Annexe: 0 Dosage des Tétracyclines dans la viande (porc, bœuf, volaille) par LC-MS/MS P. : 1/12
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- Marc Thomas
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1 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : /2 VALIDATION Procédure décrite dans le SOP 22/F/7. Les tétracyclines font partie des substances autorisées du groupe B de la Directive 96/23/CE. L analyse de ces molécules a été validée selon la décision 22/67/CE par rapport aux MRL imposées, en tenant compte du cas particulier où la MRL est fixée pour une somme de plusieurs substances (cas des tétracyclines et de leurs formes 4 épimères). Dans ce cas, les paramètres dont il faut tenir compte sont : la limite de quantification et l exactitude/précision à la LOQ la linéarité l effet de matrice l exactitude : rendement apparent la précision : répétabilité et reproductibilité intralaboratoire à ½, x et. x MRL la sélectivité/spécificité la limite de décision (CCα) et la capacité de détection (CCβ) la stabilité. MRLs (en janvier 2) Chlortetracycline (CTC) Doxycycline (DC) Oxytetracycline (OTC) Tetracycline (TC) Résidus marqueurs CTC + 4epiCTC DC OTC + 4epiOTC TC + 4epiTC 2. La limite de quantification (LOQ) Espèces Toutes les espèces produisant de la nourriture Bœuf/Porc/ Volaille Toutes les espèces produisant de la nourriture Toutes les espèces produisant de la nourriture MRL (ppb) /Matrice ppb /muscle ppb /muscle ppb /muscle ppb /muscle Dans le cas particulier où une MRL est fixée pour une somme de plusieurs substances, la décision 22/67/EC recommande, en plus de la détermination de l exactitude aux trois niveaux de concentration autour de la MRL, de déterminer ou aumoins d avoir une certaine connaissance de la concentration la plus basse détectable avec la méthode en question et de l exactitude (précision et rendement) de la méthode à cette concentration. Pour ce faire, des échantillons blancs ont été dopés avec des concentrations décroissantes en tétracyclines et à raison de deux répliques par niveau de concentration. Les niveaux de concentration étudiés sont les suivants : 2 ppb, ppb, ppb, 2. ppb et ppb. Les résultats du rendement et de la précision (CVr) obtenus sont récapitulés dans le tableau cidessous : 2.. Validation principale : viande de porc
2 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 2/2 Conc. spikée (ppb) Rendement (%) n = x TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Validation complémentaire : viande de bœuf CVr (%) n = x TC epitc OTC Conc. spikée (ppb) Rendement (%) n = x CVr (%) n = x
3 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 3/2 epiotc CTC epictc DC
4 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 4/ Validation complémentaire : viande de volaille TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Conc. spikée (ppb) Rendement (%) n = x CVr (%) n = x Conclusion : porc/bœuf : il est possible de détecter chaque molécule aumoins à ppb en conservant des valeurs de rendement raisonnables et des CVr < CV Horwitz (4.7% pour des teneurs < ppb), en même temps qu un S/N sur le 2 ème ion fille supérieur à 3. volaille : la LOQ se situe entre et 2 ppb, car il y a plus d effet de matrice pour cette espèce.
5 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : /2 3. L effet de matrice L absence d effet de matrice lors de la quantification est démontrée comme suit : Cinq échantillons négatifs sont extraits puis fortifiés en fin d analyse à une concentration correspondant à, ½ MRL, x MRL,. x MRL et 2 x MRL. Chacun de ces standards en matrice est injecté deux fois, en parallèle avec des standards en solutions de concentrations équivalentes (deux injections par niveau également). Les valeurs obtenues sont portées sur un graphique avec en abscisse la concentration et en ordonnée la réponse, c estàdire la surface du pic de l analyte divisée par celle du pic du standard interne correspondant. L absence de différence significative entre les coefficients angulaires des deux droites (t exp < t table) indique l absence d effet de matrice, ce qui signifie que des standards en solutions peuvent être utilisés lors de la quantification. Les valeurs obtenues pour le t test sont récapitulées dans le tableau cidessous : Viande de porc Viande de bœuf Viande de volaille t exp effet t exp effet t exp effet TC.448 non 2.62 oui oui épitc.2 non 9.74 oui 8.92 oui OTC.32 non oui.6 oui épiotc oui oui 8.3 oui CTC.866 non oui 8.43 oui épictc 7.47 oui oui 2.7 oui DC oui.77 non oui ttable Conclusion : étant donné qu il existe un effet de matrice significatif pour certaines tétracyclines, toutes les quantifications effectuées lors de la validation ont été réalisées à partir des droites en matrice. De plus, lors de la confirmation d échantillons suspects, des droites en matrice devront impérativement être utilisées pour quantifier le plus exactement possible la concentration présente en tétracyclines.
