Méthodes d'analyse Globales et Ciblées en Génétique et Biologie Moléculaire des Tumeurs

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1 UE : Bio-Pathologie Date : 11/03/2011 Promo : PCEM2 Plage horaire : 16-18h Enseignant : Pr J-P. Merlio Ronéistes : Galiay Alexandre Sourgen Marie Laurence Jabet Arnaud Méthodes d'analyse Globales et Ciblées en Génétique et Biologie Moléculaire des Tumeurs Table des matières 1Les méthodes globales...6 2Les méthodes ciblées...9 FISH (ifish=fish sur noyaux interphasiques):...9 Les deux régions impliquées sont constantes:...9 Les deux régions impliquées sont variables:...11 Les deux sondes sont dans deux régions différentes du même chromosome:...11 Méthodes ciblées de biologie moléculaire /17

2 Petite Intro: Dans cette ronéo, nous allons voir l'ensemble des techniques que l'on met en oeuvre pour repérer/détecter ces anomalies génétiques. Ces techniques sont en particulier utilisé dans ce que l'on appelle la plate-forme de génétique des tumeur d'aquitaine. Ces plates-formes ont été mises en place par l'institut national du cancer pour offrir au patient l'accès à ces technique d'analyse génétique des tumeurs (techniques pas forcément compliquées mais qui nécessitent une certaine expérience). Cette plate-forme comporte 2 laboratoires, l'institut Bergonié dans la cancérologie et puis le laboratoire d'étude des tumeurs au CHU de Bordeaux (où Pr Merlio est le chef de service) et qui est associé au laboratoire de pathologie, ainsi qu'au laboratoire d'hématologie-biologie pour la partie génétique des hémopathies. Ces techniques d'analyse font aussi bien partie de la partie théorique que de la vie médicale. Le but de ce cours aussi n'est pas forcément de faire de nous des grands spécialistes de la biologie moléculaire, mais d'avoir une compréhension de ce que l'on recherche (ex mutation de l'adn) et quelles sont les techniques qui vont permettre d'y répondre. Rappel cours précédent Il y a des gènes qui vont réguler la prolifération, la survie, la différenciation cellulaire mais aussi des capacité pro-angiogénique somatique et métastatique, ce qui est intéressant aujourd'hui c'est que l'on arrive à corréler les 2 (par ex des gènes de répression de l'adn qui peuvent être phosphoryler et qui ont un rôle sur le cytosquelette et les propriétés invasives, métastatiques). Dans tous les cas, il y a des altérations génétiques ou épigénétiques (c'est la régulation de l'expression des gènes). Et ces altérations peuvent provenir soit de gènes exogènes, de gènes viraux par exemple, qui confèrent aux cellules tumorales certaines propriétés, soit des gènes cellulaire (proto-oncogènes, des gènes suppresseurs de tumeurs,etc...). Au niveau génétique, on va rechercher des anomalies de types translocation, amplification, mutation qui peuvent être activatrice ou inactivatrice, des délétions dans les gènes suppresseurs de tumeurs, on peut parler de tout ça de mutation au sens large, toute ces anomalies sont génétiques et puis il y a aussi des modifications épigénétiques (des acéthylations au niveau des histones, de la méthylation de l'adn) qui vont réguler l'expression des gènes. Ce qui est très important à concevoir c'est que dans les cancers, c'est dans la majorité des cas des anomalies somatiques, c'est-à-dire non pas germinale de l'individu mais somatique (propre à la tumeur). Et justement, les plates-formes qu'a mis en place l'institut national du cancer s'appellent des plates-formes de génétique somatique, ce qui fait que l'on peut analyser ces tumeurs sans forcément avoir l'autorisation pour faire de la génétique constitutionnelle qui est réservée aux généticiens médicaux, alors que la génétique tumorale on peut être médecin, pharmacien, biologiste. Dans certaines tumeurs, on peut tomber dans des anomalie germinales, et c'est souvent le cas des cancers héréditaires (qui représentent environ 5% de cas réellement héréditaire, mais l'influence héréditaire est elle de 10 à 15%). Ces cas héréditaires vont devoir être pris en charge par un onco-généticien, pour rechercher les gènes responsables de l'apparition de ces maladies. 2/17

3 Les altérations des gènes sont la plupart du temps somatiques, ce sont des anomalies: -Soit qualitatives (ex translocation avec fusion génique c'est-à-dire qu'il y a un échange de matériel de chromosome sans perte ni gain), des mutations ponctuelles (qui ne sont pas des anomalies quantitatives) qui sont le remplacement d'une base par une autre, des insertions et délétions. -Soit des altérations quantitatives comme par exemple des amplifications, des gains ou des délétions, des pertes. En fonction de ces anomalies génétiques, on a des profils d'expression de nombreux gènes qui sont altérés sauf bien sûr les gènes qui sont directement impliqués dans ces phénomènes ou bien des gènes qui dépendent des précédents. Il est important de repérer ces altérations pour comprendre les mécanisme de l'oncogénèse pour faire éventuellement le diagnostic, pour, lorsque l'on a par exemple des mutations qui sont spécifique d'un type de tumeurs, pour déterminer le pronostic (certaines anomalies sont de mauvais pronostic, d'autre peuvent être de bonne réponse),pour le théranostic (qui est la réponse à une thérapie). A ce moment là, certaines anomalies vont déterminer ce que l'on appelle les critères d'inclusion ou d'exclusion pour une thérapie puisque dans certaines mutations elles peuvent, si elles sont activatrices, donner lieu à un traitement ciblé ou au contraire exclure d'un traitement ciblé si la mutation confère une résistance au traitement. Certaines altérations peuvent conduire à une chimio-résistance. Les altérations ne sont pas portées par les gonosomes mais par les autosomes (chromosomes non sexuels, que l'on a vu en 1ere années) et il faut toujours avoir à l'esprit que l'on a 2 autosomes donc 2 allèles d'un même gène (à voir dans la génétique constitutionnelle en 3ème année, déjà fan). Donc quand on a un autosome relativement long (1 à 5) ou moyen mais centromère plus distales (comme chromosome 6, 7 et 8) et bien on voit ces 2 chromosomes qui peuvent être impliqué soit dans des phénomènes de polyploïdie globale, c'est-à-dire une augmentation du nombre globale de chromosomes : on a une triploïdie, 92 chromosome c'est une tétraploïdie. Ce sont des augmentations globales et relativement équilibrés du nombre de chromosome. Quand il y a pas tous à fait 46 chromosomes mais 44 on parle d'hypodiploïdie, quand on en a 47, 48 on parle d'hyperdiploïdie, et quand on en a pas tout a fait 69 on va parler d'hyper/hypo triploïdie, mais ce n'est pas très important tout cela. Par contre il y a des phénomènes d'aneuploïdie c'est la que le gain chromosomique n'est pas global, il y en a un qui manque donc déséquilibre. Phénomène de somie, exemple ici on a 3 copies du chromosomes 8 et donc on aura un stock global de chromosome de , cela fait une formule à 47 chromosome, on parle alors de trisomie de gain spécifique du chromosome 8, intéressant en génétique car on va avoir un gain de fonction des gènes qui sont sur le 3/17

