Projet Industriel. Master d ingénierie pour la santé et le médicament, option développement et production pharmaceutique

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1 Projet Industriel DEVELOPPEMENT DES FORMES ORALES DE PROBIOTIQUES Réalisé par : Sawssen Bousbiaa & Nicolas Schneider Responsable : Stéphanie Briançon Master d ingénierie pour la santé et le médicament, option développement et production pharmaceutique Année universitaire

2 Remerciements Nous tenons à remercier Stéphanie Briançon pour ses conseils et son suivi au cours de l élaboration de notre projet, ainsi que les industriels et l attention qu ils portent aux étudiants de l IPIL et à leurs projets. Merci également à Patrice Sebert et à Aziz Bakri pour leur encadrement et l attention portée aux étudiants au cours de cette année de Master. Développement des formes orales des probiotiques Page 2

3 Sommaire Introduction p Écosystème gastro-intestinal : composition et évolution p La microflore intestinale p. 7 I. Définition p. 9 II. Historique p. 9 III. Les principaux probiotiques p Les ferments lactiques p Les bifidobactéries p Les différentes levures de type Saccharomyces p Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus p. 11 IV. Une efficacité sous conditions p Innocuité totale p Survie au cours du transit digestif p Origine humaine p Activité antimicrobienne p Adhésion à la muqueuse intestinale/survie dans l'écosystème intestinal p Propriétés technologiques : viabilité et stabilité des micro-organismes p. 13 V. Evaluation de la souche, tests in vivo et in vitro p Désignation du Genre/Espèce/Souche p Dépistage des probiotiques potentiels par des tests in vitro p Innocuité de souches probiotiques p Études in vivo sur des animaux et humains p Allégations-santé et marque du produit p. 16 VI. Mode d action des probiotiques p. 16 VII. L intérêt thérapeutique des probiotiques p Stimulation du système immunitaire p Allergie p Inhibition des bactéries pathogènes p Neutralisation des toxiques p Traitement des diarrhées p Effet sur la constipation p Amélioration de la digestibilité p Intolérance au lactose p Troubles de l appareil génito-urinaire p Probiotiques et système porte hépatique p Maladies cardiovasculaires p Activité anti cancérigène p Utilisation des probiotiques chez des sujets par ailleurs sains p. 22 Développement des formes orales des probiotiques Page 3

4 VIII. L intérêt nutritionnel des probiotiques p. 23 IX. Méthodes d essai visant à établir les intérêts bénéfiques des probiotiques sur la santé p. 25 X. Prébiotiques p. 26 XI. Les symbiotiques p. 28 XII. Aspects relatifs à la sécurité sanitaire p. 28 XIII. Spécifications d un produit probiotique, assurance de qualité et questions de réglementation p Réglementation p Avis de l AFFSSA p. 30 XIV. Le processus de fabrication des probiotiques p. 31 XV. Cas d un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique p Réactivation p Préparation du pied de cuve p Préparation et stérilisation des milieux p. 36 a. Milieu simplifié p. 36 b. Milieu enrichi p Ensemencement et culture p. 37 a. Milieu simplifié p. 37 b. Milieu enrichi p Préparation de la culture pour lyophilisation p. 37 a. milieu simplifié constituants p. 37 b. Milieu enrichi constituants p Lyophilisation p Broyage p mélange p conditionnement p. 38 Conclusion p. 40 Références p. 41 Annexe p. 43 Développement des formes orales des probiotiques Page 4

5 Table des matières Figure 1 : Schéma d'une plaque de Peyer Figure 2 : Les différents rôles et effets de la flore intestinale Figure 3 :Vue générale sur la microflore du colon humain. Adapté de Gibson & Roberfroid (1995) Figure 4 : Pourcentage de récupération de probiotiques vivants dans les selles après leur ingestion Figure 5 : Propriétés et critères de sélection des probiotiques. Adapté de Salminen et al. (1998) Figure 6 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté de Mercenier et al. (2002) Figure 7 : Mécanisme d action sur l système immunitaire Figure 8 : Procédé de production Développement des formes orales des probiotiques Page 5

6 Introduction 1. Écosystème gastro-intestinal : composition et évolution La flore intestinale constitue un écosystème fragile. Différents facteurs peuvent l affecter : une alimentation déséquilibrée, le stress et le surmenage, le vieillissement, certaines maladies, certains médicaments Un déséquilibre de la flore intestinale peut conduire à certains désordres : baisse de forme, manque d entrain, troubles de la digestion, sensibilité accrue aux infections, D où l intérêt d un apport quotidien en probiotiques pour maintenir l équilibre de la flore intestinale, aider l organisme à mieux se défendre et maintenir un état de santé optimal. Intestin : de la digestion à l'immunité Figure 1 : Schéma d'une plaque de Peyer L intestin est un organe dont le rôle et l influence dépasse la seule fonction de digestion des aliments. Il concentre des structures nerveuses complexes et participe activement à la protection de l organisme. Un «filtre» entre l organisme et le milieu extérieur: L'intestin assure une première fonction vitale: la digestion des aliments et l absorption des nutriments indispensables au fonctionnement de l organisme. Pour faciliter ce processus il offre une surface très importante (300 mètres carrés, équivalant à la surface d un court de tennis!) en contact avec le milieu extérieur, via l alimentation. Intestin : un second cerveau Des travaux récents ont montré que 100 millions de neurones tapissent notre système digestif et sont en connexion avec le système nerveux dans son ensemble. Il fabrique 20 neurotransmetteurs, dont la sérotonine indispensable à notre sérénité. L intestin et son fonctionnement sont donc très influencés par nos émotions. Intestin : la défense de l organisme Si c'est au travers de sa muqueuse que les nutriments digérés passent dans le sang, l intestin doit en revanche arrêter les microbes pathogènes, virus et autres substances toxiques. Plus que les poumons ou la peau, l intestin est la principale porte d entrée des microbes venant de l extérieur. Aussi est-il doté d un système de défense très élaboré qui protège l ensemble de l organisme de ces agressions extérieures. Le système immunitaire intestinal, appelé GALT, pour «Gut Associated Lymphoid Tissue» : Il concentre à lui seul 70% des cellules lymphoïdes de l organisme. Ces cellules sont spécialisées dans la lutte et l élimination des agents pathogènes. Le système immunitaire intestinal, le GALT, fait partie du MALT (Mucous Associated Lymphoid Tissue), le système immunitaire de toutes les muqueuses étant en relation avec tout Développement des formes orales des probiotiques Page 6

