Un vieux test ré-actualisé : le Test de Génération de Thrombine (TGT) (Endogenous Thrombin Potential, ETP) ARL, Lausanne, mars 2007

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1 Un vieux test ré-actualisé : le Test de Génération de Thrombine (TGT) (Endogenous Thrombin Potential, ETP) ARL, Lausanne, mars 2007

2 L HEMOSTASE DES MANUELS DE REFERENCE 1. L hémostase primaire 2. La coagulation 3. La fibrinolyse

3 L hémostase primaire

4 TFPI FIXa PC, PS AT

5 TAFI Fibrinolyse

6 Temps de saignement versus temps de coagulation Thrombopénie/thrombopathie : temps de saignement prolongé et temps de coagulation normal Hémophilie : temps de saignement normal et temps de coagulation prolongé (aptt) Question: l hémophile a un TP normal, pourquoi saigne-t-il?

7 XI XIa Activation du TAFI

8 Tracéoptique d un test de coagulation

9 Paradoxes Le TP est corrélé àla quantité de thrombine formée chez patients sous AVK Le TP n est pas corrélé àla quantité de thrombine formée chez patients sous héparine Le sulfate de dermatan n allonge aucun temps de coagulation mais diminue la quantité de thrombine formée La quantité de la thrombine formée Allongement des temps de coagulation

10 Avantages et limites de la mesure des temps de coagulation utile dans les activités de laboratoire correspond aux tests actuels mais pas d information sur les inhibiteurs n explique pas pourquoi un déficient en facteurs autres que V, X et II saignent

11 Tracéoptique d un test de coagulation

12 Test de génération de thrombine (TGT) Plasma défibriné Ca ++ PL (TF) fibrinogène t 1 t 2 t 3 t 4 t 5... tn Temps de coagulation

13 Expression graphique 1/Temps de coagulation t 1 t n temps

14 Mesure de la génération de thrombine avec automate 1. Fluorimétrie Pas d interférence du fibrinogène Pas d interférence des plaquettes (plasma riche en plaquettes) Chargement manuel des microplaques Calibration interne pour correction de la fluorescence de l échantillon

15 Mesure de la génération de thrombine avec automate 2. Colorimétrie Défibrination du plasma ou inhibiteur de polymérisation Plasma déplaquetté Totalement automatisé 3. Electrochimique Réalisée sur sang total

16 APPAREILS 1. Fluorimétrie Fluorimètre àmicroplaques Logiciel d analyse des données (Dispenseur de substrat) 2. Colorimétrie CobasMira, ACL 300, BCS Logiciel d analyse des données 3. Electrochimie Appareil en développement

17 Influence de l α2.macroglobuline dans le test Rappel: la thrombine complexée par l α 2 -macroglobuline conserve son site estérase actif, mais ne peut plus lier le fibrinogène

18 Conditions expérimentales (en PRP) Temps de lecture : min Substrat fluorogénique «lent»(k cat bas) Substrat n est pas en excès (compétition avec les cibles de la thrombine) La vitesse d augmentation de la fluorescence diminue avec l intensité de fluorescence: facteur de correction pour chaque niveau de fluorescence «Blanc fluorescence»pour corriger la fluorescence de l échantillon Compte plaquettaire optimal : 150 G/l Influence du fibrinogène (fibrine)

19 Conditions expérimentales (en PPP) Substrat chromogène «lent» Pas d excès de substrat Phospholipides exogènes Pas d information sur l effet procoagulant plaquettaire endogène Pas d influence du fibrinogène (défibrination enzymatique ou inhibiteurs de polymération) Concentration de thrombine αmg plus importante Plus adapté àla «routine»

20 ETP et concentration en PL PL : 20% PE, 20% PS, 60% PC Quiroga et al PathophysiolHaemost Thromb 2003;33:30

21 Les paramètres de la thrombinographie

22 Coefficients de variation Hemkeret al PathophysiolHaemost Thromb2003;33:4

23 Hemostasis the main actors At rest Endothelial cell Red cell White cell Platelet Activated TF, CAM, etc. PL TF GP, PL, etc. VII, VIIa, X, II, VIII/vWF, V, IX, XI, I, XIII, Plg VIIa, Xa, IIa, VIIIa, Va, IXa, XIa, XIIIa, fibrin, plasmin TFPI, PC/PS, AT, TAFI, PAI TFPI, PCa/PS, AT, TAFIa, PAI

