie médicale, dont la plupart bénéficient de chaînes techniques automatisées permettant notamment des validations de méthodes relativement aisées. Certaines étapes de la pathologie moléculaire sont difficiles à automatiser et reposent sur un savoir-faire technique impliquant directement le personnel technique et la validation des méthodes est souvent plus difficile à mettre en place. Analyse des points normatifs difficiles à maîtriser en pathologie moléculaire : chapitre 4 Contrats de prestation La demande d un examen de pathologie moléculaire se fait idéalement en concertation entre le clinicien (médecin prescripteur) et le pathologiste en charge du diagnostic morphologique et du diagnostic moléculaire. Ces relations doivent être contractualisées (point 4.4 de la norme). Une demande de test moléculaire est transmise au secteur de pathologie moléculaire par le pathologiste morphologiste ayant contrôlé les différents paramètres nécessaires pour la bonne réalisation de l analyse moléculaire (bonne indication en fonction de l histologie et du stade, mode de conditionnement initial de l échantillon destiné à l analyse moléculaire, qualité du matériel, en particulier pourcentage de cellules tumorales et appréciation des territoires nécrotiques). Une prescription «éclairée» des actes de pathologie moléculaire repose sur une bonne «sensibilisation» des prescripteurs (pathologistes et/ou cliniciens) par le responsable du secteur de pathologie moléculaire. En pratique, cela passe par la mise en place de différentes formes de communication personnalisée (courrier/courriel...) et collective (organisation de réunions avec les médecins et les pathologistes du secteur hospitalier et libéral ; organisation de «staffs» spécifiques dédiés à la qualité). La dynamique d amélioration continue La dynamique d amélioration continue (chapitre 4.12 de la norme) est un point essentiel des exigences relatives au management de la qualité. Elle inclue le suivi et la redéfinition des plans d action et des objectifs [20,21], la maîtrise des non-conformités (actions correctives et préventives) et des réclamations, le maintien des compétences du personnel grâce aux formations, l analyse de la satisfaction des prescripteurs, ainsi que le suivi des indicateurs qualité lors des revues de direction. La vérification de la mise en application des mesures prises selon les différentes recommandations et de la conformité du système est assurée grâce à des audits internes réguliers réalisés par du personnel qualifié et habilité. L amélioration continue est basée sur la méthode de gestion de la qualité dite du «Plan/Do/Check/Act» (PDCA), encore appelée roue de Deming. Les indicateurs Les indicateurs doivent être formalisés (chapitre de la norme). Il convient de mettre en place des indicateurs de suivi qui permettent d apprécier d une façon générale l activité du secteur de pathologie moléculaire (nombre de patients, nombre et type de mutations recherchées), la qualité des prestations relatives aux attentes des prescripteurs (délais de rendu des résultats ou «turn around time»), la fiabilité du résultat, les compétences du personnel, de maîtriser et anticiper les dysfonctionnements, et de planifier à court et moyen terme la charge de travail de l équipe, et donc de l adapter. L évolution budgétaire dédiée à ce

7 Création d un secteur de pathologie moléculaire 17 secteur est aussi un point important à maîtriser. Les indicateurs de suivi sont exprimés à des intervalles de temps variables définis selon la criticité de chacun de ces indicateurs (habituellement tous les trois, six ou 12 mois). Analyse des points normatifs difficiles à maîtriser en pathologie moléculaire : chapitre 5 La gestion de l étape préanalytique (chapitre 5.4 de la norme) La phase préanalytique est certainement l étape la plus concernée par les non-conformités. Il est donc crucial d en assurer la maîtrise par la rédaction d un manuel et d un guide de prélèvements. Des réunions d information régulières doivent être formalisées avec le prescripteur et son équipe. Le but de ces réunions est de donner des conseils en matière de gestion des échantillons tissulaires ou cellulaires dès le prélèvement initial fait sur le patient. La gestion de la phase préanalytique au sein d un laboratoire de pathologie moléculaire se conçoit de façon différente selon le système de transport de l échantillon. Les critères d acceptation des échantillons doivent être définis par écrit (identification du patient et du préleveur ; heure et date du prélèvement ; conditionnement de l échantillon et délai d acheminement). Certains facteurs peuvent faire exclure théoriquement l inclusion d un prélèvement orienté pour un test moléculaire, comme le conditionnement initial de l échantillon dans