Photosensibilisateurs : vectorisation et ciblage

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1 Photosensibilisateurs : vectorisation et ciblage Stéphanie Bonneau Laboratoire de Biophysique Moléculaire, Cellulaire et Tissulaire BIOMOCETI Université Paris 6 / CNRS UMR 7033

2 INTRODUCTION

3 Photosensibilisateurs et Thérapie Photodynamique Traitement des maladies associées à une hyperprolifération cellulaire Photofrin O O HO O H H N N O H H N N N N H H N N N N H O H C O O H C O O H OH H N N N NH HO Foscan N N H C O O H C O O HC O O H C O O H N N H OH C O O H O C O H N N N N H O H O H H N N N N H O H N N O H MeO 2 C MeO 2 C C H 3 C H 3 C H 2 C H N H N N H N C H 3 Visudyne C O O H C O O H C O O H C O O H C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C O 2 H( Me) C O 2 Me ( H )

4 Processus photodynamiques S2 processus non radiatifs S1 conversion intersystème absorption T1 fluorescence phosphorescence S0

5 Sélectivité de la Thérapie Photodynamique Phases et composantes de la thérapie Injection Retention dans les tissus cibles Irradiation de la zone cible Destruction de la zone marquée et irradiée Deux facteurs de sélèctivité - Ciblage des tissus - Définition de la zone irradiée

6 Mécanismes de destruction tumorale cellulaire (apoptose ou nécrose) vasculaire Importance de la localisation sub-cellulaire Importance du délais avant irradiation et de la pharmacocinétique réponse immunitaire Ce6 t = 10 et 75 min (Hamblin 1999)

7 Pharmacocinétique et PDT Importance des aspects cinétiques en PDT irradiation Photosensibilisateur concentration Anti-cancéreux traditionnel

8 Pharmacocinétique des photosensibilisateurs et Biodistribution

9 Transport dans l organisme Administration intra-veineuse Absorption intestinale Production endogène Métabolisme hépatique Grande circulation Passage transmembranaire diffusion ou endocytose Liaison protéique Solubilité Métabolisme hépatique cible Élimination hépatique Élimination rénale Caractéristiques locales de la circulation

10 Pharmacocinétique et Biodistribution Modèles de pharmacocinetique Photofrin 3 compartiments : 16h, 7.5j et 155.5j (Bellnier 1996) Foscan 3 compartiments : 0.46, 6.91 et 82.5h (Jones 2003) Tookad 2 compartiments : 2 min, 1.3h (Brun 2003) Variabilité + modification en fonction de la dose et du mode de vectorisation Biodistrubution Hépatho-splénique Photofrin (Bellnier 1989) Phtalocyanine d aluminium sulfonation (Chang 1990)

11 Structure des photosensibilisateurs, localisation tumorale et vecteurs

12 Localisation tumorale et structure du PS Mécanisme de la rétention spécifique Rôle du micro-environnement Complexes LDL-médicaments Ciblage des tissus en croissance Ratio 2-4:1 selon les PS Variabilité: Structures, tumeurs, doses, délais après injection variables Structure PS et répartition plasmatique + Hydrophobe - ZnPc Lipoprotéines TPPS2a, Ce6 Lipoprotéines + HSA TPPS3, TPPS4 Fixation majoritaire à HSA

13 Localisation tumorale et Vectorisation des PS Solubilité limitée des PS Cremophore modifie distribution plasmatique et efficacité (Woodburn 1994) Liposomes Transfert vers les LDL (Photofrin Jiang 1997) Ciblage d un compartiment Formation de complexes (LDL-PS) HP-free/HP-LDL Vasculaire/cellulaire (Zhou 1980) Vésicules de Dyctiostelium incorporation cellulaire

14 Localisation tumorale des PS Néovascularisation : PS associé à HSA, HDL, LDL, VLDL Accumulation sélective Rétention sélective Rapide Perméabilité de la néovascularisation tumorale Extravasation du PS (association du PS à la HSA) Lente Diverses explication : - LDL - Acidification de l environnement - Faible drainage lymphatique - Rôle des macrophages - Propension à accumuler les «lipids droplets»

