SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

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1 1/7 SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DS n 5 Épreuve de biologie 29 novembre 2014 Durée : 2 heures Le sujet comporte 2 parties indépendantes. Thème 1 Le candidat s appuiera essentiellement sur une analyse détaillée des documents pour construire un schéma bilan du contrôle de l expression du gène nos. Thème 2 Le candidat s appuiera essentiellement sur une analyse détaillée des documents pour construire un schéma de régulation reliant les gènes ag, ap2 et mir. Aucune introduction n est attendue. Le candidat ne doit pas rédiger de longs développements de connaissances sur le thème, indépendamment de l exploitation des documents. Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d être légendés, commentés et exploités ; des croquis légendés peuvent également être proposés.

2 2/7 THÈME 1 CONTROLE DE L EXPRESSION DU GENE NOS D après sujet d ENS 2006 Après avoir étudié les documents suivants, vous construirez un schéma bilan montrant comment est régulée la transcription du gène nos dans la paroi artérielle. Le monoxyde d azote (NO) est une molécule impliquée dans le contrôle de la pression artérielle. Sa synthèse est catalysée par une enzyme, la NO synthase (NOS), dans les cellules des parois des artérioles. On cherche à déterminer l influence de la concentration en dioxygène dans le sang sur la transcription du gène nos. On définit alors deux conditions : - la normoxie, condition de concentration «normale» en dioxygène : 70% N2, 20% O2 et 5% CO2 - l hypoxie : 90% N2, 5% O2 et 5% CO2 On sait que le N2 n a aucune influence sur les processus étudiés. Document 1A Influence de la concentration en dioxygène 1A1) Mesure de la quantité d ARNm NOS produits dans des conditions d hypoxie ou normoxie On cultive des cellules extraites de la paroi des vaisseaux sanguins, dites cellules HUVEC, in vitro à 37 C, soit en conditions de normoxie, soit en hypoxie, pendant 24 heures. Puis les cellules sont lysées, leurs ARNm extraits et analysés. La quantité d ARNm NOS est évaluée en cas de normoxie et normalisée. Elle est mesurée à 200% en hypoxie. 1A2) Etude de la région amont du gène NOS et de son rôle dans le contrôle de la transcription du gène NOS On réalise une transfection de cellules HUVEC, c est-à-dire qu on intègre à leur génome une construction comprenant les séquences suivantes (voir figure 2A2) : - un gène rapporteur, le gène de la luciférase. Cette enzyme conduisant à la fluorescence des cellules est facilement quantifiable ; - une portion de la région en amont de la séquence transcrite du gène NOS, de taille variable : 6047 pb (notée Luc-6047), 5523 pb (notée Luc-5523) ou 5039 pb (notée Luc-5039). Les cellules sont placées 24h en conditions de normoxie ou d hypoxie. On mesure alors la quantité de luciférase obtenue en hypoxie relativement aux conditions de normoxie. Figure 1A2 : séquences transfectées dans les cellules HUVEC et niveaux de transcription mesurés dans les différents cas

3 Document 1B Etude du facteur de transcription HIF1 et de la région d ADN régulatrice 1B1) Expérience de footprinting Dans les cellules HUVEC placées en hypoxie, on détecte une protéine appelée HIF1 (Hypoxia Inductible Factor). On a pu montrer que la protéine HIF1 se fixe spécifiquement sur une séquence d ADN : 5 - TGTACGTG - 3. Par ailleurs, on a isolé un fragment d ADN de 265 pb issu de la région mise en évidence dans le document précédent il s agit de la région à située en amont du gène nos. On réalise une expérience de footprinting à partir de cette région de 265 pb, marquée radioactivement en 3. On soumet le fragment à la lyse par l ADNase I, endonucléase qui coupe aléatoirement l ADN, générant ainsi des fragments de toutes les tailles. Les fragments sont ensuite séparés par une électrophorèse en conditions non dénaturantes puis révélés par une autoradiographie. La colonne 1 est obtenue ave l ADN seul. La colonne 2 est réalisée en présence de HIF1. 3/7

4 1B2) Expérience de retard sur gel On utilise des oligonucléotides fabriqués à partir du fragment de 265 pb étudié dans le document 2B1, dans la portion pb. Ces oligonucléotides sont marqués radioactivement. Les oligonucléotides sont incubés en absence (0) ou en présence d extraits nucléaires des cellules HUVEC, cultivées en normoxie (N) ou hypoxie (H) et en absence (0) ou en présence d anticorps reconnaissant HIF1 (Ac HIF1) ou reconnaissant une autre protéine (Ac). On soumet alors les mélanges (oligonucléotides + extraits nucléaires + anticorps) à une électrophorèse en conditions non dénaturantes, qui est ensuite révélée grâce à une autoradiographie. 4/7 Document 1C Etude de la présence ou de l absence du facteur de transcription HIF1 en fonction de la concentration en dioxygène Le gène HIF1 est transcrit de la même manière dans les tissus en normoxie ou en hypoxie : on mesure la même quantité d ARNm HIF1 dans les cellules. Pourtant, la protéine HIF1 est indétectable dans les tissus en normoxie alors qu elle est abondante dans les tissus en hypoxie. On a identifié un domaine de la protéine appelé ODD, situé entre les acides aminés 401 et 603 qui semble intervenir dans le contrôle de l abondance de la protéine HIF1 selon les conditions de concentration en O2. On mesure alors la quantité de protéines dans des cellules cultivées 24h en normoxie (N) ou hypoxie (H) avec les protéines suivantes (voir ci-dessous) : (A) HIF1 normale (B) HIF1 tronquée pour le fragment ODD, notée 401Δ603 (C) La protéine GAL (sans aucun rapport avec la teneur en dioxygène) mais à laquelle on a rajouté le domaine ODD.