7 l appareil lymphatique. Ainsi, une fois «activé», il serait capable d alerter ces autres structures immunitaires de l organisme. Cette fonction est déjà utilisée par des médicaments à usage oral destinés à combattre les affections des voies respiratoires en stimulant l'immunité contre les bactéries responsables de ces infections. La stimulation immunitaire se fait via les récepteurs intestinaux : les follicules lymphoïdes et les plaques de Peyer, contenant, bien séparés, des lymphocytes T et B. Là où siègent ces plaques, la muqueuse est amincie. Tout se passe comme si l intestin privilégiait l entrée passive de ces substances, pour pouvoir mieux les connaître et en rendre compte. Le fonctionnement optimal du système immunitaire se situe entre infections et allergies. Insuffisant, il ne s oppose pas assez efficacement à la pénétration des micro-organismes et de leurs toxines; excessif, il induit des réactions d hypersensibilité : soit réactions allergiques (allergies digestives), soit intolérances digestives (maladie cœliaque), soit emballement du système immunitaire (maladie de Crohn, entérocolites auto-immunes etc.). Le mucus Le mucus, secrété par des cellules spécialisées de la muqueuse intestinale, qui a pour fonction de «piéger» les corps étrangers [1] 2. La microflore intestinale La flore intestinale contient plus de bactéries que le nombre de cellules dans notre corps. Son poids est évalué entre 1 et 2kg. D un intestin fonctionnel dépendent donc en partie la protection et la bonne santé de l organisme. FONCTIONS ET EFFETS Modification du contenu - Alcalinisation du contenu luminal - Abaissement du potentiel d oxydo-réduction LES DIFFÉRENTS RÔLES ET EFFETS DE LA FLORE INTESTINALE Modification des fonctions coliques - Augmentation de l absorption hydro-sodée - Stimulation de la motricité intestinale Digestion - absorption des nutriments - Hydrolyse des amidons complexes et des fibres alimentaires - Hydrolyse des protéines peu digestibles - Hydrolyse des lipides Production - Acides gras volatils : ac. acétique, butyrique, propionique - Gaz : CO 2, H 2, méthane, ammoniaque - Acide folique et vitamine K Transformations - Déconjugaison des sels biliaires - Déshydroxylation des sels biliaires Actions sur les xénobiotiques Glycosides cardiotoniques, imipramides, certains antibiotiques SITE PRÉFÉRENTIEL Grêle, colon Colon Colon droit Colon droit et transverse Colon gauche Colon gauche Colon droit Colon droit et gauche Grêle et colon droit Grêle et colon droit Grêle et colon droit Colon Figure 2 : Les différents rôles et effets de la flore intestinale Développement des formes orales des probiotiques Page 7

8 La flore intestinale est l ensemble des bactéries (environ milliards de 400 espèces différentes), qui cohabitent dans nos intestins. Se constituant après la naissance, elle comporte à peu près toujours les mêmes types de bactéries : bactéroïdes, lactobacilles, eubactéries, bifidobactéries, peptostreptococques, ruminococques, clostridies. Parmi ces bactéries, la plupart sont inoffensives ou bénéfiques à l organisme, comme cela est admis pour les bifidobactéries. D autres sont potentiellement pathogènes, mais trop peu nombreuses par rapport aux bactéries «amies» pour agir. C est par exemple le cas des Clostridium difficile ou Escherichia coli, qui habitent naturellement dans nos intestins. Elles sont toxiques, mais inoffensives tant que leur nombre reste inférieur aux autres bactéries. Elles composent la flore «sous-dominante» En produisant de l acide lactique, les bactéries bénéfiques rendent le milieu intestinal réfractaire aux pathogènes. Ainsi, la flore «dominante» garde le contrôle de la flore «sous-dominante». Bien sûr, depuis l extérieur, notamment par l alimentation, parviennent chaque jour aux intestins d autres micro-organismes : il s agit de la flore «de passage», qui comme son nom l'indique, ne s'implante pas dans le tube digestif. Potentiellement pathogènes, les germes qui la composent sont rendus inoffensifs par la présence de la flore dominante. En résumé, la flore intestinale est composée : - d une flore dominante composée de Bifidobacterium et Bacteroïdes. (99 % des bactéries) - d une flore sous-dominante composée en particulier de Lactobacillus (1 % des bactéries) - d une flore de passage ou fluctuante (<1 % des bactéries) [2] Figure 3 :Vue générale sur la microflore du colon humain. Adapté de Gibson & Roberfroid (1995) Développement des formes orales des probiotiques Page 8

9 I. Définition d un probiotique Le terme de probiotique, dérivé du grec, signifie "pour la vie", par opposition aux "antibiotiques". Il a été proposé en 1974 pour désigner les souches microbiennes utilisées en alimentation animale pour contrer les effets négatifs des antibiotiques et renforcer leur efficacité. Par bactérie ou souche probiotique, on entend une souche qui ingérée vivante, exerce un effet bénéfique sur l'hôte en ayant une action sur l'équilibre de la flore intestinale et/ou sur le système immunitaire intestinal. Ces souches probiotiques ont la capacité de survivre au passage à travers la partie supérieure du tube digestif. Elles sont non pathogènes, non toxiques et exercent une action bénéfique pour la santé, d'une part via les interactions écologiques avec la flore résidente du tube digestif et d'autre part via leur capacité à influencer le système immunitaire de manière positive sur le «GALT» (tissu immunitaire associé à l'intestin). Selon la définition des probiotiques, ces bactéries lorsqu'elles sont données en nombre suffisant ont la capacité de traverser vivante tout l'intestin. Elles font alors parties de la flore résidente pendant la période d'administration. II. Historique La notion de '' probiotiques'' a été développée grâce aux travaux de Metchnikoff (1907) qui avait constaté que les paysans bulgares, grands consommateurs de laits fermentés, vivaient très vieux et en bonne santé. Ainsi, Metchnikoff avait proposé l ingestion de bactéries vivantes, particulièrement des bactéries lactiques, pour réduire les désordres intestinaux et améliorer l hygiène digestive, et donc augmenter l espérance de vie (Gournier-Château et al. 1994). Le terme probiotique a été introduit pour la première fois par Lilly et Stillwell (1965) pour décrire des substances produites par un microorganisme et stimulant la croissance d autres microorganismes. Depuis, plusieurs définitions ont été données aux probiotiques dépendamment de leurs effets sur la santé. Selon Parker (1974), «probiotiques» désigne les microorganismes et les substances qui contribuent au maintien de l équilibre de la flore intestinale. Cette définition englobant les microorganismes et les métabolites microbiens produits (les antibiotiques), a été modifiée par Fuller (1989) qui redéfinit les probiotiques comme étant : ''des préparations microbiennes vivantes utilisées comme additif alimentaire et qui ont une action bénéfique sur l'animal hôte en améliorant la digestion et l'hygiène intestinale''. Enfin, selon la définition adoptée par le groupe de travail mixte formé par l Organisation des Nations Unies (ONU) pour l agriculture et l alimentation et l Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) (Report of FAO/WHO, 2002), les probiotiques sont «des microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui sont bénéfiques pour la santé de l hôte». [3] Développement des formes orales des probiotiques Page 9