15 Mécanismes de la rétention spécifique tumorale

16 Fixation du PS aux LDL PS amphiphiles AlPcS2a, Ce6, DP P F = A 0 -A 1.exp(-k 1 t)-a 2.exp(-k 2 t) où K 1, 2 = ½{ k±[ ( k) 2-4(k dp.k dl +k al.k dp +k ap.k dl )] ½ } association k = (k ap +k al ).[LDL]+k d P F = A 0 -A 1.exp(-k 1 t)-a 2.exp(-k 2 t) dissociation k 1 = k dp et k 2 = k dl

17 Fixation du PS aux LDL Deux types de fixation «Classe P» interface lipides/apoprotéine «Classe L» répartition dans les lipides Peu de fixation sur l Apo reconnaissance par les récepteurs «B-E» Fortes affinités MODIFIEES PAR ph Les LDL = bons transporteurs des photosensibilisateurs Rôle du micro-environnement Rapidité relative des évènements Association 10-4 s Dissociation 0,1 s Possibilités d échanges entre les transporteurs potentiels

18 Les modèles de membrane Dioleoylphosphatidylcholine (C18:1) Extrusion Vésicules unilamellaires

19 L interaction PS-membrane k on k in k off k ex Signal de fluo Temps (s) Temps (s) deutéroporphyrine

20 Mécanismes d association à la membrane et espèces mises en jeu pk N2 = 2,7 5,3? NH N pk N1 = 4,4 COOH COOH H CH 3 H H 3 C CH NH 3 N N H H N HN N H 3 CH C H 3 H CH 3 pk A1 = 5,4 + COOH COOH NH N NH HN (Formes dimères) N HN 6,9 et 7,1 pk A2 = 6,0 NH + HN + NH HN COOH COOH Entrée défavorisée par les dimères COOH COO NH N N HN COOH COOH Sortie facilitée par les charges carboxyliques COO COO

21 Fenêtre d efficacité pk N1 pk A1 pk A2 flip-flop ph acides ph basiques association Azotes centraux chargés Neutralisation des azotes Charge des chaînes carbonées Pénétration moins profonde association à la membrane dimérisation entrée Sortie facilitée

22 Comportement vis-à-vis des membranes 2-flip-flop 3-sortie DP 1-entrée AlPcS2 Ce6

23 Incorporation cellulaire de la DP et de AlPcS2

24 Incorporation cellulaire de la Ce6 Influence du ph Implication des LDL

25 Voies cellulaires d internalisation des PS

26 Voies d internalisation cellulaire et localisation finale Endosome Lysosome Vésicule d endocytose ph 6 ph 5 Noyau Endocytose Non médiée ou LDL dépendante ph 7.4 Diffusion passive Membrane plasmique Mitochondrie Appareil de Golgi Reticulum endoplasmique

27 Incubation cellulaire avec la porphyrine DP Incubation 15 min DP + LDL Marquage membranaire et cytosolique Pas de modification de la localisation avec les LDL Relocalisation rapide entre les différents systèmes lipidiques

28 Incubation cellulaire avec la phtalocyanine di-sulfonée Incubation 15 min AlPcS 2 AlPcS 2 + LDL AlPcS 2 Lyso-tracker green Colocalisation Marquage pontuel, pas de redistribution dans les différentes membranes Pas relocalisation, l endocytose gouverne la localisation cellulaire

29 Incubation cellulaire avec la Chlorine e6 Ce6 Incubation 15 min Ce6 + LDL Marquage des vésicules d endocytose et de lysosomes Marquage faible de la membrane La localisation ponctuelle est accentuée par l association aux LDL

30 Mécanismes de l internalisation cellulaire LDL transporteurs systémiques Influence dans l internalisation sous dépendance de : - vitesse de passage transmembranaire - et des échanges inter-transporteurs

31 Implications thérapeutiques Localisation cellulaire voie et mécanisme de mort cellulaire efficacité Efficacité et pharmacocinétique des médicaments Association aux protéines plasmatiques Franchissement des membranes Importance des phénomènes de redistribution et de déplacement d équilibre

32 Implications biotechnologiques PCI (Internalisation photo-assistée) Thérapie génique Acides nucléiques = macromolécules Cibles intracellulaires Noyau Cytoplasme Endocytose lysosomes > transfection > vaccinations par ADN Cancer Res., (6): p ; Hum. Gene Ther., (6): p ;