6 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 6/2 4. La linéarité La linéarité (ou la nonlinéarité) du modèle de régression utilisé pour la quantification est évaluée à l aide du test de Mandel. Pour ce faire, on porte en graphique la réponse obtenue en fonction de la concentration des standards de la droite utilisée pour quantifier. Après avoir comparé les modèles de régression linéaire (y = ax + b) et quadratique (y = dx 2 + ex + f), le test de Mandel détermine lequel des deux doit être préférentiellement utilisé : si TV < F critique, alors régression linéaire si TV > F critique, alors régression quadratique Viande de porc Viande de boeuf Viande de volaille TV Régression TV Régression TV Régression TC.3 Linéaire.624 Linéaire 7.22 Linéaire épitc 4.87 Linéaire.87 Linéaire Linéaire OTC 7.33 Linéaire.434 Linéaire 3.34 Linéaire épiotc.94 Linéaire.36 Linéaire Linéaire CTC.28 Linéaire 3.78 Linéaire 6.26 Linéaire épictc.7 Linéaire.62 Linéaire. Linéaire DC.282 Linéaire.2 Linéaire.88 Linéaire F critique Conclusion : en ce qui concerne le dosage des tétracyclines dans la viande, le modèle de régression linéaire doit être appliqué pour toutes les molécules.. La limite de décision CCα et la capacité de détection CCβ Pour les substances autorisées (avec MRL), le CCα correspond à la concentration audelà de laquelle on peut conclure que l échantillon est non conforme (positif) avec une erreur α de %. Le CCβ correspond à la concentration audelà de laquelle on peut conclure que l échantillon est vraiment non conforme (positif) avec une certitude statistique de β. Pour les substances autorisées, cette certitude s élève à 9%. Le CCα et le CCβ sont déterminés en utilisant la procédure de la courbe d étalonnage selon la norme ISO 8432, telle que décrite dans la décision 22/67/CE. Dans le cas d une validation principale, des échantillons négatifs sont fortifiés à une concentration correspondant à «½ MRL», «x MRL» et «. x MRL»; à raison de trois répliques par niveau de concentration. Cette procédure est répétée à trois reprises sur trois jours différents. Les trois niveaux de concentration utilisés lors de la validation dans la viande, ainsi que les valeurs obtenues pour CCα et CCβ sont détaillés dans les tableaux cidessous :
7 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 7/2.. Validation principale : viande de porc. * MRL * MRL. * MRL CCα CCβ TC 7 9 epitc 2 4 OTC 27 epiotc 27 3 CTC 6 epictc 3 26 DC Validation complémentaire : viande de bœuf et volaille Dans le cas d une validation complémentaire, étant donné qu il n y a qu un seul niveau de concentration, le CCα et le CCβ sont obtenus en appliquant, respectivement les formules : CCα = MRL +.64 * Srw CCβ = CCα +.64 * Srw où Srw est la déviation standard de la reproductibilité intralaboratoire obtenue à la concentration considérée Viande de bœuf Viande de volaille MRL Srw CCα CCβ MRL Srw CCα CCβ TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC L exactitude : rendement apparent Le rendement apparent («apparent recovery») est le rendement obtenu après correction avec un standard interne. Il ne correspond donc pas au rendement réel de l extraction («extraction efficiency»). Dans le cas présent, le rendement apparent a été calculé pour chaque niveau de concentration. Les niveaux de concentrations utilisés et les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau cidessous :
8 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 8/2 6.. Validation principale : viande de porc TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Conc. spikée (ppb) Conc. (ppb) n = 3 x 9 Rendement (%) Validation complémentaire: viande de bœuf & volaille Viande de bœuf Viande de volaille n = 2 x 6 Conc. (ppb) Rendement (%) Conc. (ppb) Rendement (%) TC 67 3 epitc 7 OTC 96 3 epiotc CTC 3 88 epictc 86 2 DC Conclusion : pour des concentrations supérieures à ppb, le rendement apparent doit être compris entre 8 et %. Le fait que la plupart des rendements se situe endehors de cette gamme est du à l absence d isotopes marqués pouvant être utilisés comme standards internes. La correction de concentrations obtenues par les rendements de l échantillon de contrôle est impérative!
9 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 9/2 8. La précision : répétabilité (r) La répétabilité (r) est obtenue au cours de la procédure utilisée pour déterminer CCα et CCβ. Le coefficient de variation de ce paramètre est évalué à chaque niveau de concentration selon la norme ISO 722. La valeur obtenue CVr est exprimée en % et doit être inférieure à ⅔ du CV obtenu par l équation d Horwitz. Les valeurs obtenues pour CVr et les valeurs maximales à ne pas dépasser (= ⅔ CV Horwitz) sont résumées dans les tableaux cidessous : 8.. Validation principale : viande de porc. * MRL * MRL. * MRL CVr Max CVr CVr Max CVr CVr Max CVr TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Validation complémentaire : viande de bœuf & volaille Viande de boeuf Viande de volaille CVr Max CVr CVr Max CVr TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Conclusion : en ce qui concerne les tétracyclines dans la viande, les valeurs obtenues pour la répétabilité satisfont aux critères de l équation d Horwitz pour toutes les molécules.