10 III. Les principaux probiotiques 1. Les ferments lactiques Ils sont capables de produire de l acide lactique par la fermentation de certains sucres comme le lactose. Ils sont regroupés en 2 catégories, en fonction de leur morphologie : les lactobacilles (Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus caséi) et les coques (Enterococcus et Streptococcus). 2. Les bifidobactéries D origine humaine ou animale, elles appartiennent à la flore intestinale normale et possèdent une bonne résistance aux sucs gastriques. La population de Bifidobactérium diminue avec l âge et leurs espèces varient selon l âge. 3. Les différentes levures de type Saccharomyces Elles sont principalement utilisées par l industrie agroalimentaire. La levure de bière active (ou «vivante») est également un probiotique. Elle est constituée d'une colonie de champignons microscopiques, généralement de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de la souche boulardii, communément appelée levure boulardii. Développement des formes orales des probiotiques Page 10

11 4. Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus. Les genres bactériens les plus utilisés sont Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L. plantarum, Enterococcus faecium et Saccharomyces. Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Bifidobacterium ou Bifidus Développement des formes orales des probiotiques Page 11

12 IV. Une efficacité sous conditions Toutes les souches de bactéries ne peuvent être considérées probiotiques. Selon le consensus scientifique aujourd hui accepté, un micro-organisme probiotique doit remplir les conditions suivantes : 1. Innocuité totale Ce critère semble évident, mais il est important de le vérifier surtout si le choix de la bactérie administrée n'appartient pas à la microflore normale de l'hôte. Les bactéries lactiques (lactobacilles et bifidobactéries) qui sont utilisées pour la conservation des aliments ont fait la preuve de leur innocuité. Il n'en est pas de même pour les germes du genre Enterococcus par exemple. 2. Survie au cours du transit digestif La capacité de survie au cours du transit intestinal est très variable entre genres et entre souches. Certaines bactéries sont détruites dès leur passage dans l'estomac. Parmi les lactobacilles utilisés par l'industrie laitière pour la fabrication des laits fermentés et yaourts, un grand nombre ne survivent pas à l'environnement acide de l'estomac et ne répondent donc pas totalement à la définition des probiotiques. C'est le cas par exemple de L.bulgaricus et S.thermophilus. pour qu une souche probiotique soit efficace et capable de survivre au cours du transit intestinale, elle doit résister suffisamment aux acides gastriques et aux sels biliaires de façon à arriver vivants sur leur lieu d action : l intestin. Les souches humaines naturellement adaptées à notre environnement digestif résisteront mieux. De plus, un enrobage résistant au suc gastrique permettra aux souches d accroître cette résistance. Germe % survie Bifidobacteria sp 30 B.lactis Bb12 30 L.plantarum NCIB L.acidophilus 2-5 L.rhamnosus (souche GG) 1-5 L.reuteri capsule 0.01 Figure 4 : Pourcentage de récupération de probiotiques vivants dans les selles après leur ingestion Développement des formes orales des probiotiques Page 12

13 3. Origine humaine Elle fait encore l'objet de nombreuses discussions parmi les scientifiques. Les bactéries, comme n'importe quels autres êtres vivants, sont bien adaptées à leur environnement spécifique. Les cultures lactiques, par exemple, connaissent une croissance optimale à une température comprise entre 40 et 42 C, ne résistent pas au passage dans l'estomac, sont tuées par les sels biliaires, et sont incapables de s'établir dans le tube digestif. A l'opposé, les souches d'origine humaine poussent à 37 C, sont résistantes aux acides et aux sels biliaires, et en général peuvent s'établir au moins transitoirement dans l'intestin humain. Il a également été démontré que la muqueuse intestinale et sa microflore partagent des épitopes antigéniques communs, sans doute responsables de la tolérance immunologique de l'hôte vis-à-vis de ses bactéries résidentes. Toutes ces raisons parlent donc en faveur d'une origine humaine comme facteur favorable pour une souche probiotique. A noter toutefois que l'origine humaine d'une souche peut être difficile à établir en toute certitude. 4. Activité antimicrobienne Pour jouer leur rôle d'amélioration de l'hygiène intestinale, un bon probiotique doit être capable d'inhiber le développement des germes indésirables. Sans pour autant garantir leur efficacité in vivo, un premier critère de sélection doit donc être l'activité antimicrobienne in vitro, mesurée par des "challenge tests" au laboratoire. 5. Adhésion à la muqueuse intestinale/survie dans l'écosystème intestinal Il semble a priori intéressant que les souches probiotiques puissent adhérer aux cellules de la paroi intestinale, d'une part pour faciliter la colonisation du tube digestif par le probiotique, et d'autre part pour obtenir un effet "barrière" optimal contre l'invasion de la muqueuse intestinale par des bactéries pathogènes. 6. Propriétés technologiques : viabilité et stabilité des micro-organismes C'est un des critères les plus importants, car nombre de souches qui possèdent des propriétés probiotiques intéressantes dans un produit laitier "frais" (durée de conservation de 3 semaines environ) ne survivent pas aux durées de conservation nécessaires aux poudres de lait. La stabilité des micro-organismes est influencée par les conditions de stockage : température (au-delà de 60 C, la plupart d'entre eux ne résistent pas), humidité. Aussi le concept de probiotique fait appel à ces notions importantes : - être introduit par voie orale. - être un habitant naturel de l intestin. - être capable de coloniser le milieu intestinal, persister et se multiplier. - non invasif, non carcinogène et non pathogène. - être capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée. Dans toutes les définitions prononcées, la notion de viabilité apparaît comme un critère de sélection important. Cependant, cette notion demeure très controversée puisque des études récentes, ont clairement démontré que même les souches non viables de probiotiques sont capables d exercer des effets positifs sur la santé entre autres la stimulation de certaines fonctions immunitaires, l inhibition de l adhésion et l invasion de certains pathogènes. Ceci laisserait donc envisager une éventuelle redéfinition des probiotiques où la notion de viabilité sera à reconsidérer. [4] Développement des formes orales des probiotiques Page 13