4 chromosome 8. On a des translocations réciproques équilibrées pas de gain ni de perte mais éventuellement une activation de matériel génétique par des phénomènes de transposition. Et des translocations réciproques déséquilibrées, exemple transposition du bras long du chromosome 8 mais la partie du 8 n'est pas arrivé donc on a une perte d'une partie du chromosome 8. Phénomènes d'amplification qui peuvent être soit des amplifications en tandem du chromosome, c'est-à-dire que l'on a un bras qui se photocopie, alors que dans d'autre phénomène ce sont des petits fragments de chromosome qui s'amplifient. Ensuite on a des amplifications par insertion aléatoire de matériel génétique. Enfin, on peut avoir des pertes d'hétérozygotie: non pas une perte de matériel génétique mais en faite une recombinaison somatique et mitotique d'un bras long d'un chromosome qui va venir remplacer un segment du bras long de son chromosome homologue, très intéressant car on sait que l'on a tous un allèle maternelle et un paternelle et lorsque l'on a ce phénomène de perte d'hétérozygotie, cette recombinaison mitotique peut correspondre en faite soit à une perte d'hétérozygotie sur tout le chromosome ou soit juste le segment d'un bras long. Ces anomalies ne vont pas déséquilibrées le génome en terme de nombre de copie mais par contre on va avoir un déséquilibre entre 2 allèles: au lieu d'avoir 2 allèles différents on aura 2 fois le même, et si cet allèle a une mutation à ce moment-là il y aura des conséquences physiologique pour la cellule. Bien connaître schéma de la diapo 5 : les principales anomalies cytogénétiques des cancers La deuxième notion très importante de ce cours, c'est de comprendre que lorsque l'on va explorer le génome, on peut utiliser des approches globales pour voir l'ensemble de l'adn d'une cellule (par exemple une cellule tumorale) ou on peut faire des approches ciblées sur un gène. L'intérêt des approches globales c'est qu'on peut explorer l'ensemble des gènes et du chromosome, cela vaut le coup si on connait pas les anomalies au départ qui seraient caractéristiques de ce type tumoral, ou si ce sont des anomalie variables ou complexes (cours d'hémato avec la leucémie myéloïde chronique et le chromosome de philadelphie «On vous en a déjà parlé?... Si! Non! Bah on va faire un vote»). «On dit qu'il suffit d'envoyer par la poste un peu de votre ADN pour qu'on séquence le génome que l'on mettra sur votre... iphone» On peut retenir des données énormes aujourd'hui avec des techniques de séquence de nouvelle génération «NGS: Next Generation Sequencing», on pourrait s'amuser à séquencer tous les génomes, le problème de ces techniques c'est qu'elles sont couteuse ( e par échantillon), pas vraiment le problème car bientôt elles seront moins chère mais cela génère des données informatique extrêmement complexe que personne à Bordeaux ne sait correctement l'exploiter, pour l'instant ce n'est pas de la médecine mais de la recherche. Par contre ce que l'on sait bien faire à l'hôpital, c'est d'aller poser des questions ciblées, c'est-à-dire on dit que l'on veut regarder le statut du gène k ras (exemple) et voir si c'est muté dans tel ou tel cancer du colon, on sait le gène que l'on va analyser, on connait globalement dans le gène quel exon voir même quel codon: on sait où est l'anomalie qui est fréquente dans les cancers rectaux. A ce moment là, la science nous a permis de savoir en plus que cette anomalie est de mauvais pronostic et est de résistance thérapeutique (toujours l'exemple du gène k ras). Quand nous serons médecin (bientôt, bientôt,...) quelle que soit notre spécialité on dira «on met le malade sous tel ou tel traitement, pour savoir le pronostic: je vais demander ce type d'analyse». Il y a encore 5-10 c'était les leucémies et les lymphomes, ensuite cela a commencé avec les sarcomes, et puis le cancer du colon, du poumon, les mélanomes aussi on fait l'analyse les tumeurs thyroïdiennes et beaucoup sur les mammaires, et cérébrales. Donc beaucoup de tumeurs concrètement sont impliquées dans ce type d'analyse. Effectivement pour les leucémies, il est intéressant de refaire un caryotype (approche globale) parce que souvent dans les leucémies ou le syndrome myélo-prolifératif, on a une signature chromosomique ou moléculaire qui est caractéristique. Pourquoi c'est intéressant? Parce ce que dans les leucémies et les syndromes myélo-prolifératifs, le tissu au départ ce n'est pas une tumeur, c'est du sang/de la moelle, on peut assez facilement refaire une prise de sang ou une ponction sternale chez un patient, on peut programmer de refaire un prélèvement. A l'inverse, quand on opère une tumeur du cerveau, on a pas le diagnostic, quand on enlève un grain de beauté on sait même pas s'il est bénin ou malin, lorsqu'on opère une tumeur du côlon il y a eu une biopsie par endoscopie et on a parfois le diagnostic, on ne va pas s'amuser à mettre ces cellules en culture pour en faire un caryotype, quand on fait une excérèse ou biopsie on va majoritairement la fixer dans le formol, dans certains cas on va le congeler pour avoir ADN/ARN de très bonne qualité. Le caryotype nécessite un autre prélèvement, trop lourd pour le patient comme une tumeur du médiastin on ne va pas le ré-ouvrir. 4/17