5 5/7 THÈME 2 LES ARN DANS LE DÉVELOPPEMENT FLORAL D après sujet ENS 2007 Construisez, à partir des informations obtenues à partir des documents suivants, un schéma de régulation reliant les gènes AG, AP2 et MIR. Au cours du développement des fleurs d Arabidopsis thaliana, l identité des pièces florales est déterminée par des gènes homéotiques dont la mutation conduit au remplacement de certains organes par d autres. Document 2.1 : Les mutations apetala2 et agamous inactivent respectivement les gènes ap2 et ag, qui codent pour les protéines AP2 et AG. Les mutants sont comparés à la fleur sauvage sur la figure 1. Figure 1 : phénotype des fleurs sauvages (A), des fleurs mutantes apetala2 (B) et des fleurs mutantes agamous (C). Sur le cliché B, la flèche pointe un carpelle ; sur la photo C, la flèche pointe un sépale. Chez les plantes apetala2, la protéine AG s exprime dans les ébauches de toutes les pièces florales, alors qu elle n est présente que dans celles des pièces fertiles des fleurs sauvages. Chez les plantes agamous, la protéine AP2 s exprime dans les ébauches de toutes les pièces florales, alors qu elle n est présente que dans celles des pièces stériles des fleurs sauvages.

6 Document 2.2 L ARN MIR172 est un ARN non codant de 21 nucléotides exprimé à partir du gène mir. L abondance de l ARN MIR172 de l ARNm AP2 et de la protéine AP2 a été analysée dans les inflorescences de plantes sauvages, de plantes agamous et de plantes transgéniques surexprimant MIR (plantes P-MIR172). Les fleurs des plantes P-MIR172 présentent un phénotype semblable à celui des fleurs apetala2. 6/7 Figure 2. Expression des gènes mir172 et ap2 chez les plantes sauvages, les plantes P- MIR172 et les plantes agamous. Des échantillons d inflorescence de chaque plante ont été répartis en trois fractions : 1) Les ARN totaux extraits à partir de la première fraction ont été séparés par électrophorèse, puis visualisés sous lumière ultraviolette (2). Après transfert de ces ARN sur une membrane, l ARN MIR172 a été détecté par hybridation avec un oligonucléotide radiomarqué de séquence complémentaire (sonde MIR172). (1) 2) Les ARNm extraits à partir de la deuxième fraction ont été séparés par électrophorèse, puis transférés sur une membrane. Les ARNm AP2 (3) et les ARNm du gène cellulaire contrôle UBQ5 (4) ont été détectés comme précédemment, à l aide d une sonde AP2 et d une sonde UBQ5 respectivement. 3) Les protéines extraites à partir de la troisième fraction ont été séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, puis transférées sur une membrane. La protéine AP2 (5) et la protéine cellulaire contrôle PEPC (6) ont été détectées à l aide d anticorps spécifiques couplés à une enzyme donnant des produits colorés en présence du substrat adéquat.

7 Document 2.3 La séquence de l ARN MIR172 est complémentaire d une courte région de l ARNm du gène AP2. 7/7 Figure 3 (document à ne pas analyser) Les gènes AP2 ou AP2m (gène AP2 présentant des mutations dans la région de complémentarité avec l ARN MIR172, voir ci-dessus) placés sous le contrôle d un promoteur fort P, ont été introduits artificiellement dans des plantes sauvages, de façon à obtenir des plantes transgéniques (plantes P-AP2 et plantes P-AP2m respectivement). Les fleurs des plantes P-AP2 présentent le même phénotype que les fleurs sauvages alors que celle des plantes P-AP2m sont comparables aux fleurs agamous. La quantité d ARNm AP2 et de protéine AP2 présente dans les inflorescences de ces plantes et des plantes sauvages a été étudiée (cf. Figure 4). Par ailleurs, MIR172 ne s exprime que dans les pièces fertiles des plantes sauvages. Figure 4. Expression du gène AP2 chez les plantes sauvages et chez les plantes transgéniques P-AP2 et P-AP2m. Des échantillons d inflorescence de chaque plante ont été analysés selon le même protocole que précédemment (cf. Figure 2). Les nombres en dessous de chaque piste représentent les valeurs de la quantité d ARNm AP2 ou de protéine AP2 normalisées respectivement par rapport à l ARNm UBQ5 ou à la protéine PEPC, puis rapportées aux valeurs obtenues chez les plantes sauvages.

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