14 Figure 5 : Propriétés et critères de sélection des probiotiques. Adapté de Salminen et al. (1998) Développement des formes orales des probiotiques Page 14

15 V. Evaluation de la souche, tests in vivo et in vitro : Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l espèce ou la souche microbienne. Le choix des probiotiques dépend de ces propriétés et du type d utilisation. Selon le rapport de la FAO/WHO (2002), pour qu un produit soit reconnu comme étant probiotique, une évaluation du produit basée sur plusieurs critères doit être effectuée suivant les recommandations suivantes : 1. Désignation du Genre/Espèce/Souche : il est nécessaire de connaître le genre et l espèce de la souche utilisée, car les effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne. Le probiotique doit porter un nom reconnu scientifiquement et son identification doit être effectuée à l aide de méthodes récentes et valides combinant les tests phénotypiques et génotypiques. 2. Dépistage des probiotiques potentiels par des tests in vitro : Les tests in vitro sont réalisés afin de déterminer les mécanismes par lesquels les microorganismes probiotiques exercent leurs effets bénéfiques. Il est recommandé d utiliser des tests spécifiques à la cible et appropriés pouvant corréler avec les résultats des essais in vivo. Les principaux tests in vitro réalisés pour étudier les probiotiques sont : - Résistance à l acidité gastrique - Résistance aux acides biliaires - Adhérence au mucus et/ou cellules épithéliales humaines - Activité antimicrobienne contre les bactéries potentiellement pathogènes - Capacité de réduire l adhésion des pathogènes aux surfaces - Activité de l hydrolase sur les sels biliaires (dissociation des sels biliaires) - Résistance aux spermicides (application vaginale des probiotiques) 3. Innocuité de souches probiotiques : Les probiotiques utilisés dans les produits pharmaceutiques sont des microorganismes appartenant à la flore normale intestinale. Cependant, l innocuité de la souche microbienne doit être prouvée avant toute utilisation du probiotique dans le médicament. En théorie, des effets secondaires peuvent être associés à la consommation de produits contenant certaines souches probiotiques. Ces effets secondaires se résument-en : - Infections systémiques - Activités métaboliques délétères - Stimulation immunitaire excessive chez des personnes sensibles - Transfert de gènes entre les espèces bactériennes probiotiques et celles de la flore intestinale. 4. Études in vivo sur des animaux et humains : Afin de confirmer ou valider les résultats des tests in vitro, il serait nécessaire de réaliser des essais in vivo sur des animaux de laboratoire ou, de préférence, sur des sujets humains dans des conditions expérimentales appropriées. En général, une méthode standard d évaluation clinique des probiotiques comprend les phases suivantes: - Phase 1 : consistant à évaluer l innocuité de la souche probiotique. - Phase 2 : permet d étudier l efficacité d un probiotique par comparaison à un placebo. - Phase 3 : permet de comparer des probiotiques avec un traitement standard. - Phase 4 : consisterait à surveiller l utilisation du probiotique. Développement des formes orales des probiotiques Page 15

16 5. Allégations-santé et marque du produit : La mention d allégations-santé générales est actuellement autorisée sur les produits contenant des probiotiques dans certains pays comme les Etats-Unis, Angleterre, etc. Il est cependant recommandé de mentionner sur les produits les allégations spécifiques lorsque des données scientifiques sont disponibles. Par exemple, mentionner «réduit l incidence et la sévérité des diarrhées à rotavirus chez les enfants» au lieu de «améliore la santé de l intestin». La marque (étiquette) doit porter : Genre/espèce/souche, nombre minimal de cellules viables, allégation santé, conditions de stockage, etc. En plus de l innocuité et des propriétés fonctionnelles, des critères technologiques sont également pris en considération dans la sélection des souches probiotiques. Ces critères sont : - Bonnes propriétés sensorielles - Résistance aux phages - Viabilité durant le traitement technologique - Stabilité dans le produit et durant le stockage. Contrairement au Lactobacillus acidophilus, les souches de Bifidobacterium utilisées commercialement ne survivent pas au ph gastrique ni à l acidité de l aliment durant le stockage. Pour augmenter leur taux de survie, les probiotiques doivent être ingérés pendant le repas, ou bien protégés dans des capsules ou par microencapsulation. Le choix des vecteurs dans lesquels ou par lesquels sont ingérés les probiotiques est aussi important. Par exemple le taux de survie de Lactobacillus strain GG est variable lorsqu il est ingéré dans les comprimés, les capsules de gélatine, les laits fermentés ou les boissons à base de lactosérum. [5,6] VI. Mode d action des probiotiques Les probiotiques peuvent être considérés comme un moyen de véhiculer des principes actifs qu'ils contiennent (enzymes, composants de paroi, peptides immunomodulateurs, substances antibactériennes ) jusqu'à leurs cibles d'action dans le tractus digestif. Ils peuvent avoir des effets soit directs soit indirects en agissant via des modifications de l immunité et de la flore. Ils agissent en particulier en inhibant les bactéries indésirables, en neutralisant les produits toxiques, en améliorant la digestibilité de la ration alimentaire et en stimulant l immunité. Ils sont également une source de vitamines (essentiellement du groupe B), et de sels minéraux assimilables. Les probiotiques agissent par trois principaux mécanismes. Le premier consiste à moduler l activité du système immunitaire intestinal. Ils améliorent l immunité lorsqu elle est faible, par exemple au moment du développement du système immunitaire chez l enfant ou de son vieillissement chez les personnes âgées. Ils diminuent également la suractivation du système immunitaire, notamment dans les cas d allergies ou de maladies inflammatoires de l intestin. En second lieu, les probiotiques augmentent la fonction de barrière de la muqueuse intestinale, par exemple en accentuant la production de mucus ou des anticorps de type IgA. Finalement, les probiotiques ont des effets antimicrobiens directs, principalement en inhibant l invasion des bactéries pathogènes et leur adhésion aux parois intestinales Développement des formes orales des probiotiques Page 16