5 Avec une biopsie, on peut faire de la fixation, on peut faire des coupes, regarder les noyaux, faire des FISH, on peut faire de l'extraction d'adn/arn à partir de tissu fixé par du formol. A partir d'une biopsie congelée on peut faire ce que l'on veut: biologie moléculaire, d'autre technique, des empreintes, FISH, caryotype. L'intérêt du caryotype: le prélèvement est vrai, suspicion de lymphome ou de leucémie, on va obtenir des anaphases et on verra des anomalies cyto-génétiques. Le caryotype n'est généralement pas fait (absence de compétence). 1 Les méthodes globales Historiquement, cela a été le caryotype (1956, 1 ans avant la naissance du Pr. Merlio). Après, il a fallu attendre 1975 (il était en 1ère année de médecine) pour qu'on invente le southern (l'étude sur gel de l'adn après digestion par enzyme de restriction), c'est vraiment à partir de 1975 qu'on a fait de la biologie moléculaire. Quand il a commencé en 1985 les choses se sont énormément accélérées mais il faut garder le caryotype en bande car il permet de comprendre l'architecture du génome et de comprendre les approches globales et les approches ciblées. Dans les années 75 à 90, on a isolé les principaux oncogènes. Puis il y a eu 2 progrès majeurs : l'hybridation in situ en fluorescence (FISH) c'est-à-dire le fait de pouvoir hybrider avec une sonde d'adn in situ sur les cellules et/ou sur le caryotype et il y a eu l'hybridation génomique comparative (CGH). Puis M-FISH et le SKY. En pratique, comment ça se présente? On a des chromosomes métaphasiques de la cyto-génétique conventionnel (année 56) et puis à coté (diapo page suivante), on a utilisé des sondes qui sont marquées par un fluorochrome et spécifique de chaque chromosome: on a simplement disséquer des chromosome au départ, on en a fait de l'adn et on a marqué cette ADN avec une sonde pour identifier d'autre chromosome qui lui sont identique. Ici on peut faire des combinaisons de couleurs qui nous permettent de voir chaque chromosome et de les identifier (pour les classer il faut un cyto-généticien expert). Grâce à cette technique (le caryotype toujours), on peut détecter des 5/17

6 translocations mais on le fait plutôt en recherche. Ce qui est intéressant, c'est que ces caryotypes ont permis de détecter des anomalie récurrentes clonales qui sont soit des anomalies de nombres soit des anomalies de structures mais qui nécessitaient des compétences en cyto-génétique. Ce qui nous demande de savoir pour l'exam, c'est qu'avec le caryotype on a pu déjà mettre en évidence un certain nombre d'anomalies et l'historique Lejeune a montré la trisomie 21 qui est une anomalie génétique constitutionnelle mais aussi au même moment, en 1960, a été identifié le fameux chromosome Philadelphie, ¾ ans après on décrivait les anomalies cyto-génétiques constitutionnelles et tumorales. Une grande avancée a été faite par un Finlandais qui s'appelle Canionelli, qui a publié ça en 1992, il a eu une idée géniale car auparavant on utiliser des sondes pour hybrider les métaphases de la tumeur, on utilisait des sondes issues de chromosomes normaux pour hybrider les métaphases: on avait par exemple les sondes du 1 en vert, les sondes du 2 en rouge, etc... Bref on arrivait en hybridant sur des caryotypes anormaux avec des sondes normales à faire soit de la FISH ou de la multi-fish pour comprendre le caryotype. L'idée qu'il a eu c'est de ne plus utiliser les métaphases de la tumeur mais d'utiliser un caryotype normales et d'utiliser l'adn globale de la tumeur (facile à avoir, suffit d'aller dans une tumorothèque), là on s'affranchit de mettre les cellules tumorales en culture et ce qu'il a fait c'est qu'il a marqué l'adn tumoral par exemple en vert contre la même quantité d'adn normal en rouge et il a hybridé ça sur des métaphases normales. Après, on observe sur les chromosomes des régions en vert où l'on a un excès d'adn tumorale, et puis des régions plus rouge où l'on a soit des pertes soit des gains de matériels génétiques au niveau de la tumeur. Ce qui apparaît en vert c'est là où la tumeur surreprésente du matériel génétique. Dans le conventions on a inversé les couleurs (rouge=tumorale et vert=normale) mais à la base c'est Canionelli qui a instauré ça. Ce principe a ouvert la voix à toutes les technique de omique (génomique, transcriptomique,...), c'est-à-dire toutes les techniques où l'on va marqur l'adn ou l'arn des tumeurs avec des fluorochromes (rouge le plus souvent) et ensuite au lieu d'hybrider sur des métaphases normales, on va hybrider sur des puces à ADN ou a ARN. 6/17

7 Le déséquilibre de la fluorescence permet de voir s'il y a plus d'adn tumorale ou au contraire moins. Attention, c'est dépendant du pourcentage de cellules tumorales dans le prélèvement, s'il y en a peu (moins de 50%) on a peu de chance de voir l'anomalie, problème de ratio. Dépend aussi si l'anomalie est bi-allélique (si elle touche les 2 allèles) ou si elle est mono, ça fait des limites. Limites qui ont été franchies grâce à l'avènement des puces à ADN (fin année 90), où on va faire cette compétition entre l'adn tumoral (qui est maintenant en rouge) et l'adn normal (en vert) pour voir les gains ou les pertes sur ce que l'on appelle des microarrays (des lames comme des lames d'histologie sauf qu'elles valent euros la lame, sur cette arrays on a stocké des fragments de génomes qui sont des sondes qui ne sont pas marquées (inerte) et c'est en fait l'adn que l'on marque, ces sonde sont disposées tout le long du génome). L'intérêt c'est que l'on va pouvoir voir si l'adn est en gain ou en perte mais surtout on a une résolution beaucoup plus fine, maintenant on a des sondes toutes les 100 paires de bases, on a même des sondes qui peuvent correspondre à différentes versions alléliques d'un gène (par exemple sonde qui permet de repérer une mutation). On peut aller jusqu'à la détection de mutation ponctuelle. Donc l'avantage c'est qu'on n'a pas besoin d'être spécialiste, ça analyse tout le génome. Les limites c'est que ça ne détecte pas les pertes d'hétérozygotie ou isodisomie (perte équilibré) sauf si on a des sondes spécifiques des variations alléliques du génome. Donc soit on utilise des sondes array normales soit spécifiques de différents allèles d'un gène. Mais dans les deux cas, on a la même technologie avec des sondes de SNP (Single Nucleotid Polymorphisms). Ainsi, il faut des sondes spécifiques pour détecter des pertes d'hétérozygotie par recombinaison mitotique. Ces méthodes globales ont un intérêt pour voir un gain (par exemple, pour voir C-MYC ici en rouge). Ce type de représentation s'appelle une «heat map» pour carte de chaleur (en rouge ça brule donc il y a plus d'adn et inversement pour le vert, on refroidit -perte). On va pouvoir reconstruire par informatique un «pseudo caryotype» pour localiser au niveau du génome un gain ou une perte de gènes. Ceci permet de voir des gains, des amplifications dont la connaissance permet d'orienter le pronostic. (par exemple sur le chromosome 2 (p24), la présence du gène NMYC). On sait que lorsqu'une amplification de ce gène (et activation) est présente dans les neuroblastomes, elle est liée à un mauvais pronostic. Donc lorsque l'on détecte cette tumeur chez l'enfant, le pédiatre demande ce type d'analyse systématiquement. La courbe de survie représente le nombre de patients encore en vie. On commence à 100%, au fur et à mesure qu'ils meurent, on a le nombre de mois (on observe une chute sur le courbe) on remarque que les patients sans amplification survivent. En effet, si on se réfère à une courbe de survie, on peut voir très nettement que la présence de cette amplification est de mauvais pronostic quelque soit le stade de la tumeur. Ceci permet de déterminer un facteur pronostic pour un tumeur. La détection de mutations va conditionner le traitement de la maladie. Par exemple si N-MYC est présent, l'enfant va subir une chimiothérapie, une chirurgie et une greffe de moelle osseuse. Si l'amplification est absente, le traitement sera beaucoup moins lourd. Donc la détection de la mutation est très importante pour stratifier le traitement. Les méthodes globales peuvent s'appliquer à l'adn: c'est la CGH array mais aussi sur le transcriptome (ARNm de la tumeur). On extrait les ARNm de la tumeur uniquement, forcément sur tissu congelé!! on reverse en ADNc par transcriptase inverse. Ensuite on hybride l'adnc marqué avec un seul fluorochrome sur une puce à ADN. Dans ce cas, on ne va pas hybrider par compétition mais tout seul. A coté, sur une autre puce, on hybride un ADN témoin ce qui va 7/17