le liquide de Bouin. Cette décision doit être anticipée dans les recommandations énoncées dans le manuel de prélèvement et/ou dans le contrat fait avec le prescripteur. Le périmètre de la phase préanalytique doit être bien défini [22] (Fig. 1). Ce périmètre peut concerner l inclusion de l échantillon, la coupe tissulaire, la coloration standard par l hématoxyline éosine et la sélection des territoires tumoraux sur lesquels sera réalisée l extraction de l ADN. En principe, il convient d ajouter dans cette phase préanalytique et de façon «un peu paradoxale», la maîtrise du diagnostic histologique faite par un pathologiste (étape qui entrerait ici dans la phase analytique d un secteur de pathologie «morphologique»). Il nous paraît critique que la «jonction» entre le diagnostic morphologique et l indication d un examen de pathologie moléculaire puisse se réaliser au sein du même laboratoire et au sein d une même équipe de pathologistes pouvant avoir ainsi la «double compétence» de pathologiste «morphologiste» et «moléculaire». Ce modèle de fonctionnement permet de parfaitement gérer les indications transmises au secteur de pathologie moléculaire et de mieux comprendre les limites possibles des examens réalisés en aval sur l ADN tumoral. Ainsi, la taille du prélèvement, le pourcentage de cellules tumorales dans la zone tumorale transmise pour l extraction d ADN, la présence d une réaction inflammatoire intense, de zones de nécrose ou d hémorragie, éléments impactant sur la qualité des résultats, sont nécessaires à considérer. Les étapes relatives à l extraction, l amplification et la vérification de la qualité de l ADN ont été décrites précédemment [22]. C est ici certainement que la validation des méthodes est difficile à maîtriser car ces extractions se font à partir de tissus et non pas de fluides biologiques et la reproductibilité des résultats peut être plus difficile à recueillir. L utilisation de consommables marqués «CE-IVD», bien que souvent plus coûteuse, permet «d adopter» des réactifs déjà expérimentés chez le fournisseur et évite de valider au sein du laboratoire de nouvelles méthodes (il s agit d un type de portée flexible de type A). L utilisation de techniques «home-made» est plus délicate, bien que souvent moins onéreuses. Il faut alors adapter la méthode utilisée par rapport à la méthode de référence et s appuyer sur des références bibliographiques. Il s agit ici d une portée flexible de type B. La gestion de l étape analytique Les méthodes automatisées et l utilisation de kits commercialisés avec des lots ayant des dates de péremption facilitent la mise en place. Là encore l emploi de consommables et d équipement marqués «CE-IVD» facilite la validation des méthodes. Ce choix autorise à adopter les recommandations préconisées et à vérifier au sein du laboratoire les différentes performances affichées par les fournisseurs. L évaluation de différents paramètres (fidélité, robustesse, contamination interéchantillons, justesse) doit être conduite pour les différentes techniques automatisées (Fig. 2). La gestion de l étape analytique conduit à établir un dossier de validation des méthodes pour le test qui doit être accrédité. Ce dossier de validation des méthodes se construit selon qu il s agisse d une méthode qualitative ou quantitative. La plupart des tests réalisés dans un laboratoire de pathologie moléculaire sont de type qualitatif : présence ou absence du signal recherché (par exemple présence ou absence de la mutation BRAF V600E). Les tests quantitatifs concernent parfois certaines méthodes immunohistochimiques dont les résultats peuvent avoir un impact sur la thérapeutique (exemple de l immunomarquage avec l anticorps anti-her2 dans les carcinomes mammaires). La gestion de l étape post-analytique Le processus post-analytique concerne la réalisation et la validation du compte rendu de pathologie moléculaire, la vérification de la réception des résultats par les prescripteurs et la gestion éventuelle des urgences. L interprétation des résultats est une composante majeure du compte rendu. Cette interprétation se fait idéalement par un ingénieur biologiste en charge du secteur analytique, par un pathologiste moléculaire et par le responsable de l unité fonctionnelle de pathologie moléculaire. La confrontation des résultats entre ces personnes a lieu secondairement. Les comptes rendus de pathologie moléculaire doivent faire l objet d une standardisation afin que les pathologistes moléculaires utilisent la même formulation. La métrologie La maîtrise métrologique (qui doit répondre en partie aux chapitres 5.3 et 5.5 de la norme) est généralement difficile à mettre en place dans un secteur de pathologie moléculaire. Le contrôle métrologique des instruments passe par plusieurs composantes : la maîtrise de l organisation, la formation métrologique, la maîtrise des documents, la traçabilité de l étalonnage et de l ajustage, et la maîtrise des performances analytiques. De façon idéale, le système de management de la mesure doit faire l objet d une procédure générale qui définit les besoins propres du laboratoire, en particulier les écarts maximums tolérés («EMT»). Une fiche de fonction doit être rédigée pour le responsable de la métrologie. Les matériels et les équipements critiques vis-à-vis des analyses doivent être identifiés. La