10 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : /2 9. La précision : reproductibilité intralaboratoire (RW) La reproductibilité intralaboratoire (RW) est obtenue au cours de la procédure utilisée pour déterminer CCα et CCβ. Le coefficient de variation de ce paramètre est évalué à chaque niveau de concentration selon la norme ISO 722. La valeur obtenue CVRw est exprimée en % et doit être inférieure au CV obtenu par l équation d Horwitz. Les valeurs obtenues pour CVRw et les valeurs maximales obtenues pour l équation d Horwitz sont résumées dans les tableaux cidessous : 9.. Validation principale : viande de porc. * MRL * MRL. * MRL CV RW Max CV RW CV RW Max CV RW CV RW Max CV RW TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Validation complémentaire : viande de bœuf & volaille Viande de boeuf Viande de volaille CV RW Max CV RW CV RW Max CV RW TC epitc OTC epiotc CTC epictc DC Conclusion : en ce qui concerne les tétracyclines dans la viande, les valeurs obtenues pour la reproductibilité intralaboratoire satisfont aux critères de l équation d Horwitz pour toutes les molécules.
11 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : /2. Vérification des critères d identification Pour identifier les molécules par LCMS/MS, le système de points de la Décision 22/67/EC a été appliqué. Trois points d identification sont nécessaires pour les molécules autorisées (groupe B de la directive 96/23). Ces points sont obtenus en se basant sur la présence de l ion parent ( point) et sur la présence de deux ions filles (. points x 2) suivis lors des deux transitions MRM de monitoring en MS/MS... Validation principale : viande de porc En ce qui concerne le respect des critères d identification, sur les 9 échantillons de viande enrichis au 3 niveaux de concentration utilisés, il a été démontré que les critères d identification basés sur le temps de rétention relatif (tolérance de ± 2.%), l abondance relative des ions diagnostiques (dans les tolérances admises) et le rapport signalbruit (supérieur à 3 sur l ion fille le moins abondant) sont satisfaits dans % pour toutes les molécules..2. Validation complémentaire : viande de bœuf En ce qui concerne le respect des critères d identification, sur les 2 échantillons de viande de bœuf enrichis à la MRL, il a été démontré que les critères d identification basés sur le temps de rétention relatif (tolérance de ± 2.%), l abondance relative des ions diagnostiques (dans les tolérances admises) et le rapport signalbruit (supérieur à 3 sur l ion fille le moins abondant) sont satisfaits dans % des cas pour toutes les molécules..3. Validation complémentaire : viande de volaille En ce qui concerne le respect des critères d identification, sur les 2 échantillons de viande de volaille enrichis à la MRL, il a été démontré que les critères d identification basés sur le temps de rétention relatif (tolérance de ± 2.%), l abondance relative des ions diagnostiques (dans les tolérances admises) et le rapport signalbruit (supérieur à 3 sur l ion fille le moins abondant) sont satisfaits dans % des cas pour toutes les molécules.. Sélectivité et spécificité Sélectivité L analyse des tétracyclines est sélective, car elle se fait par LCMS/MS. Elle est donc basée sur des critères scientifiques fiables tels que le temps de rétention relatif, les ions diagnostiques et les abondances ioniques relatives. Aucune perturbation n est possible avec les molécules parents ni avec des molécules de même masse initiale, puisque les ions diagnostiques obtenus n ont pas les mêmes masses.
12 DOC 22/F/7 (porc, bœuf, volaille) par LCMS/MS P. : 2/2 Les tétracyclines et leurs épimères respectifs étant des stéréoisomères, leur masse initiale ainsi que celle des ions diagnostiques est identique. Par contre, leur temps de rétention est différent car l encombrement stérique de la molécule principale est différent de celui de l épimère. Le temps de rétention de l épimère est toujours inférieur à celui de la molécule principale. Spécificité La spécificité est démontrée par l absence de pics aux temps de rétention des analytes dans des échantillons extraits «à blanc», c estàdire non fortifiés. L analyse des tétracyclines est spécifique. 2. Stabilité Il n existe pas de données sur la stabilité des tétracyclines dans des échantillons naturellement enrichis. Les échantillons sont par conséquent stockés à 8 C dans l attente d être analysés. 3. Conclusions et accréditation Au vu des résultats présentés, on peut conclure : Conclusion générale : On peut considérer les 7 tétracyclines faisant l objet de la présente validation comme étant accréditées dans la viande (porc, bœuf & volaille). Références SOP 22/F/7 Décision de la commission 22/67/CE, J. Off. Com. Europ., L 22/8 du 7 août 22 Directive de la commission 96/23/CE, J. Off. Com. Europ., L 2 du 23 mai 996 Document BELAC 2 Rev 26 Règlement de la Commission Européenne 37/2, du 22/2/29.
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