8 permettre de comparer les intensités entre l'adn normal et l'adn tumoral de l'expression des gènes. On repère des niveaux d'intensités de la fluorescence. On peut aussi faire une «heat map» avec le même principe. Ceci permet pour des tumeurs complexes (ex du SNC) de les classer selon des gènes qui seront allumer par des algorithmes informatiques. Ainsi, on peut déterminer des gènes prédictifs d'une signature génique. On essaie alors de réduire la signature, par des statistiques, à des gènes pouvant être déterminer par IHC (pour pouvoir détecter par IHC sur coupe de la tumeur, la présence de protéines prouvant l'expression du ou des gènes) au lieu d'étudier l'arn. Ces modèles permettent de réduire le nombre de gènes prédictifs. C'est un peu délicat mais cela a permis de mieux connaître les tumeurs mais aussi les protéines, ARN et gènes qui sont très importants, pour les étudier par des techniques plus simple. (non utilisé en pratique comme technique de diagnostic médical mais pour la recherche) {petites blagues: Quelle est la banque préférée des japonais? Le CIC, parce que le monde bouge. Quelle est la différence entre un groupe de fonctionnaires et un paquet de lessive? Le paquet de lessive contient toujours au moins 3 agents actifs.} 2 Les méthodes ciblées Ces techniques vont être plus applicables à l'échantillon individuel du patient. Dans le cas d'une translocation ou d'un réarrangement chromosomique, on peut faire de la FISH soit sur caryotype soit sur interphase (noyau) ce qui va directement visualiser l'anomalie chromosomique et nous donner le pourcentage de noyaux, de cellules qui portent cette anomalie. Alors que précédemment, on avait mélangé les cellules (au niveau ARN ou ADN) donc on ne pouvait définir le nombre, pourcentage de cellules concernées par la sur-expression. Ceci montre bien que les méthodes globales vont dépendre du nombre de cellules tumorales puisque c'est un mélange du génome ou du transcriptome de cellules tumorales par rapport aux cellules voisines (cellules endothéliales, cellules inflammatoires... présentes dans la tumeur). D'ailleurs un certain nombre de signatures tumorales ne dépendent pas de la tumeur elle-même mais des cellules de son micro environnement. D'où le problème, lorsque l'on a un catalogue de gènes, de savoir s'ils sont spécifiques de la tumeur ou seulement impliqués dans des phénomènes inflammatoires ou autres associés. Quand on fait une technique ciblée, on peut directement visualiser si l'anomalie se situe dans la cellule tumorale ou dans une cellule à coté. On le fait sur des lames de type histologique ou de type anapath. Sur lame on peut faire de la FISH, IHC qui va étudier les protéines dont on va dire si elles sont anormales par leur localisation (ex: protéine du noyau vue dans le cytoplasme ou inversement) ou leur niveau d'expression (ex: protéine trop abondante, fort signal ou au contraire perte du signal). Entre le chromosome et la protéine, on a la PCR pour permettre l'amplification de l'adn ou ADNc (RTPCR). La PCR pourra amplifier une mutation ou un point de cassure et la PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) ou RT-PCR vont pouvoir doser des transcrits normaux ou de fusion. L'intérêt de ces techniques est qu'elles peuvent être effectuées «a posteriori», après une analyse histologique sur tissu fixé, congelé ou sur des empreintes.mais pour étudier l'arn, on rencontre des difficultés avec le tissu fixé. En effet, l'arn est très labile donc il est en général détruit ou partiellement dégradé par la fixation.!! lors d'inclusion/enrobage, on chauffe la paraffine à 57 C ce qui va être responsable de la dégradation de l'arn classique parfois détecté mais rarement. Il faut retenir que sur tissu fixé, on peut faire de l'ifish, de la PCR à ADN et de l'ihc et on a besoin le plus souvent de tissu congelé pour faire de la RT-PCR ou RQ-PCR. FISH (ifish=fish sur noyaux interphasiques): Les deux régions impliquées sont constantes: Cette technique nécessite d'avoir une sonde, de la marquer puis de l'hybrider. On le fait quand on n'a pas de sonde commerciale disponible ou si on veut économiser des sondes. Quand on achète des sondes, par exemple pour la LMC, chromosome 9/22, on en met une sur le 9 et une sur le 22. On recherche des translocations par rapprochement de signaux fluorescent=fusion FISH. (fusion BCR-ABL dans la LMC). Ces sondes sont appelées «double couleur» puisque l'on a deux sondes (une du 9 et une du 22) que l'on va 8/17