17 VII. L intérêt thérapeutique des probiotiques Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des probiotiques. Il est à noter que la validité scientifique de ces effets bénéfiques est très variable. Pour certains effets, des preuves scientifiques irréfutables appuyées par des études cliniques existent et permettent d attribuer certaines allégations-santé aux produits probiotiques. Pour d autres, les allégations demeurent encore à un stade hypothétique et des études plus approfondies demeurent nécessaires pour apporter des preuves scientifiques convaincantes à ces allégations. 1. Stimulation du système immunitaire Les bactéries probiotiques auraient une action stimulante sur le système immunitaire de l hôte en agissant sur les cellules impliquées soit dans l immunité soit dans l immunité spécifique. - Ils ont un effet sur les cellules immunitaires impliquées dans des mécanismes de défense non spécifique : La phagocytose réalisée essentiellement par les macrophages est le principal mécanisme de défense immunitaire non spécifique de l organisme.en réponse à la pénétration d une substance étrangère. L état d activation des macrophages est donc une mesure de la réponse immunitaire naturelle de l hôte. Les probiotiques stimuleraient l activation des macrophages et différents auteurs ont mis en évidence cette activation des macrophages par des bactéries lactiques. La souche de Lb.casei agit sur le système immunitaire non spécifique en activant les macrophages. Actuellement les mécanismes par lesquels les bactéries lactiques activent les macrophages sont encore inconnus. Mais il est certain que seules les bactéries capables de survivre et de se développer dans le tractus gastro-intestinal sont efficaces sur l activation des macrophages. - Ils ont un effet sur les cellules impliquées dans les mécanismes de réponse immunitaire spécifique : Le système immunitaire spécifique comprend en fait deux systèmes : - l un agit par l intermédiaire des anticorps sécrétés par l es lymphocytes B ; c est l immunité humorale. - l autre agit par l intermédiaire direct des lymphocytes T ; immunité à médiation cellulaire. Les deux systèmes communiquent entre eux par l intermédiaire de substances chimiques telles les interleukines (Il). L augmentation de la réponse immunitaire spécifique se traduit par une activation des lymphocytes T et B, provoquant une augmentation du taux d interleukines et des anticorps circulants (IgM et IgG). Perdigon et all. ont mis en évidence une activation du système immunitaire spécifique en réponse à une infection par Salmonella Typhimurium, de souris nourries avec des laits fermentés, durant 8 jours précédant leur infection. Chez les souris traitées avec le lait fermenté contenant Lb.casei et Lb.acidophilus, le taux de survie est de 100 % et la colonisation du foie et de la rate par la souche pathogène est fortement diminuée. Développement des formes orales des probiotiques Page 17

18 Chez les souris témoins ou encore les souris traitées soit avec Lb.casei soit Lb. Acidophilus, le taux de survie est beaucoup plus faible.(20%) De plus, les plus forts taux d anticorps anti-salmonelle sont retrouvés chez les souris nourries avec le lait fermenté contenant les souches de Lactobacillus. Le traitement avec l une ou l autre des souches s est révélé curatif mais non préventif. Ces résultats suggèrent que les 2 souches agissent en activant le système immunitaire spécifique de la muqueuse intestinale de l hôte. Leur action serait synergique. Aussi, Bifidobacterium breve activeraient les cellules de type macrophage ; en effet celles-ci secrèteraient une fois activée, un facteur soluble stimulant la prolifération des lymphocytes B. [7] Exemples : Prévenir l eczéma atopique chez les enfants à risque Au cours d un essai à double insu avec placebo, on a sélectionné 132 femmes enceintes ayant des antécédents familiaux (ou un conjoint atteint) d eczéma atopique, de rhinite allergique ou d asthme. Ces mères ont pris soit un placebo, soit une formule à base de Lactobacillus GG durant leur grossesse, ainsi que leurs bébés durant les premiers six mois de leur vie. À l âge de deux ans, l incidence d eczéma atopique était deux fois moins élevée chez les bébés traités aux lactobacilles que chez ceux du groupe placebo 44. De plus, à l âge de quatre ans, les enfants du groupe traité bénéficiaient toujours de la même protection par rapport à ceux du groupe placebo Allergie Dans un essai randomisé et contrôlé à double insu contre placebo, on a administré L. rhamnosus GG à des femmes enceintes pendant quatre semaines avant l accouchement, puis à des nourrissons à haut risque d allergie pendant six mois, ce qui a entraîné une réduction importante de la maladie atopique précoce Cette étude illustre le potentiel des microorganismes probiotiques de moduler la réponse immunitaire et d empêcher l apparition d allergies. Dans d autres études cliniques sur des nourrissons allergiques au lait de vache, la dermatite atopique a été soulagée grâce à l ingestion de souches probiotiques. Les mécanismes précis n ont pas été élucidés, mais l on s appuie sur la capacité des lactobacilles de neutraliser l augmentation de la perméabilité intestinale, de renforcer les réponses des IgA spécifiques de l intestin, d encourager la fonction de barrière des intestins par le rétablissement de microbes normaux, et de renforcer la transformation du facteur de croissance bêta et la production d interleukine 10 ainsi que des cytokines qui favorisent la production d anticorps IgE (Kalliomaki et al., 2001; Isolauri, 2001). Il reste encore à déterminer si le lymphocyte T1 auxiliaire est renforcé et/ou si la domination du lymphocyte T2 auxiliaire est réduite. [8] 3 Inhibition des bactéries pathogènes La production d acides organiques à partir des glucides de la ration alimentaire, tels que l acide lactique ou l acide acétique limite en abaissant le ph, le développement des Esherichia coli et des salmonelles. Les souches probiotiques pourraient également réprimer la croissance de bactéries pathogènes par production de substances antimicrobiennes de type bactériocine, capables d'éliminer les germes fréquemment responsables d infection en élevage. Certaines souches possèdent également la capacité de déconjuguer les sels biliaires ; ces formes déconjuguées ont un pouvoir inhibiteur important sur le développement des bactéries. Les souches probiotiques pourraient également agir en inhibant l implantation des germes pathogènes par compétition pour la colonisation, par inhibition compétitive. Exemple : Probiotiques et ulcères hépatiques, Troubles de l appareil génito-urinaire Les ulcères hépatiques, ou peptiques, sont un petit trou ou une érosion dans le système gastro-intestinal. La plupart des ulcères hépatiques sont causés par la bactérie Helicobacter pylori ; certaines études ont montré que des probiotiques avaient des effets bénéfiques contre ce type de bactérie. Des chercheurs ont utilisé de l acide acétique pour provoquer des ulcères chez des rats. Les animaux ont ensuite reçu pendant trois jours par voie intra-gastrique du L. rhamnosus GG. Les observations ont montré que les probiotiques colonisaient avec succès la paroi de l estomac, plus particulièrement autour de l ulcère. Une étude mécanistique a suggéré que les probiotiques influencent l expression de protéines dans les cellules de la paroi hépatique, accroissant ainsi la formation de nouvelles cellules sanguines et accélérant la guérison de l ulcère. Développement des formes orales des probiotiques Page 18

