Radicaux libres Stress oxydatif. Eric Fontaine INSERM U1055 Grenoble

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1 Radicaux libres Stress oxydatif Eric Fontaine INSERM U1055 Grenoble

2 Métabolisme énergétique Nutriments CO 2 NH 3 H 2 ATP Travail O 2 ADP

3 Oxygène et travail O 2 ATP Oxydation Phosphorilante ROS ATP anaérobique

4 Oxydo-réduction Une oxydation est une perte d électron Une réduction est un gain d électron Une réaction d oxydo-réduction est un transfert d électron d un composé A vers un composé B A s oxyde B se réduit

5 Couple redox Ae-! B! réduit! oxydé! Oxydation! Réduction! A! oxydé! Be-! réduit! Ae-/A! Be-/B!

6 Accepter et donner

7 Un couple redox particulier NADH+H +! 1/2 O 2! 2H +! 2e-! NAD +! H 2 O! NADH/NAD +! 1/2 O 2 /H 2 O!

8 Atome - Molécule O O 2

9 Oxygène - Superoxyde + O 2 - O 2

10 Que faire avec ça?

11 Deux possibilités 2H + O 2 -- H 2 O 2 O 2 - O 2

12 De l oxygène à l eau + 1e - O 2 O e - + 2H + H 2 O 2 + 1e - + 1H + OH + H 2 O + 1e - + 1H + 2 H 2 O

13 Plan Rappels Les radicaux libres Les dérivés réactifs de l oxygène (ROS) Formation des ROS Exemple de toxicité Les systèmes de défense Exemples de stress oxydant Longévité Diabète ROS et mitochondries

14 Les principaux ROS Radical superoxyde Radical hydroxyl Monoxyde d azote O 2 - OH NO Peroxyde d hydrogène Peroxynitrite H 2 O 2 ONOO -?

15 La toxicité des ROS dépend Pour les radicaux libres De leur 1/2 vie Plus l électron est instable (plus la 1/2 vie est courte), plus il attaque les molécules alentours De leur lieu de production Plus la la 1/2 vie est courte (moins le radical libre diffuse), plus il attaque de manière non spécifique Pour les ROS non radicaux libre De leur toxicité propre De leur capacité à générer des radicaux libres Réaction de fenton, etc.

16 Demi-vie Symbole Nom Concentration Demi-vie (37 C) O 2 - Radical superoxyde à M Enzymatique OH Radical hydroxyl s NO Monoxyde d azote - 1 à 10 s H 2 O 2 Peroxyde d hydrogène 10-9 à 10-7 M Enzymatique ONOO - Peroxynitrite - 0,05 à 1 s

17 Radicaux libres oxygénés Production Signalisation Radiations Chaîne Respiratoire NADPH oxydase Xanthine oxydase O 2 - H 2 O 2 OH Oxydation Lipides Protéines ADN NO-synthase NO ONOO - Nitration Sulfoxidation Nitrosation Signalisation

18 Pourquoi? Chaîne Respiratoire NADPH oxydase Xanthine oxydase NO-synthase Sensor de l oxygène? Défense? Signalisation

19 Mitochondries - Consommation O 2 Donneur d'électron Accepteur d'électron NADH + H + NAD + 2 e - 2 H + 1/2 O 2 H 2 O

20 Mitochondries - Consommation O 2 Donneur d'électron Accepteur d'électron 2 NADH + H + 2 NAD + 4 e - 4 H + O 2 2 H 2 O

21 Mitochondries Production du gradient de H + 2 H + e - e - e - Ub - Ub e e - - Ub 2- UbH 2 e - e - 2 H +

22 Mitochondries - Production O 2 - e - e - e - Ub Ub - O 2 O 2 -

23 La chaîne respiratoire nh + n H + n H + espace! intermembranaire! Cyt c 1 Cyt c Cyt c Cyt c FMN FeS FeS Q! Q! Q! Cyt b k Cyt b T FeS Cyt a Cyt a 3 matrice! 2e - 2e - NADH 1/2 O 2 + 2H + H 2 O

24 La «voie alterne» n H + n H + Cyt c 1 Cyt c Cyt c Cyt c Q! Q! Cyt b k Cyt a FeS Q! Cyt b T Cyt a 3 matrice! 2e - 2e - FADH 2 1/2 O 2 + 2H + H 2 O

25 Lieux de production de ROS O 2 - O 2 - O 2 O 2 Cyt c 1 Cyt c FMN FeS FeS Q! Q! Q! Cyt b k Cyt b T FeS Cyt a Cyt a 3 2e - NADH

26 Réversibilité du complexe 1 n H + O 2 O 2 - Cyt c 1 Cyt c FMN FeS FeS Q! Q! Q! Q! Cyt b k Cyt b T FeS Cyt a Cyt a 3 2e - NAD + NADH FADH 2

27 La production «reverse» O n H + 2 O 2 - O 2 O 2 - Cyt c 1 Cyt c FMN FeS FeS Q! Q! Q! Q! Cyt b k Cyt b T FeS Cyt a Cyt a 3 2e - FADH 2