8 18 É. Long et al. Figure 1. Périmètre des étapes préanalytique, analytique et post-analytique d un secteur de pathologie morphologique et moléculaire. Perimeter of the preanalytical, analytical and post-analytical phases of a morphological and molecular pathology laboratory. surveillance métrologique des températures des enceintes thermiques (réfrigérateurs, congélateurs, étuves) peut être réalisée en interne grâce à l utilisation d étalons raccordés, mais idéalement il est possible de faire appel à des prestataires externes accrédités par le Cofrac. Cette surveillance concerne aussi les micropipettes et, selon le cas, les centrifugeuses, les chronomètres et les balances de précision. Contrôles de qualité et principaux pièges en pathologie moléculaire Le contrôle de qualité en pathologie moléculaire est l un des points clés à mettre en place dans la démarche d accréditation (ce point est intégré dans le chapitre 5.6 de la norme) (Tableau 2). Ce contrôle est certainement l une des étapes les plus délicates à maîtriser incluant un processus de contrôle interne et un processus de contrôle externe. Le contrôle interne de qualité (CIQ) est un outil évaluant les pratiques locales du laboratoire et la qualité des résultats au fur et à mesure de l exécution des analyses. Il permet aussi de vérifier la bonne intégrité des consommables (conservation, manipulation). Il est également important de développer des évaluations externes de qualité (EEQ) interlaboratoires permettant de confronter les résultats soit par l utilisation de techniques et de consommables identiques, soit en utilisant des approches différentes. Ainsi, la cohérence des choix techniques et l exactitude des résultats d analyse sont assurées par la vérification des méthodes, l exploitation des CIQ et des EEQ, ainsi que par les contrôles nationaux ou internationaux de qualité [23]. Les recherches d altérations génétiques doivent être réalisées en assurant des règles strictes de qualité, puisque les conséquences des résultats obtenus à partir des tests moléculaires sont d administrer des thérapeutiques coûteuses dont l efficacité dépend du statut mutationnel [24]. La fiabilité du test moléculaire et donc la décision thérapeutique dépendent en particulier de la maîtrise des étapes de la phase préanalytique [22]. Cela est particulièrement important dans l évaluation de la balance bénéfice risque pour le patient, les thérapies ciblées pouvant toutes être potentiellement toxiques.

9 Création d un secteur de pathologie moléculaire 19 Figure 2. Critères à définir lors d une validation des méthodes. Bioanalytical method validation criteria. En prenant comme exemple les cancers pulmonaires, un diagnostic histologique le plus précis possible doit être posé, même sur des prélèvements de petite taille (situation devenant de plus en plus fréquente avec des gestes cliniques de moins en moins invasifs pour les patients), ce qui nécessite une gestion optimale du matériel communiqué [25 28]. Avant toute analyse moléculaire, la fiabilité des résultats est conditionnée par la maîtrise des temps d ischémie chaude

10 20 É. Long et al. Tableau 2 Principaux pièges et écueils dans la gestion d un échantillon tissulaire destiné à la pathologie moléculaire. Main pitfalls in the managment of tissue biospecimens used for molecular biology testing. Étapes Pièges Recommandations Diagnostic morphologique Distinction entre les types histologiques (adénocarcinome, carcinome épidermoïde, autres) Matériel pour l analyse Pas de renseignement sur le moléculaire pourcentage des cellules tumorales Erreur dans la sélection du matériel Prescription Délai prolongé avant la prise en charge par la plateforme de pathologie moléculaire Étude histochimique et immunohistochimique Utilisation limitée des anticorps pour préserver le matériel dédié à la biologie moléculaire Réaliser une coloration HES avant toute analyse moléculaire Sensibiliser le clinicien et/ou pathologiste au moment du diagnostic histologique pour une transmission rapide au secteur de pathologie moléculaire Qualité des prélèvements Temps d ischémie chaude Transfert rapide des prélèvements «frais» au laboratoire de pathologie (tube pneumatique) Temps