19 4 Neutralisation des toxiques Les probiotiques provoqueraient une orientation de la microflore intestinale pour réduire l absorption de substances toxiques telles l ammoniac, les indoles... et diminuer les biotransformations de sels biliaires ou acides gras en produits toxiques. Ces micro-organismes auraient aussi la capacité de produire des métabolites susceptibles de neutraliser in situ certaines toxines bactériennes. 5 Traitement des diarrhées Traitements des diarrhées infantiles : L administration de Lactobacillus casei ou GG (souche d origine humaine), que ce soit sous forme lyophilisée ou sous forme de lait fermenté, permet de réduire la durée des diarrhées provoquées par des rotavirus chez les nourrissons. Traitement des diarrhées dites du voyageur : La souche de Lactobacillus GG est efficace en prévention des diarrhées survenant chez les touristes. L administration du probiotique durant la période à risque a permis de réduire l apparition des diarrhées de 39,5 % chez les sujets traités. Traitement de diarrhées consécutives à une antibiothérapie : Les traitements antibiotiques provoquent souvent l apparition de désordres intestinaux s accompagnant de diarrhées. Les préparations probiotiques contenant des bactéries lactiques sont proposées en traitement prophylaxiques des diarrhées consécutives à une antibiothérapie. Lactobacillus GG permet de traiter l apparition de diarrhées à Clostridium difficile consécutives à un traitement antibiotique. [9] 6 Effet sur la constipation La supplémentation de l alimentation avec des souches de Lactobacillus influence favorablement le transit digestif. Chez des individus hospitalisés depuis longtemps, les muscles abdominaux se relâchent causant souvent des problèmes de constipations. L administration de Lactobacillus acidophilus permet de réduire l utilisation des laxatifs. En effet, les laxatifs ont l inconvénient d éliminer, en plus du bol fécal, différentes substances essentielles comme les minéraux. L augmentation de la dose de probiotiques provoque l effet inverse : les patients sont à nouveau constipés et doivent être traités avec des laxatifs. L administration de yaourts contenant une souche de Lactobacillus acidophilus et des fibres de lactitol permet de réduire les problèmes de constipation chez les personnes âgées hospitalisées. Cet effet contre la constipation n a été obtenu qu avec des bactéries vivantes. Des effets bénéfiques sur les problèmes de constipation ont également été observés en utilisant des souches de Bifidobacterium comme probiotique. Développement des formes orales des probiotiques Page 19

20 7 Amélioration de la digestibilité La production d enzymes par les souches probiotiques serait une des possibilités pour favoriser la digestibilité de la ration alimentaire. Ainsi certaines bactéries probiotiques, notamment les Lactobacillus, excrètent la β-galactosidase souvent déficiente dans le tractus digestif de l hôte, facilitant ainsi la digestion du glucose. Exemple : Réduction du taux de cholestérol. Les résultats de quelques études portant sur le sujet sont arrivés à des résultats mitigés. Une récente étude slovaque à double insu avec placebo (43 patients) indique que la prise de probiotiques, en conjonction avec du sélénium, pourrait réduire le cholestérol sanguin total de 12 % après un an de traitement Intolérance au lactose L intolérance au lactose est provoquée par l absence de synthèse de la lactase ou β-galactosidase par les cellules en brosse de la surface épithéliale de l intestin. De ce fait, n étant pas assimilé, le lactose, principal glucide du lait, est responsable de troubles intestinaux chez les personnes déficientes en cette enzyme. Les bactéries lactiques produisent la β-galactosidase qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose : plus de 50 % du lactose du lait est utilisé par les Lactobacillus. L utilisation des bactéries lactiques comme probiotique facilite la digestibilité du lactose chez les personnes atteintes d intolérance. Des expériences ont été menées sur des sujets atteints d intolérance au lactose. Les patients recevaient une quantité égale de lactose contenu soit dans du yaourt, soit dans du lait ou de l eau. Le taux de lactose dans le côlon des sujets consommant les yaourts est réduit d un tiers par rapport à celui des autres groupes. De plus, ce groupe alimenté avec les yaourts souffre beaucoup moins de troubles intestinaux ; ceci suggère que la β- galactosidase excrétée par les micro-organismes présents dans le yaourt favorise la digestion du lactose chez les patients. L administration de yaourts contenant des cellules bactériennes vivantes et de yaourts chauffés montre que les meilleurs résultats sont obtenus avec les yaourts dont les ferments sont vivants. Les yaourts ou les laits fermentés avec des souches Bifidobacterium bifidum n améliorent pas significativement l assimilation du lactose chez les patients. Seules des souches de Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et Streptococcus thermophilus ont une action positive sur la digestion du lactose. [10] 9 Troubles de l appareil génito-urinaire A l exception des maladies sexuellement transmissibles, la quasi-totalité des infections du vagin et de la vessie sont dus à des microorganismes qui proviennent de l intestin. Il y a une forte corrélation entre la présence de commensaux, particulièrement de lactobacilles dans le vagin, et la santé, et une absence de ces microorganismes chez les patients souffrant d infections génito-urinaires. Le bouleversement de la flore vaginale normale est dû à des antibiotiques à large spectre, à des spermicides, à des hormones, à des substances alimentaires et à des facteurs non encore complètement compris. Quelques éléments prouvent que les microorganismes probiotiques ingérés comme aliments et les préparations topiques ont un rôle dans la prévention des troubles de l appareil génito-urinaire. Des critères ont été proposés pour la sélection de souches probiotiques efficaces (Reid et Bruce, 2001); ils devraient comprendre la vérification de la sécurité, l aptitude à la colonisation dans le vagin et la capacité de réduire le nombre des agents pathogènes moyennant l'exclusion compétitive de l'adhérence et l inhibition de la croissance des agents pathogènes. [11] Développement des formes orales des probiotiques Page 20