24 Découpage du processus en trois phases 1. La phase d initiation 2. La phase d amplification 3. La phase d arrêt

25 Phase d initiation thrombine IIa (nm) temps (min)

26 Initiation and first generation of thrombin X II stimulus VII VIIa Xa TF Cell with TF IX VIIa TF IIa IXa

27 Découpage du processus en trois phases 1. La phase d initiation 2. La phase d amplification 3. La phase d arrêt

28 Phase de génération explosive de thrombine thrombine IIa (nm) temps (min)

29 Amplification burst of thrombin X II VIIIa IX VIIa Xa TF Cell with TF VIIa TF IIa Va XIa IXa X II Platelet XIa IX IXa VIIIa Xa Va Activated platelet IIa

30 Découpage du processus en trois phases 1. La phase d initiation 2. La phase d amplification 3. La phase d arrêt

31 Phase d inhibition thrombine IIa (nm) temps (min)

32 Les inhibiteurs TFPI (Tissue Factor PathwayInhibitor) : bloque la phase d initiation et le début de l amplification PCa : bloque la phase d amplification AT : bloque la phase de terminaison

33 Mode d action du TFPI

34 Effet du TFPI sur la génération de thrombine Liestol et al. Br J Haematol 2007;136:131-7.

35 Mécanisme d action du système protéine C protéine S

36 ETP et déficience en protéine C Dargaud et al. Thromb Haemost 2006;96:562-7.

37 Déficience en protéine S déficient contrôle

38 Action de la protéine C activée sur le facteur Va

39 Polymorphisme gène FV en 1691 génotype GG génotype AG génotype AA thrombine (nm) thrombine (nm) thrombine (nm) temps (min) temps (min) temps (min) PCa :0 6,7 13,9-25 nm

40 ANTITHROMBINE FIIa*AT F IIa, F Xa, F IXa + AT FXa*AT FIXa*AT Inhibition accélérée par les glycosaminoglycanes

41 Déficience constitutionnel en antithrombine témoin AT = 60 % thrombine (nm) thrombine (nm) temps (min) temps (min)

42 ETP et mutation G20210A de la prothrombine Dargaud et al. Thromb Haemost 2006;96:562-7.

43 ETP et déficience en facteurs

44 HEMOPHILIE A Témoin Hémophile A PRP, PRP, PRP, rtf rtf rtf 0,5 0,5 0,5 pm pm pm ; ; PT ; PT PT = = nm.min nm.min PRPcd, PRPcd, rtf rtf 0,5 0,5 pm pm ; PT ; PT = = nm.min nm.min PRPcd, rtf 5 pm ; PT = 2078 nm.min PRP PRP rtf rtf à à 0,5 0,5 pm pm ; PT ; PT = = nm.min nm.min PRP cd ; rtf 0,5 pm ; PT = 518 nm.min PRP cd rtf 0,5 pm PT 518 nm.min PRP cd ; rtf 5 pm ; PT = 1834 nm.min thrombine (nm) thrombine (nm) temps (min) temps (min)

45 Thrombine générée en fonction du taux de FVIII Dargaud et al, T&H 2005;93:475

46 ETP et histoire de saignements chez l hémophile A Dargaud et al, T&H 2005;93:475

47 Effet du FEIBA et du NovoSevenchez l hémophile avec inhibiteurs FEIBA R-FVIIa Turecek et al PathophysiolHaemost Thromb 2003;33:16

48 Déficiences modérées en facteur VII Giansilyet al PathophysiolHaemost Thromb 2003;33:36

49 Génération de thrombine et lupus anticoagulant Liestol et al. Br J Haematol 2007;136:131-7.

50 ETP et traitements anticoagulants

51 INR et ETP Pooled OAC patients Individual OAC patients Jackson et al PathophysiolHaemost Thromb2003;33:43

52 Relation entre l ETP et l aptt chez des volontaires sous HNF n = 12, 4 injections sc Al Dieri et al JTH 2004;2:1395

53 ETP et héparine de bas poids moléculaire dalteparine Bolström et al BC&F 2003;14:457

54 ETP et fondaparinux (Arixtra ) Gerotziafas et al., Thromb Haemost 2004;92: l

55 ETP et melagatran(dti) Bolström et al BC&F 2003;14:457

56 Evolution de l ETP après administration de ximelagatranet d enoxaparine 60 mg ximelagatranpo (n=20) Enoxaparin100 IU/kg sc (n=20) Bolströmet al Thr Res 2004;113:85

57 Conclusions Outil de recherche Méthodes et agents inducteurs différents Standardisation Validation clinique Champs d application : -phénotype et déficience(s) en facteurs/inhibiteurs -contrôle et suivi des traitements de substitution / de court-circuit -contrôle et suivi des traitements anti-thrombotiques -exploration des problèmes hémorragiques (en PRP) -développement de nouveaux produits anti-thrombotiques