Nathalie GNANOU-BESSE, Rabeb MILED AFSSA LERQAP, unité HMPA

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1 Nathalie GNANOU-BESSE, Rabeb MILED AFSSA LERQAP, unité HMPA

2 Listeria monocytogenes : Plan de surveillance de la contamination des aliments à la distribution (d après DGCCRF)

3 Cronobacter (Enterobacter sakazakii) Largement répandu dans les environnements agro-alimentaires et domestiques Poudres de lait pour bébé : Contaminations environnementales Niveaux de contamination : ufc / 100 g (en général <1 ufc / 100g, Muytjens et al., 1988) - FAO/OMS 2006 : 3 catégories de poudres selon la concentration en E. sakazakii < 1/100kg < 1/10kg < 1/kg Rapport Afssa 2008 «Contamination microbienne des préparations lactées en poudres destinées aux nourrissons et personnes agées»: Pour 3 usines auditionnées : 3 bactéries /10kg, 1.5/ 10kg, < à 0.5/10kg

4 Dénombrement de Listeria monocytogenes aux faibles niveaux de contamination dans le saumon fumé Impact du poolage sur la détection d Enterobacter sakazakii dans les laits infantiles

5 Dénombrement de Listeria monocytogenes aux faibles niveaux de contamination dans le saumon fumé

6 Contexte Règlement européen 2073/2005 Critère quantitatif de 100 ufc/g Tests de croissance et tests de vieillissement Mauvaise sensibilité de la méthode normalisée EN ISO EN ISO 7218 : «General requirements and guidance for microbiological examination» Point : Preparation of the food suspension- concentration step Développement d une méthode de dénombrement plus sensible Saumon fumé (analyse de 5 g) Filtration sur membrane +culture sur gélose sélective Gnanou Besse et al. (2004), Int. J. Food Microbiol., 91, Gnanou Besse et al. (2008), Int. J. Food Microbiol., 124,

7 Protocole de la méthode de dénombrement par filtration X g échantillon non broyé + 9X ml TS Stomacher 1 min (sac à filtre 280 µm) Verser dans un second sac à filtre puis prélever les volumes suivants : ml 1 or 0.1 ml Ajouter 0.83% tween % trypsine1/250 d origine bovine EN ISO (1 ml de chaque solution à 10% pour 10 ml de suspension à filtrer) (méthode de référence) Incuber min à 37 C en bain à agitation Filtrer 5, 15 et 30 ml de suspension traitée (correspondant à des volumes finaux de 6, 18 and 36 ml) Déposer les filtres sur gélose ALOA Incuber 48 h à 37 C Repiquer par points les colonies bleues sur ALOA Incuber 8-24 h à 37 C Confirmer les colonies typiques de L. monocytogenes (bleues avec un halo)

8 Conclusions Sensibilité et précision satisfaisantes Méthode simple, basée sur des techniques de microbiologie classique (même gélose sélective que la méthode de référence) Nécessite un appareillage de filtration et est plus fastidieuse que la méthode de référence Un protocole très détaillé et une formation sont nécessaires avant de pouvoir utiliser correctement la méthode

9 Utile pour contrôler plus précisément la limite de 100 UFC g -1 ou pour réaliser des tests de croissance dans des conditions plus réalistes (bas niveaux de contamination) Utilisation en AQR et études de croissance : Contamination et croissance de L. monocytogenes dans du saumon fumé naturellement contaminé, impact de la taille de l inoculum sur la croissance Gnanou Besse et al. (2006), Int. J. Food Microbiol., 110, Beaufort et al. (2007), Letters Appl. Microbiol., 44, Normalisation : Méthode normalisée NF V Poissons transformés Méthode de dénombrement de L. monocytogenes aux faibles niveaux de contamination dans le saumon et la truite fumés Mars 2009, AFNOR, La Plaine St Denis, France Application à d autres matrices? Baudouin et al. (2009), Food Analytical Methods

10 Problèmes liés à la détection d Enterobacter sakazakii Impact du poolage sur la détection d Enterobacter sakazakii dans les laits infantiles

11 Préparation de l échantillon/pré-enrichissement : X g dand 9 x ml EPT Incubation à 37 C pendant 18 ± 2h Enrichissement sélectif : Transférer 0,1ml de l EPT incubée dans 10ml de bouillon mlst Bouillon CSB: incubation à 42 pendant 24h et élimination des négatifs Incubation à 45 C pendant 24 ± 2h Isolement sur gélose sélective chromogène : Etaler une oese du bouillon mlst sur ESIA TM Le screening permet d éliminer environ 70% des échantillons 10 4 ufc/ml sont nécessaires en fin de préenrichissement pour fermenter le CSB (Joosten et Iversen, 2009) Incubation à 44 C pendant 24 ± 2h Les colonies typiques sur gélose chromogène peuvent être considérées Présomptivement Comme E. sakazakii Confirmation : Sélectionner 5 colonies typiques et étaler sur TSA Isolement sur gélose mdfi Incubation à 25 c pendant 48 ± 4h Confirmation : Sélectionner une colonie jaune sur chaque TSA Confirmation biochimique La pigmentation jaune n est plus un critère d identification présomptive