9 hybrider sur un caryotype ou sur noyaux interphasiques. Ces sondes, sur chromosomes métaphasiques, mettent en évidence 2fluorescences: 1rouge en 3' et 1verte en 5' et le chromosome dérivé de la translocation qui a mis en fusion un bout du 9(q+) et un bout du 22(q-). Sur cellule interphasique, on a 2 chromosomes: en vert les 22 puisque la sonde BCR s'hybride sur le 22, en rouge les 2 chromosome 9 normaux (sonde ABL). Donc un profil normal va donner 2R+2V comme signal. Si on a une translocation réciproque, on a 1R et 1V qui vont être normaux mais on a 2 dérivés qui se sont échangées leur matériel génétique. Donc le profil d'une translocation réciproque équilibrée va être 1R+1V+2R/V (soit les 2dérivés de la fusion). Sur image caryotypique, on voit deux petites taches qui comptent pour un en interphase. En effet, en métaphase, la cellule est en train de dupliquer son matériel, on a donc des chromosomes à 2 chromatides alors qu'en interphase on a des chromosomes à 1 chromatide. Illustration 2: cellule normale sur noyau interphasique Illustration 3: cellule de LMC chromosome Ph(+) sur noyau interphasique Illustration 1: métaphase de cellule de LMC chromo Ph(+) Technique pour mettre en évidence les translocations réciproques entre gène des immunoglobulines sur le 14q32 et le gène Bcl2 anti apoptotique. Lorsque ce gène est surexprimé, il va bloquer l'apoptose des cellules et donc entraîner un lymphome dit folliculaire. (cf: ED) Pour le diagnostic de ce lymphome, il faut mettre en évidence cette translocation. On peut utiliser deux sondes «double fusion/double couleur» où on a une sonde dans chaque chromosome et dans les deux dérivés, on obtient 1R+1V+2R/V (2fusions). On peut aussi utiliser des sondes de Split (de séparation) ou sondes encadrantes qui vont venir couvrir le gène intéressant. On aura une sonde en 3' et une en 5' de couleurs différentes. Donc le profil normal du gène donne 2fusions soit 2R/V. Quand rupture sur le chromosome par translocation, on a une séparation des deux sondes et donc des couleurs. Donc 1 chromosome reste normal pour le partie marquée (on ne peut voir le chromosome sur lequel va se fixer la partie transloquée), on garde une fusion normale mais on a aussi une séparation donc le profil de translocation est 1R+1V+1R/V (1fusion). Par exemple, pour la même translocation que précédemment, le chromosome marqué est le 18 (Bcl2) qui possède les deux sondes (1 rouge et 1 verte) donc les deux couleurs. Le 14 ne possède pas de sonde, il n'est donc pas visible. Lors de la translocation, un chromosome 18 reste normal et donc garde la fusion (les deux sondes donc les deux couleurs) L'autre chromosome 18 subit la translocation (il n'a plus qu'une sonde donc une couleur ; ici le rouge) il y a donc séparation du gène et des sondes. Une des sondes va se fixer sur le 14 qui apparaît avec une couleur (ici en vert). Donc on a deux sondes, une sonde rouge en 5' et une verte en 3', on sait que le point de cassure a lieu à peu près entre les deux sondes. Ce point de cassure va séparer les deux sondes d'où 9/17

10 le nom de sonde de Split ou encadrantes. #les profils sont à connaître# Ce type de technique permet de simplifier la visualisation sur coupe de tissus fixés en paraffine. Quand on coupe la cellule pour faire les lames (3/4μm), on peut avoir dans les plans de coupe +/- tous les chromosomes, ce qui rend difficile de voir les fusions et même l'aspect normal. Quand on fait les sondes de Split, on vérifie si les signaux sont toujours co-localisés ou s'ils ont tendance à se séparer. L'interprétation est beaucoup plus facile. L'autre intérêt de ce type de sondes est lorsque l'on regarde un gène multi partenaire, cà-d qui n'est pas toujours impliqué dans la même translocation, qui ne s'échange pas toujours avec le même chromosome. Ex gènes EWS dans les sarcomes, ALK lymphome. Les deux régions impliquées sont variables: Ces gènes vont être toujours sur le même chromosome mais peuvent aller sur des chromosomes différents. Donc on a une sonde du gène qui est toujours impliqué avec un autre partenaire et on voit s'il se sépare ou s'il a une anomalie de structure. Dans tous cas, on a une dérégulation du gène ce qui permet de faire le diagnostic. On recherche des translocations par dissociation de signaux de fluorescents (break appart FISH) Gène ALK (anaplastic lymphoma kinase) impliqué dans des translocations dans des lymphomes mis en évidence en 1996 par Maurice (année où Dubus est parti aux states) mais depuis 2007, par une équipe japonaise, on a découvert que ce gène était aussi impliqué dans des cancers du poumon par les mêmes cassures. En 2010, un nouveau médicament est apparu qui cible cette tyrosine kinase (intra cellulaire) pour traiter les malades présentant un réarrangement de ce gène pour les tumeurs pulmonaires comme pour les lymphomes. Ainsi on essaie en routine d'appliquer la technique des sondes de Split pour détecter une séparation, une dissociation du signal par rapport à ce gène qui peut être remanié dans différentes translocations avec plusieurs partenaires. Les deux sondes sont dans deux régions différentes du même chromosome: recherche de délétion, amplification, duplication et détection d'aneuploïdie (changement numérique: monosomie, trisomie) en soit recherche de changement du nombre de copies. La FISH peut aussi permettre de montrer des gains ou des pertes d'un gène connu. Par exemple dans les cancers du sein (cf: ED), on cherche la présence d'un gain du gène R2 (famille des EGFR= EGFR2, récepteur à l'egf mais ici c'est un récepteur orphelin). Ce gène est très important, détecté par IHC ou FISH, on peut montrer des amplifications 10/17