d ischémie froide Fixation Type de fixateur Décalcifiant Le fixateur de référence est le formaldéhyde 10 %. Les fixateurs de substitution ou le Bouin sont à éviter. La cryoconservation devrait être considérée comme la méthode de référence pour la conservation des tissus et de l ADN Délai de fixation La fixation prolongée ou trop courte doit être évitée Type de prélèvement Matériel de petite taille Les biopsies sont privilégiées par rapport aux produits de cytologie Pourcentage de cellules tumorales Préparation des échantillons Faible pourcentage de cellules tumorales sur l ensemble de l échantillon Seuil de cellules tumorales requis pour l analyse moléculaire Enrichissement en cellules tumorales par macrodissection manuelle ou microdissection par capture laser Rendre le résultat «sous réserve» en cas de faible pourcentage de cellules tumorales et selon la technique utilisée En accord avec la sensibilité analytique des méthodes utilisées. Refuser si le % est trop faible ou en cas d absence de cellules tumorales Extraction d ADN Entre 1 et 10 copeaux de paraffine de 5 à 10 m d épaisseur Éviter toute contamination (secteurs individualisés, changement de lames entre chaque bloc, traçabilité optimale, décontamination, scalpel dédié pour la dissection) Suppression des substances interférentes (mélanine) Contrôler la qualité de l ADN (amplification par PCR d un gène témoin) Réactifs validés Taux de réussite imposé 95 % de réussite pour l extraction d ADN Il est impératif que la méthode soit validée. Chaque méthode doit être vérifiée En accord avec l intérêt clinique et la pathologie considérée Sensibilité La limité inférieure de détection doit être fixée à 1 % pour les méthodes très sensibles et à % pour le séquençage direct. Éviter les résultats faussement négatifs par des contrôles de qualité externes réguliers Spécificité Chaque mutation doit être confirmée Méthodes analytiques Méthodes validées (CE-IVD) versus méthodes «maison» Méthodes ciblées versus méthodes globales indépendamment afin d éviter les résultats faussement positifs

11 Création d un secteur de pathologie moléculaire 21 Tableau 2 (Suite ) Étapes Pièges Recommandations Performances potentiellement réduites de l immunohistochimie pour Besoin actuel d une validation de l immunohistochimie la mise en évidence des mutations Interprétation d un réarrangement Lecture indépendante par au moins deux lecteurs EML4-ALK par FISH Taux de réussite imposé 97 % de résultats correctes Assurance qualité Besoin d accréditation/directives/programmes externes d évaluation de la qualité Compte rendu final de pathologie moléculaire Le compte rendu doit faire apparaître les données du patient, le nom du prescripteur, le diagnostic histologique, les détails sur le bloc de tissu utilisé, l origine, la qualité de l échantillon, l estimation du pourcentage de cellules tumorales, la méthode utilisée, la sensibilité et la spécificité de la méthode, le résultat de l analyse (allèle mutant ou «wild-type»), l interprétation des résultats dans le contexte de la prescription et froide qui peuvent avoir un impact immédiat sur la qualité de l ADN tumoral. Le temps d ischémie chaude concerne uniquement les pièces opératoires. Même si cette étape peut «échapper» au contrôle du pathologiste, un transfert rapide des pièces opératoires non fixées au laboratoire est impératif afin de limiter le temps d ischémie froide [22]. Les prélèvements biopsiques sont le plus souvent immédiatement fixés, ce qui en principe limite ces temps d ischémie et donc l impact sur la qualité de l ADN. Le pathologiste a la charge d effectuer un contrôle morphologique de la tumeur dont le prélèvement sera transmis au secteur de pathologie moléculaire. Il faut souligner que dans un certain nombre de cas, et pour des échantillons transmis de l extérieur au secteur de pathologie moléculaire, le pourcentage des cellules tumorales n est pas renseigné où le matériel est «épuisé», voire dans de rares cas, une erreur dans la sélection du matériel tumoral peut intervenir. Très souvent la preuve diagnostique d un carcinome bronchopulmonaire dans les stades avancés est réalisée sur des produits de cytologie. Bien que certaines études aient démontré la faisabilité des analyses moléculaires sur ce type de matériel, les biopsies tumorales sont privilégiées par rapport aux produits cytologiques, selon le groupe international de travail sur le cancer du poumon «NSCLC Working Group» [6]. La grande majorité des échantillons pris en charge par un laboratoire de pathologie moléculaire sont fixés dans du formaldéhyde tamponné à 10 %. Le type de fixateur ainsi que la durée de fixation influe sur la qualité des examens de biologie moléculaire obtenus en aval en modifiant la structure des acides nucléiques (ARN, ADN) et des protéines [29 31]. Compte tenu de leur effet délétère sur les acides nucléiques et sur certaines protéines, le liquide de Bouin, le décalcifiant acide (RDO) et les fixateurs de substitution sont à éviter, voire à proscrire [29]. Un pourcentage de cellules tumorales suffisant est l élément clé pour des analyses moléculaires optimales. L enrichissement tumoral par macrodissection ou microdissection par capture laser peut être requis si l ensemble de l échantillon contient un trop faible pourcentage de cellules tumorales. Ce seuil de cellules tumorales est à moduler selon la sensibilité analytique des méthodes utilisées et il doit être rapporté dans le compte rendu final histomoléculaire. Le risque d obtenir des résultats faussement négatifs diminue si le pourcentage de cellules tumorales est supérieur à 60 % [22]. Certaines méthodes d analyse moléculaire, très sensibles, permettent d optimiser les résultats. Ainsi, un pourcentage de cellules tumorales de 10 à 20 % peut être accepté selon la méthode employée. En dessous de ce seuil, les résultats doivent être rendus sous réserve de la richesse en cellules tumorales. Lors de l extraction de l ADN, plusieurs pièges sont à prendre en compte tels que la contamination interéchantillons, l impact des substances interférentes sur la réaction de PCR, ainsi que l absence de vérification de la qualité de l ADN tumoral. L étape suivante, dite phase analytique, correspond à l analyse moléculaire de l échantillon. Il est impératif que les méthodes analytiques employées soit vérifiées et/ou validées sur la plateforme d exploitation et que les résultats obtenus soient régulièrement vérifiés lors des EEQ. Toute mutation détectée devrait au mieux être confirmée à deux reprises, sur des coupes effectuées de façon totalement indépendante et en utilisant exactement la même méthodologie [22]. Les erreurs apparaissant lors de cette étape peuvent en effet conduire à l obtention de résultats faussement négatifs ou faussement positifs dont les conséquences thérapeutiques peuvent être particulièrement néfastes pour le patient. Récemment, des méthodes immunohistochimiques permettant l identification des mutations d EGFR ou des réarrangements ALK dans les adénocarcinomes pulmonaires ont été décrites. Deux anticorps dirigés contre des mutants EGFR (la substitution L858R sur l exon 21 et la délétion E746 A750del sur l exon 19) ont été développés [32]. L intégration possible en routine de l immunohistochimie antimutants EGFR dans les adénocarcinomes pulmonaires a été suggérée. Cette technique pourrait en effet servir à l initiation précoce des anti-egfr et réduirait le nombre d analyses à effectuer. Cependant, ces deux anticorps ont démontré une performance variable selon les études, avec une sensibilité de 23 % à 99 % pour la délétion sur l exon 19 et de 75 % à 100 % pour la mutation L858R [33,34]. De la même façon, les anticorps dirigés contre les réarrangements EML4-ALK semblent relativement spécifiques mais avec une sensibilité réduite comparativement aux analyses moléculaires [35].

12 22 É. Long et al. L étape finale dite phase post-analytique consiste à évaluer les résultats obtenus et à les valider. Elle nécessite une confrontation a posteriori des résultats moléculaires et morphologiques. Cette phase post-analytique conduit à la réalisation d un compte rendu d analyse histomoléculaire qui doit faire apparaître les données du patient et du médecin prescripteur, le diagnostic anatomopathologique, l identification du bloc de tissu utilisé, l origine, la taille et la qualité de l échantillon, l estimation du pourcentage de cellules tumorales, la méthode utilisée, la sensibilité et la spécificité de la méthode, le résultat de l analyse (allèle mutant ou «wild-type») et l interprétation des résultats dans le contexte de la prescription. Un point critique est alors de déterminer le délai depuis le diagnostic morphologique jusqu à la transmission des résultats de pathologie moléculaire. Un «turn around time» (ou délai de rendu des résultats) ne dépassant pas deux semaines est recommandé, bien que la mise en place d un système intégrant plusieurs départements de soins constitue souvent un défi pour respecter un tel délai [4]. Conclusion L accréditation d un secteur de pathologie moléculaire en oncologie (recherche d altération génomique à partir des tissus et des cellules tumorales) est une nécessité. La norme requise est la norme ISO et elle est réservée au secteur de soins. Même si l interface entre la biologie moléculaire et la recherche en cancérologie est actuellement très importante dans les hôpitaux et les plateformes technologiques, cette norme exclut de son périmètre le développement de la recherche translationnelle [36]. Si cette norme