21 10 Probiotiques et système porte hépatique Le système porte hépatique est le système sanguin situé au niveau du foie. Des observations ont été faites sur un patient : l homme âgé de 76 ans est atteint d une cirrhose et de varices œsophagiennes. Il est traité avec de fortes concentrations de probiotiques (6 g/j de lactobactéries à 1011 bactéries/g) pendant 1 mois. On y retrouve du Streptococcus thermophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, et Streptococcus faecium. Après un mois de repos, l homme reprend un autre mois de traitement. À la fin du premier mois de traitement, la vitesse et le flux sanguins au niveau de la veine porte hépatique étaient augmentés, mais après le mois de répit, les valeurs étaient revenues leurs niveaux antérieurs. Après le second cycle de traitement, la vitesse et le flux sanguins au niveau de la veine porte étaient augmentés par rapport aux valeurs initiales. Ces paramètres hémodynamiques de la circulation sanguine au niveau de la veine porte étaient étroitement liés aux changements de la composition de la flore digestive endogène. Les antibiotiques sont fréquemment administrés pour réduire la microflore digestive et limiter la production de médiateurs pouvant aboutir à une encéphalopathie hépatique, une hypertension portale et le saignement des varices oesophagiennes. Des infections bactériennes jouent un rôle dans les conséquences hémodynamiques qui arrivent chez des patients atteints d une cirrhose. On recommande une probiothérapie orale avec une forte concentration de probiotiques de façon à contrôler la pression portale. L avantage de la recolonisation du tube digestif par des lactobactéries pourrait être qu elle change favorablement l hémodynamique de la circulation portale sans pour autant aboutir à une résistance aux antibiotiques. [12] 11 Maladies cardiovasculaires Il a déjà été démontré que l emploi de lactobacilles probiotiques et des sous-produits du métabolisme a des effets bénéfiques sur le cœur, y compris pour la prévention et la thérapie de diverses cardiopathies ischémiques (Oxman et al., 2001) et abaisse le cholestérol sérique (De Roos et Katan, 2000). Bien que la Consultation estime que ces résultats sont importants, il est nécessaire de poursuivre les travaux de recherche et particulièrement les études sur l homme avant de pouvoir affirmer que les probiotiques exercent des effets bénéfiques sur l appareil cardiovasculaire. [13] 12 Activité anti cancérigène Les propriétés anticancérigènes de ces souches bactériennes peuvent être classées en deux catégories : la prévention de l initiation d un cancer et la suppression des cellules tumorales. Les souches lactiques agissent sur la prévention de l initiation d un cancer soit en détruisant des substances précancérigènes présentes dans l organisme telles que les nitrosamines, soit en inhibant des bactéries présentes dans le tractus digestif productrices d enzymes tells que la β- glucosidase, la β-glucuronidase, l azoréductase et la nitroréductase qui catalysent la conversion de substances précancérigènes en substances cancérigènes. Développement des formes orales des probiotiques Page 21

22 13 Utilisation des probiotiques chez des sujets par ailleurs sains De nombreux produits probiotiques sont utilisés par les consommateurs qui par ailleurs se considèrent en bonne santé. Ils le font en supposant que les probiotiques peuvent maintenir leur santé et leur bien-être et réduire les risques à long terme de maladies des intestins, des reins, des voies respiratoires et du cœur. Il y a lieu de faire plusieurs remarques sur cette hypothèse et ses implications. L emploi des probiotiques ne saurait remplacer des habitudes saines de vie quotidienne et une alimentation équilibrée chez des sujets par ailleurs sains. Chez le nouveau-né, là où la flore commensale n a pas encore été établie, il est possible que des microorganismes probiotiques deviennent des colonisateurs primaires qui subsistent longtemps, peut- être même toute la vie. Alors que l utilisation de probiotiques peut empêcher la mort et une morbidité grave chez les nouveau-nés présentant une insuffisance pondérale. A ce propos, une implication du Projet du génome humain est que les probiotiques choisis doivent être utilisés à la naissance pour créer une flore qui améliore la santé durant toute la vie. Ces questions sont très importantes pour l avenir et nécessiteront un ample débat comprenant des considérations morales. Figure 6 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté de Mercenier et al. (2002) Développement des formes orales des probiotiques Page 22