12 R a p p o r t A f s s a ( ) «Contamination microbienne des préparations lactées en poudres destinées aux nourrissons et personnes agées» - Absence de détection de la contamination des lots lors des tests libératoires effectués par les industriels lors des 3 alertes sanitaires à l origine de la saisine de l Afssa - Apprécier l efficacité des méthodes d échantillonnage et d analyse mises en œuvre dans le cadre de la recherche des Enterobacteriaceae (Salmonella et E. sakazakii) dans les préparations en poudre, apporter des éléments scientifiques sur l origine des contaminations

13 R a p p o r t A f s s a ( ) «Contamination microbienne des préparations lactées en poudres destinées aux nourrissons et personnes agées» Impact du regroupement des prises d essais (poolage) avant analyse? Echantillonnage : - Concentration extrêmement faible en E. sakazakii : 3 usines auditionnées > 3 bactéries /10kg, 1.5/ 10kg, <0.001 à 0.5/10kg - Evaluation de différentes stratégies d échantillonnage par simulations numériques fondées sur des hypothèses de répartition des bactéries > Il est difficile au niveau d un lot ou d une série de lot de détecter les lots positifs, des mesures complémentaires au contrôle final doivent être mises en oeuvre - Elaboration d un outil de calcul intégrant le plus grand nombre de plans d échantillonnage possibles pour aider les exploitants à optimiser leur décision

14 Thèse Afssa de R. Miled : Effets de facteurs microbiens sur la croissance d'enterobacter sakazakii dans les laits infantiles : taille et composition de la population Objectifs : Contribuer à améliorer l'analyse quantitative des risques sur E. sakazakii, par l apport de données manquantes concernant sa croissance notamment : - l effet de la population microbienne environnante - la prise en compte des très faibles niveaux de contamination : effet du stress et de la croissance de cellules uniques impact du poolage

15 Impact du stress et des paramètres de croissance individuels sur le développement d E. sakazakii - Etude des latences cellulaires individuelles, et validation du modèle proposé par Guillier et Augustin pour Listeria monocytogenes (IJFM, 2006, 2008), permettant d obtenir la distribution des lag i à partir des paramètres de croissance populationnels. - Souche type C. sakazakii lyophilisée - Poudre de lait infantile 1 er âge du commerce

16 Validation du modèle lors de l enrichissement primaire souche type C.sakazakii poudre de lait 1 er âge non contaminée en Cronobacter 40 sacs de 10g et 40 de 100g enrichissement au 1:10 en EPT (préchauffée à 37 C) niveau de contamination des sacs : 4 cellules/sac incubation à 37 C au bain-marie et prélèvements pour dénombrements à 8h et à 20h par étalement sur ESIA les courbes populationnelles ont été réalisées dans les même conditions 3 répétitions

17 Prévisions de croissance dans des sacs de 10g contaminés à ~4 cellules/sac

18 Prévisions de croissance dans des sacs de 10g contaminés à ~4 cellules/sac, avec arrêt de la croissance dès 9h

19 Prévisions de croissance dans des sacs de 100g contaminés à ~4 cellules/sac

20 Prévisions de croissance dans des sacs de 100g contaminés à ~4 cellules/sac, avec arrêt de la croissance dès 9h

21 Cumulative probability Distribution cumulative (observée lors de la validation) des dénombrements obtenus après 20h de préenrichissement en EPT pour des sacs de 10g ( ) et 100g ( ) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, log 10 (cfu/ml) after 20h

22 Les relations établies pour Listeria entre paramètres de croissance populationnels et individuels ont bien été observées pour Cronobacter, le modèle a bien été validé pour pour des croissances en EPT (prendre en compte les interactions bactériennes : effet Jameson) > Importance de la prise en compte de la distribution des lagi pour prévoir plus précisément la croissance > Ces relations pourront être utilisées pour Cronobacter (modélisation, AQR), sous réserve d une consolidation des données Fort impact du poolage sur les populations de Cronobacter atteintes à 20h, qui peut être expliqué par un effet combiné d une concentration initiale plus faible à 100g et d un arrêt précoce de la croissance dû à des interactions bactériennes Il est vraisemblable que cet effet soit amplifié par une flore annexe plus abondante et plus rapide à 100g > D un point de vue pratique, impact négatif du poolage sur la sensibilité de la méthode de détection > Possibilité de faux négatifs surtout avec un bouillon de screening (CSB), ce point serait à prendre en compte dans le cadre de la normalisation et de la révision de la méthode

23 Merci de votre attention!