11 de ce gène qui permettent de mettre les malades sous traitement à l'erceptine. Donc ici la FISH montre un gain, une augmentation du nombre de copies. Mais on peut aussi montrer des pertes de gènes importants : P16 ou CDKN2A, gène qui contrôle le point G1/S du cycle cellulaire, point de restriction. Quand ces gènes sont perdus, on a en même temps perte d'un frein dans la cellule d'où une accélération du cycle cellulaire. Il n'y a plus de restriction à ce point de contrôle. Ces gènes peuvent être perdus dans des cancers agressifs. Pour mettre en évidence une perte d'un gène, il faut avoir une sonde témoin qui correspond au même chromosome (soit une sonde du centromère soit une sonde du bras court du chromosome quand on veut regarder le bras long) et on fait le rapport entre les deux. Quand on a 1R et 1V, on a une cellule normale. Mais si on a beaucoup de vert, alors on a une augmentation, amplification (ex double minute) petit bout de chromosomes partout dans la cellule N-MYC multi loci dans cette cellule tumorale. Donc on voit que par rapport à la CGH qui est une technique longue et couteuse, il suffit simplement de deux sondes une témoin (rouge) et une spécifique du gène tumorale (verte) pour voir les modifications dans la cellule tumorale (sur une coupe). On peut dire le nombre, pourcentage de cellules tumorales qui portent ce profil d'amplification. On peut déterminer le nombre de cellules tumorales en quantifiant le nombre de signaux (ici augmentation du nombre de signaux verts). Gliome grade 2 et 3 par empreintes de la cellule tumorale pour voir si présence de délétions des bras court du chromosome 1p36 ou bras long du chromosome 19. Ceci sert pour l'impact pronostic de ces délétions, mais ici un impact de bon pronostic. Lorsque les patients n'ont pas ces délétions, ils ont une maladie plus agressive. Cette co-délétion 1p/19q résulte probablement d'une translocation réciproque déséquilibrée entre les deux. On peut quantifier pour donner le pronostic de la tumeur (ici on une diminution du nombre de signaux) {petites blagues: Qu'est-ce qui fait «oh pardon mademoiselle!...oh pardon mademoiselle!»? une taupe dans le jardin de Marc Dutroux Les femmes reprochent aux hommes de baiser trop vite, c'est connu... mais comment peut-on juger quelqu'un en 3 min?} 11/17

12 Méthodes ciblées de biologie moléculaire Ces méthodes reposent sur la PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Elle permet d'amplifier une séquence donnée à l'aide d'oligonucléotides, la séquence peut ensuite être analysée. On a besoin d'une Taq polymérase et d'une réaction cyclique : dénaturation, hybridation des amorces, synthèse de l'adn. L'amplification rend possible la détection sur un gel d'agarose, d'acrylamide ou un gel capillaire dans un analyseur de fragment : on fait passer l'adn dans un capillaire et on a un faisceau laser qui permet d'analyser la taille du fragment qui passe devant. Les techniques PCR ont remplacé celles de blotting (Southern Blot, par exemple), elles nous permettent de regarder les gènes, la structure des gènes selon la position des amorces que l'on met. On peut, par exemple, mettre en évidence des translocations en disposant les amorces de part et d'autre de la translocation. La translocation 14/18, par exemple, met en place le gène igh et le gène bcl2 ensemble ; pour la mettre en évidence il suffit de mettre d'un côté une amorce 5' bcl 2, de l'autre une amorce 3' Igh et d'amplifier le point de cassure de la translocation. Cette méthode est utilisable lorsque le point de cassure de la translocation est relativement constant ; il ne peut pas s'agir de rechercher la translocation d'un gène qui peut se réaliser avec de multiples partenaires différents tel que celle de EWS ou lorsque le point de cassure est très variable. Avec des amorces, on peut amplifier soit l'allèle normal soit l'allèle transloqué. Avec ce type d'amorce on peut amplifier l'allèle normal ou l'allèle qui présente une mutation ponctuelle dans l'adn : une substitution d'une seule base ou une délétion d'une seule base ou une insertion de base. On peut le faire sur de l'adn, sur de l'adnc ce qui revient à étudier l'arn après transcription inverse. On peut faire, en aval de la PCR, du séquençage. Autrefois, on travaillait en plateau final de la PCR ; son inventeur avait montré qu'il fallait amplifier au moins 35 cycles, que globalement à partir de 20 cycles, on était dans l'exponentiel et qu'à 25 cycles, on était déjà en plateau. Ceci a donné l'idée de repérer la cinétique de l'amplification en incorporant dans l'adn amplifié, au fur et à mesure de sa synthèse, un agent intercalant. En incorporant du BET ou du LC 480 qui sont des agents fluorescents intercalants, on voit la photocopie génique se réaliser et on peut la tracer, à travers le tube, grâce à des appareils tels que la PCR quantitative en temps réel : on voit en temps réel arriver les copies d'adn. La cinétique de la PCR est telle que pour deux échantillons qui ont initialement des quantités d'adn différentes, en point final, les quantités pourront être identiques mais en point de démarrage, c'est à dire lorsque la PCR débute, lorsqu'il y a l'accélération de la phase exponentielle, on a dans l'échantillon qui débute le plus tôt plus de copie du gène que dans l'échantillon qui sort après : c'est ce que l'on appelle le crossing point ou le cycle threshold (Ct)ou le cycle seuil. Dans l'exemple, le Ct de l'échantillon 1 (éch1) étant de 17 cycles, l'echantillon renfermait initialement davantage de matériel à amplifier que l'échantillon 2 ( éch 2) dont le Ct est de 19 cycles. 12/17

13 Cela a été un grand progrès pour la quantification des copies géniques ou la quantification des ARNm via l'adnc (très important à comprendre). L'agent fluorescent est soit un agent intercalant, non spécifique, qui se lie à l'adn double brin, soit, éventuellement, une sonde sécifique de la séquence à amplifier (sondes de type taqman, fret,... peu importe). Il s'agit d'une technique très intéressante quand on veut juste quantifier la copie d'un gène ou d'un ARN. Par exemple, dans le cas de la leucémie myéloïde chronique, les hématologues suivent les patients via la quantification des transcrits BCR-ABL dans le sang. Il a été démontré maintenant que cette quantification des transcrits BCR-ABL dans les cellules sanguines pour les patients qui sont sous traitement peut remplacer le dosage des cellules tumorales, l'étude des caryotypes. Pour les tumeurs solides, on peut via cette technique doser les anomalies génétiques voire repérer des mutations. Pour repérer des mutations, historiquement, a été utilisée la méthode de Sanger. Avec un ADN matrice, on utilise une amorce et on synthétise à la suite de cette amorce de l'adn en utilisant des didéoxynucléotides, à chaque fois qu'un de ces didéoxynucléotides est incorporé, la synthèse s'arrête. En répétant l'opération, on a la possibilité de voir comment était la matrice. On fait migrer ce que l'on a obtenu sur une électrophorèse capillaire qu'on appelle séquenceur, le laser détecte le fluorochrome qui apparaît sous la forme d'un pic (1 fluorochrome pour un nucléotide) et ensuite, on interpréte très simplement. 13/17