28 ROS & inhibiteurs de la chaîne respiratoire Roténone 2H + Antimicyne Myxothiazole 2H + X 2e - Ub 2e - X - Ub - X 2- Ub 2-2e - 2H +

29 ROS & inhibiteurs de la chaîne respiratoire Roténone 2H + Myxothiazole Antimicyne 2H + X Ub 2e - X - Ub - X 2-2e - Ub 2-2e - 2e - 2H +

30 Deux possibilités O 2 -- O 2 - O 2

31 Perdre l électron non apparié Fe O - Fe O 2 Cyto C + O - 2 Cyto C + O 2

32 Gagner un nouvel électron O O H + SOD H 2 O 2 + O 2 Cu/Zn Mn O NO ONOO - NOS

33 Devenir de H 2 O 2 H 2 O 2 + 2GSH GPX Se 2H 2 O + GSSG H 2 O 2 + H 2 O 2 Catalase O 2 + 2H 2 O Fe ++ + H 2 O 2 Fe OH + OH - Fenton

34 NO-synthase O 2 Arginine NADPH Citruline NADP + NO

35 Ischémie reperfusion ATP Ischémie ATP reperfusion Hypoxantine Hypoxantine O 2 Xantine dehydrogenase Xantine oxidase Xantine Xantine O 2 - O 2 Xantine dehydrogenase Xantine oxidase O 2 - Acide Urique Acide Urique

36 Cellules phagocytaires NADPH 2 O 2 2 Cl - NADPH oxydase Myelo peroxydase NADP + + H + 2 O 2 - Cl 2 2 ClO -

37 Le rôle des métaux Fe ++ + H 2 O 2 Fe OH + OH - Fe O - Fe O 2 Fe VitC Fe ++ + VitC

38 Exemple de toxicité H C OH OOH C C H 2 O O 2 H OO C C

39 Radicaux libres oxygénés Défenses Glutathion peroxydase Catalase Chélateurs Fer Cuivre Chaîne Respiratoire NADPH oxydase Xanthine oxydase SOD O - 2 H 2 O 2 OH Oxydation Lipides Protéines ADN Allopurinol Scavengers NO-synthase NO ONOO -

40 Défense enzymatique O O H + SOD H 2 O 2 + O 2 Cu/Zn Mn H 2 O 2 + 2GSH GPX Se H 2 O + GSSH H 2 O 2 + H 2 O 2 Catalase O 2 + 2H 2 O

41 De l oxygène à l eau O 2 Cyto C CR O 2 - Catalase SOD H 2 O 2 Fenton OH + H 2 O GPX Scavenger Peroxydation 2 H 2 O

42 Piégeur de Radicaux libres? C UbH 2 UbH 2 C Ub - + H + Ub - + H + H C H C Ub + UbH 2

43 Ambivalence des Scavengers Contrôle } Ubiquinones Walter & al. J Biol Chem, 2000

44 Régénération des Scavengers X Vit E Vit C GSH NADP Glutathion peroxydase Glutathion reductase X Vit E Vit C GSSG NADPH

45 Plan Rappels Les radicaux libres Les dérivés réactifs de l oxygène (ROS) Formation des ROS Exemple de toxicité Les systèmes de défense Le stress oxydant Définition Exemples ROS et mitochondries

46 Stress oxydant

47 Stress oxydant

48 Mesure des ROS Directe Indirecte Fluorescent

49 Témoins d un stress oxydant Mesure de produits oxydés Lipides peroxydés (MDA, ethane, 4-hydroxynoneal, isoprostanes ) Protéines oxydées (groupes carbonyl, tyrosine hydroxylée, nitrotirosines ) ADN oxydé (8-hydroxy-2 -deoxyguanosine) Mesure d une diminution des «antioxydants» Enzymatique (SOD, GPx ) Leur cofacteurs (Se, Zn, Cu ) Scavenger (Vit C, Vit E, CoQ, Caroténoides, GHS )

50 ROS et mort cellulaire Rôle des mitochondries dans la mort cellulaire

51

52 Mitochondries et Apoptose Cytosolic fraction column { Apaf-1 Apaf-2 Cyto C Liu X et al. Cell, 1996, 86,

53 Cascade apoptotique Apaf-1 Cyto C Procaspase IAP SMAC Caspase AIF Endo G

54 Protéines Mitochondriales? Apaf-1 Cyto C Procaspase IAP SMAC Caspase AIF Endo G

55 Diffusion des protéines apoptotiques

56 Le PTP? PTP

57 0 min

58 10 min

59 20 min

60 HMEC-1 Calcein 0 min tbh 100µM tbh CsA tbh MET 100µM 5 min 15 min

61 HMEC-1 Cytochrome c Control tbh tbh + CsA tbh + Met (100)

62 HMEC-1 & stress oxydant (tbh) hours 24 hours ** % of Dead Cells * 10 0 Basal tbh 100µM CsA 1µM + tbh 100µM MET 100µM + tbh 100µM

63 KB cells tbh tbh + CsA tbh + Metformin Cytosol Mitochondria Control tbh tbh Metformin tbh CsA