23 VIII. L intérêt nutritionnel des probiotiques : Les probiotiques les plus largement utilisés en alimentation humaine sont des préparations à base de Lactobacillus et Bifidobacterium. Toutefois il faut mettre l'accent sur le fait que toutes les souches, prises individuellement, n'ont pas ces effets mais seulement certaines d'entre-elles qui doivent être soigneusement sélectionnées. Afin de répondre aux exigences des industriels il est devenu nécessaire de trouver des souches ou mélange de souches qui soient performantes et qui permettent d atteindre l effet thérapeutique ou nutritionnel attendu Des bénéfices nutritionnels ont surtout été observés en utilisant des produits alimentaires fermentés par des souches de bactéries lactiques et particulièrement de Lactobacillus. La disponibilité des protéines est fonction de la quantité totale d acides aminés présents. La composition totale en acides aminés des yaourts et des laits fermentés ne diffère pas de celle du lait, mais il y a une grande quantité d acides aminés libres du fait d une hydrolyse partielle des protéines par les bactéries lactiques. Cependant les protéines du lait sont très digestibles et leur hydrolyse partielle dans les yaourts et les laits fermentés n améliore pas leur assimilation sauf chez les personnes malades qui présentent des déficiences pour certaines enzymes digestives. Aussi une meilleure qualité nutritionnelle des produits laitiers fermentés, du fait de la prédigestion des composants du lait par les enzymes protéolytiques et lipolytique des bactéries lactiques, a pu être observée. De plus, il semblerait que la disponibilité des minéraux comme le calcium, le zinc et le fer soit augmentée dans les produits laitiers fermentés par rapport au lait. Les Lactobacillus sont capables de synthétiser, dans certains cas, de la vitamine B : B1, B2, B9 Les produits fermentés contiennent donc une quantité élevée de vitamines et minéraux facilement assimilables par l organisme. Les Bifidobacterium agissent sur la digestion en modifiant la morphologie et la physiologie du tractus gastrointestinal en influençant la maturation et le renouvellement des entérocytes. Elles sont capables de synthétiser de nombreuses vitamines et acides aminés : l alanine, la thréonine, la valine. Ces différentes propriétés expliquent l utilisation de Bifidobacterium en tant que probiotique, car il améliore les bénéfices nutritionnels de l hôte. Développement des formes orales des probiotiques Page 23

24 Les yogourts ou produits laitiers fermentés ne renferment pas tous les mêmes ferments lactiques. De plus, sur leur étiquette, on ne précise pas toujours le type de ferments qu'ils contiennent. Les règlements concernant les produits laitiers fermentés varient d un pays à l autre. Au Québec, par exemple, l'appellation «yogourt» est réservée aux produits qui contiennent au moins deux espèces de bactéries, soit le Lactobacillus bulgaricus et le Streptococcus thermophilus. Le Bifidus, le Lactobacillus acidophilus et le Lactobacillus casei sont aussi employés par les fabricants de produits laitiers fermentés et, dans certains cas, l information apparaît sur l'étiquette. Cependant, la teneur en bactéries vivantes et actives des produits offerts sur le marché peut varier considérablement. Selon les experts européens, dans un yogourt, elle devrait être d au moins 107/g (10 millions/g) pour qu on puisse bénéficier de leurs vertus. Des tests publiés en 1997 et en 1999 indiquent que ce n'est pas toujours le cas. À noter que plus le yogourt est frais, moins il est acide et plus sa teneur en bactéries est élevée. Notez que certains yogourts sur le marché ne contiennent pas ou très peu de bactéries actives, soit parce qu ils ont été pasteurisés (comme c est le cas des yogourts en tube et de beaucoup de yogourts vendus aux États- Unis), soit parce qu ils ont été stabilisés avant d être mis en marché (c est le cas de nombreux yogourts brassés aux fruits). Développement des formes orales des probiotiques Page 24

25 IX. Méthodes d essai visant à établir les intérêts bénéfiques des probiotiques sur la santé Avant d entreprendre des essais in vivo, il faudrait conduire des études in vitro efficaces pour déterminer les effets bénéfiques potentiels des probiotiques sur la santé. Des essais, par exemple sur la tolérance à l acidité et à la bile, la production antimicrobienne et la capacité d adhérence aux cellules intestinales humaines devraient être effectués en fonction des effets bénéfiques sur la santé. Afin d établir qu un probiotique donné peut prévenir ou guérir une infection pathogène spécifique, une étude clinique doit être menée pour vérifier l exposition à dit agent pathogène (étude préventive) ou si le microorganisme infectieux est cet agent pathogène spécifique (étude de traitement). Si l objectif consiste à appliquer des probiotiques en général pour prévenir ou guérir un certain nombre de gastro-entérites infectieuses ou de troubles génito-urinaires, la conception de l étude doit définir le cadre clinique, les symptômes et les signes d infection et comprendre des contrôles appropriés. Pour les essais in vivo, il faudrait procéder à des essais cliniques randomisés et contrôlés à double insu contre placebo pour établir l efficacité du produit probiotique. La Consultation a reconnu qu il est nécessaire d entreprendre des études sur l homme auxquelles participeraient un nombre suffisant de sujets pour qu elles soient significatives sur le plan statistique. Il serait préférable que ces conclusions soient corroborées par plus d un centre indépendant. Pour certains aliments, il pourrait être difficile de faire la distinction entre un effet probiotique et un effet lié aux caractéristiques générales de l aliment. Par conséquent, il est essentiel que des contrôles bien faits soient inclus dans ces essais sur l homme. En outre, les données obtenues avec un aliment probiotique spécifique ne peuvent être extrapolées à d autres aliments concernant cette souche particulière ni à d autres microorganismes probiotiques. En ce qui concerne la mesure des effets positifs sur la santé dans les recherches effectuées sur l homme, il faudrait examiner les conclusions cliniques significatives dans la population étudiée. Pour les études sur la diarrhée, cela pourrait être la prévention des décès dans certains pays, alors que dans d autres cela pourrait être la prévention d une perte de poids définie, significative sur le plan statistique, la diminution de la durée des selles aqueuses/liquides, et un retour plus rapide à un bon état de santé, comme l indiquent le rétablissement du fonctionnement normal de l intestin et la consistance des selles. Bien que l on sache que certains probiotiques peuvent entraîner des effets bénéfiques, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires de ces effets. Les mécanismes peuvent varier d un probiotique à l autre (pour le même effet par différents moyens); la question est rendue complexe par le fait qu il peut s agir d une combinaison de mécanismes. Cela pourrait comprendre la production d un ou de plusieurs enzymes ou métabolites spécifiques qui agissent directement sur le(les) microorganisme(s), ou le probiotique pourrait aussi pousser le corps à produire l action bénéfique. Développement des formes orales des probiotiques Page 25