14 La recherche de mutation peut être effectuée pour un gène tel que FGFR3 (sujet de thèse de David Capellen, qui travaillait alors à l'institut Curie, thèse soutenue en 1999). A l'hôpital, des analyses de KI-ras, EGFR, kit,... sont également réalisées. Dans le tissu sain, le gène est non muté : vous avez un A, un G et un C. Dans la tumeur, le C devient un double pic CT(allèle normal: C, allèle muté : T) et ensuite reprise du cadre de lecture normal avec GCT. Le double pic CT pourrait également s'expliquer par le mélange de cellules saines aux cellules tumorales. (La diapo 36 n'a pas été intégrée car elle n'aurait pas été lisible, Merlio commente les courbes en haut, à gauche). Il existe deux grands types de cancer de la vessie. Les plus fréquents sont superficiels, se différencient dans la lumière vésicale, et récidivent mais ne tuent pas le malade dans les deux ans. La prise en charge repose sur l'exérèse des tumeurs à mesure qu'elles apparaissent. Ces tumeurs sont mutées pour FGFR3. Les tumeurs qui ne sont pas mutées pour FGFR3, au contraire, plongent dans l'épaisseur de la paroi vésicale et deviennent métastatiques, avec mort du patient à 2 ans. Une cystectomie complète, d'emblée, est alors nécessaire ; une poche branchée aux uretères ou une vessie artificielle pallient à l'absence de vessie. Il est donc très important de détecter ce type de mutation pour la prise en charge initiale du cancer, à côté de tout stade de développement tumoral. C'est un exemple de l'intérêt de repérer les mutations des cancers solides. Introduction aux études des pertes d'hétérozygotie dans les tumeurs par l'étude des microsatellites (nous ne serons pas interrogés sur ce thème) Un génome est formé de séquences microsatellites (aussi appelées STR : Short Tandem Repeat), séquences qui sont répétées dans tout le génome. Par exemple, les télomères et les centromères sont également des séquences répétées. Les microsatellites sont des séquences beaucoup plus petites qui correspondent en général à des répétitions de CA ou de CT (dinucléotides, trinucléotides, tétranucléotides) qui sont dispersées dans tout le génome ; ces répétitions ne sont pas pathologiques, elles sont simplement caractéristiques d'allèles, de différentes versions de notre génome. On a chacun des microsatellites qui sur un de nos chromosomes viennent de notre père et sur l'autre chromosome viennent de notre mère et ces répétions (de CA ou GC, ) sont plus ou moins longues chez un individu. Par exemple, un individu va avoir 5, l'autre 10, un troisième 20 répétitions, en général c'est de l'ordre de 10 à 20. L'analyse de ces répétitions exige, pour voir s'il y a un phénomène différent dans la tumeur, de comparer l'adn normal du patient, présent dans ses cellules sanguines, à l'adn de la tumeur. Si, dans la tumeur, un bout de chromosome est perdu, une région où se situe ces répétitions est perdue, on a disparition, lorsqu'on fait migrer l'adn, de l'une des deux copies de répétitions. Par exemple, la répétition à 20 disparaît et celle à 25 est présente. Il s'agit d'une perte d'hétérozygotie puisque l'hétérozygotie c'est le fait d'avoir un allèle paternel et un allèle maternel, on est à l'état normal hétérozygote pour ces séquences microsatellites. 14/17

15 Maintenant, au lieu d'utiliser ces séquences microsatellitaires répétées, on utilise de plus en plus des polymorphismes d'un seul nucléotide ce qu'on appelle SNP : Single Nucleotid Polymorphism qui sont non pas des répétitions mais des variations d'une base entre la version maternelle et la version paternelle qui ne changent pas le cadre de lecture de l'adn. Par exemple, il y a des endroits du génome où, à la place d'un A, il y a 50% de chance d'avoir un T ou un G : sur le premier chromosome le SNP est A et sur l'autre chromosome, il va être G sans que cela change la protéine codée car ce polymorphisme siège soit dans un intron ou une région régulatrice, qui ne sont pas forcément codantes et dans les régions codantes on peut avoir des SNP qui sont des mutations silencieuses : une base est changée dans un codon mais pas l'acide aminé. Maintenant, avec le séquençage global du génome, on commence à connaître, tout le long du génome, ces SNP et cela a un peu remplacé l'étude des séquences microsatellites, cela permettait dans les tumeurs d'analyser les pertes d'hétérozygotie : si vous avez dans la tumeur un allèle paternel et un allèle maternel ou si, au contraire, il n'y a plus qu'un des deux allèles. Voici une première application de ces études de microsatellites (on nous a donné un exemple de la mutation du gène SUFU, diapo 37). L'étude des SNP et des STR permet aussi de réaliser des analyses de liaison, l'établissement de l'association d'un allèle avec un phénotype d'agressivité tumorale ou de chimiorésistance. A RETENIR L'étude des séquences microsatellites est importante pour rechercher un mécanisme phare dans le cancer du côlon, celui d'instabilité microsatellitaire. Il s'agit d'un mécanisme dans lequel les gènes de réparation de l'adn sont atteints. On a comme phénotype, et non comme génotype, l'instablité des séquences microsatellitaires. On a pas instabilité du génome, des chromosomes mais juste ce mécanisme d'instabilité microsatellitaires par défaut de réparation de l'adn. C'est un phénomène que l'on recherche systématiquement dans les cancers colorectaux de l'homme ou de la femme jeune (avant 50 ans voire 60 ans). Dans le cas de l'instabilité des microsatellites, on a plus seulement l'allèle maternel et l'allèle paternel, on a des néo-allèles. Ce sont des anomalies qui surviennent lors de la division de l'adn, lors de la réplication de l'adn : la réplication de l'adn n'est pas corrigée car certains gènes de réparation sont defficients et cela aboutit à l'accumulation de répétitions, de bégaiements lors de la réplication de l'adn. Ce qui suit ne sera PAS A L'EXAMEN. On estime que cette instabilité génétique est à la fois un marqueur et un mécanisme d'apparition du cancer du côlon. On réalise une enquête familiale chez le patient pour voir si d'autres tumeurs peuvent être liées à ce mécanisme, chez lui et dans sa famille. On étudie alors les gènes impliqués dans la réparation de l'adn et dans les phénomènes d'instabilité microsatellitaire. En étudiant le génotype des tumeurs on peut étudier son génome mais la signature génétique d'une tumeur, c'est aussi du phénotype. La génétique d'une tumeur c'est son génome, les traits phénotypiques c'est notre apparence, quand on regarde un caryotype ou un profil de CGH array ou une instabilité des microsatellites, on a une signature génétique de la tumeur qui est aussi du phénotype tumoral, on a comme une empreinte digitale de la tumeur au niveau génétique. C'est intéressant quand on utilise des algorithmes biostatistiques pour classer les tumeurs dans différentes catégories : de bon pronostic, de mauvais par rapport à des données cliniques. On peut ensuite par biostatistique utiliser ce génome comme phénotype tumoral pour voir quelles sont les anomalies génétiques globales qui peuvent être associées statistiquement avec une récidive, une mort à deux ans, une invasion, des métastases, etc... On rentre tous les caractères connus chez les patients (étude prospective ou rétrospective) et puis via la 15/17