est bien adaptée aux activités de biologie médicale, il existe certains des sous-chapitres de la norme assez délicats à adapter à la pratique de l anatomie pathologique et de la pathologie moléculaire. La phase préanalytique est l étape à maîtriser. Le périmètre de cette phase (début et fin) pour un secteur de pathologie moléculaire peut se concevoir de deux façons. Dans un fonctionnement «logique et maximaliste», cette phase commence dès le prélèvement et comporte donc la gestion de celui-ci au sein du laboratoire d anatomie pathologique, puis les étapes d extraction et de contrôle de l ADN. Un fonctionnement «minimaliste» n inclura que la prise en charge de l échantillon (copeaux de coupes tissulaires, voire bloc tissulaire de paraffine par exemple), l extraction et le contrôle de l ADN par exemple. Ce dernier fonctionnement nécessite une contractualisation très précise avec les acteurs situés en «amont», c est-à-dire à la fois les prescripteurs cliniciens et les prescripteurs pathologistes. Il nous semble plus difficile dans ce mode simplifié de maîtriser la qualité du résultat et la traçabilité de l échantillon. La confrontation histomoléculaire est ici beaucoup plus difficile. Si la phase préanalytique concerne aussi le parcours de l échantillon depuis le bloc opératoire ou d endoscopie et sa prise en charge au sein du laboratoire d anatomie pathologique, on voit bien que l accréditation d un secteur de pathologie moléculaire ne peut s envisager que si le laboratoire d anatomie pathologique est engagé lui-même dans le même processus d accréditation selon la norme ISO Les enjeux sont importants à moyen terme : l accréditation rendue obligatoire peut conduire à une réduction du nombre de plateformes hospitalières de génétique moléculaire, à une centralisation des tests par pathologie d organe ou par mutation à détecter, et peut faire entrer les différentes plateformes en compétition avec une activité moléculaire développée dans le secteur libéral et privé, ou bien dans d autres structures accréditées chez nos voisins européens [37,38]. Il convient donc de rapidement mettre en place cette démarche d accréditation, en sollicitant l aide des institutions qui doivent être conscientes des enjeux à court terme. Il faut aussi anticiper l évolution des techniques dédiées à l analyse des altérations génomiques dans les tumeurs [38,39]. Les techniques dites «à faible débit» actuellement utilisées seront probablement bientôt supplantées par des techniques à «moyen débit» puis à «haut débit» de type NGS («next generation sequencing») [39 42]. Ces techniques qui pourront alors s imposer dans le cadre de l offre de soin, devront également être parfaitement maîtrisées dans le cadre d une accréditation selon la norme en ISO Déclaration d intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d intérêts en relation avec cet article. Références [1] Jones D, Fletcher CD. How shall we apply the new biology to diagnostics in surgical pathology? 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13 Création d un secteur de pathologie moléculaire 23 [15] Libeer JC. Effect of accreditation schemes on the setting of quality specifications by laboratories. Scand J Clin Lab Invest 1999;59: [16] Medical Laboratories. Particular requirements for quality and competence. International Standard ISO 15189:2007, [17] Norme NF ISO Laboratoires d analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence. AFNOR; [18] Guide de bonne exécution des analyses (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002 (JO du 4 mai 2002). [19] Wood WG. The preanalytical phase can the requirements of the DIN-EN-ISO be met practically for all laboratories? A view of the German situation. Clin Lab 2005;51: [20] Journal officiel. Arrêté du 16 juillet 2007 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les laboratoires de recherche, d enseignement, d analyses, d anatomie et cytologie pathologiques, les salles d autopsie et les établissements industriels et agricoles ou les travailleurs sont suceptibles d être exposés à des agents biologiques pathogènes. JO du 4 août [21] Organisation mondiale de la santé. Manuel de sécurité biologique en laboratoire. 3 e éd [22] Hofman V, Ilie M, Gavric-Tanga V, Lespinet V, Mari M, Lassalle S, et al. Rôle du laboratoire d anatomie-pathologique dans l approche pré-analytique des examens de biologie moléculaire réalisés en pathologie tumorale. Ann Pathol 2010;30: [23] Bellon E, Ligtenberg MJ, Tejpar S, Cox K, de Hertogh G, de Stricker K, et al. External quality assessment for KRAS testing is needed: setup of a European program and report of the first joined regional quality assessment rounds. Oncologist 2011;16: [24] Jiang Y, Wang M. 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