16 biostatistique on arrivezà clusteriser, à classer les tumeurs et à repérer quelles sont les anomalies génétiques incriminées. Cela peut amener à repérer les tumeurs qui sont très agressives et on voit que ces tumeurs ont, par exemple, une amplification de tel gène MDM2, vous expliquez la biologie parce que ce type de tumeur a une amplification de MDM2. Et à ce moment- là, au lieu d'utiliser des techniques de biologie moléculaire complexes, on peut recourir à une immunohistochimie dirigée contre la protéine MDM2 ou à une sonde FISH anti gène MDM2 pour voir si, dans la tumeur, il ya une amplification de MDM2. Exemple d'une analyse de SNP ou STR Dans les cellules sanguines du patient, cellules saines, sont retrouvés l'allèle paternel et l'allèle maternel qui correspondent aux deux pics de fluorescence, le fragment de 100 paires de base et le fragment de 110 paires de base. L'un des deux allèles se distinguent par dix répétitions supplémentaires. Au sein des cellules tumorales, un seul des deux allèles subsiste : il y a perte d'hétérozygotie. La taille d'un fragment amplifié correspond à la somme de la taille des oligonucléotides c'est-à dire des sondes utilisées pour réaliser la PCR et de la taille de ce qu'il y a entre les oligonucléotides. Ici, on peut, par exemple, avoir des oligonucléotides de 25 bases chacuns, et, dansun cas, une répétition de 50 et, dans l'autre, de 60, ce qui donne deux tailles différentes. S'il y avait instabilité microsatellitaire, on aurait les deux allèles parentaux, plus de nouveaux allèles qui témoigneraient d'un bégaiement de l'adn lors de la réplication. Détection du changement de statut de méthylation de l'adn La technique décrite est celle mise au point par Pierre (copain Bubus) pour les glioblastomes, tumeurs très malignes du système nerveux central, à distinguer des gliomes. Ce n'est pas une délétion de 1p 19q comme dans les gliomes qui est importante, on sait qu'il y a des mutations d'autres gènes, isocitrate déshydrogénases 1 et 2 notamment, qui comptent, peu importe,... On sait maintenant qu'il y a des profils de tumeurs où l'adn est méthylé et d'autres où il ne l'est pas et plus spécifiquement, dans l'adn méthylé, il y a un gène de réparation de l'adn qui s'appelle MGMT, important dans la réparation de l'adn des cellules tumorales. Lorsque l'adn est méthylé, les promoteurs, notamment, peuvent être méthylés, l'expression du gène est éteinte. Dans les phénomènes d'empreinte parentale, une des deux copies du gène est méthylé et l'autre copie s'exprime. Selon le tissu également on a méthylation totale de 16/17

17 certains gènes. Concernant MGMT, on regarde si le gène est méthylé ou non de la manière suivante : la méthylation des cytosines protège l'adn du bisulfite de sodium, en revanche, les cytosines non méthylées sont converties en uracile après traitement par ce bisulfite de sodium. Commentaire de la diapositive : on a un ADN bisulfité non méthylé pour lequel les C sont converties en U et un ADN bisulfité alors qu'il était méthylé, dans ce cas-là, la cytosine initiale est préservée car elle était protégée par la méthylation. Il suffit ensuite de faire une amplification par PCR avec deux couples d'amorces (primer) différents : - un couple qui permet l'amplification dans le cas où l'adn était non méthylé : les amorces contiennent des adénines complémentaires des uraciles -un couple qui permet l'amplification dans le cas où l'adn était méthylé : les amorces contiennent des guanines (à la place des adénines) complémentaires des cytosines, on regarde quel est le produit d'amplification prédominant et on en déduit l'état initial de méthylation du gène MGMT. On déduit de cette technique de génétique si, épigénétiquement, (car il ne s'agit pas ici d'une mutation seulement de l'ajout d'un -CH3 sur les cytosines) le gène MGMT était méthylé. Le gène MGMT est méthylé dans des tumeurs sensibles à un traitement, le témodal, si le gène MGMT est non méthylé, les patients ne peuvent pas recevoir ce traitement. L'exploration de la méthylation est intéressante dans d'autres circonstances. L'hyperméthylation peut inactiver des gènes supresseurs de tumeurs (CDKN2, P16). Pour certains gènes, dans une tumeur, on peut avoir une perte d'un gène en FISH : on voit la disparition d'un signal, et méthylation de l'autre allèle. Nous savons qu'il y a toujours deux copies d'un gène et que lorsque survient une mutation activatrice d'un oncogène, il suffit qu'une seule copie soit mutée pour avoir un gain de fonction ; en revanche, pour perdre un gène supresseur de tumeur, il faut inactiver les deux copies. Lorsque la première copie est délétée, la seconde se met à être exprimée. Ce type d'étude de la méthylation de l'adn permet de démontrer, lorsque vous avez une mutation inactivatrice ou une délétion sur une des deux copies, que l'autre copie est méthylée, inactivée. Il peut être aussi intéressant, avec des amorces spécifiques d'une région, de regarder si la méthylation est globale ou spécifique d'un gène. On dispose maintenant de puces, d'arrays pour étudier la méthylation. Conclusion Intérêts de ces méthodes: -diagnostic -pronostic -inclusion ou exclusion à des thérapies ciblées 17/17