L analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des aliments : applications concrètes

Dimension: px

Commencer à balayer dès la page:

Download "L analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des aliments : applications concrètes"

Sandrine Chrétien
il y a 8 ans
Total affichages :

1 L analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des aliments : applications concrètes Bernard Taminiau, Carine Nezer, Laurent Delhalle, Ysabelle Adolphe, Pedro Imazaki, Amélie Darcis, Antoine Clinquart et Georges Daube

Bernard Taminiau, Carine Nezer, Laurent Delhalle,

2 La caverne de PLATON

3 Isolement Identification Caractérisation Approche classique

4 Approche Métagénomique identification identification identification identification identification identification identification identification identification identification identification Identification

5 Approche Métagénomique Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation Caractérisation

6 Analyse ciblée Analyse fonctionnelle

7 L analyse métagénomique ciblée, C est l identification des membres de la communauté microbienne d un biotope afin: d en étudier la composition en étudier les évolutions déduire les parentés entre communautés.

8 WHO is in there??? Réalise une analyse taxonomique Taxonomie bactérienne est basée sur la séquence de l ARN 16S

9 Technique de séquençage massif en parallèle 454 pyrosequencing Illumina (Solexa) sequencing SOLiD sequencing Ion semiconductor sequencing DNA nanoball sequencing Helioscope(TM) single molecule sequencing Single molecule SMRT(TM) sequencing Single molecule real time (RNAP) sequencing Nanopore DNA sequencing VisiGen Biotechnologies approach Fournit un grand nombre de séquences désordonnées

sequencing Single molecule SMRT(TM) sequencing Single molecule real time (RNAP) sequencing

10 Tri et neyoyage des séquences Alignement des séquences sur des séquences de référence Regroupement et définition des OTUs

11 L OTU : unité taxonomique opérationnelle 0.01 Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl Regroupe des éléments qui partagent un consensus au niveau : De la séquence Du chemin taxonomique BlablBlablBlablBlablBlabl BlablBlablBlabl 0.1 Blabl BlablBlablBlabl Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl BlablBlablBablBlabl BlablBlablBlabl 0.03 Blabl Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl BlablBlablBablBlabl BlablBlablBlabl

niveau : De la séquence Du chemin taxonomique BlablBlablBlablBlablBlabl BlablBlablBlabl 0.

12 Quel avantage? Analyse à large spectre!!! Ø individus vs 5 colonies Analyse culture- indépendante Reproductible Portable et stockable Analyse quantitative

13 Quel limite? Tributaire de l état des connaissances actuelles La précision de l identification est dépendante de la séquence ciblée et obtenue La profondeur de l analyse est à fixer arbitrairement Basée sur l ADN (possibilité de détection d organismes morts) Analyse coûteuse dont le prix diminue

identification est dépendante de la séquence ciblée et obtenue La

14 Métagénomique et industrie agro- alimentaire Flores altérantes Matrice alimentaire est un biotope de choix!! Denrée alimentaire Flores pathogènes DLC Flores technologiques

15 Chimie alimentaire Biologie moléculaire séquenceur Rt- PCR Unité pilote Production produits crus/cuits

16 Etude du vieillissement de deux matrices à base de viande Viande de porc Produit cuit > 1 ingredient White pudding Viande de porc Produit cru 1 ingrédient Minced Meat Microflore : Contamination post cuisson Population Thermodurique Microflore : Contamination originale Contamination par manipulation

ingrédient Minced Meat Microflore : Contamination post cuisson Population

17 WP_D0 Workplan AIR - 4 C WP_FW_D6 30% CO2 70% N2 4 C 50% CO2 50% N2-4 C WP_MAP30_D21 WP_MAP50_D21 MM_D0 AIR - 4 C AIR 4-8 C AIR 12 C 30% CO2 70% O2 4 C 30% CO2 70% O2 4-8 C 30% CO2 70% O2 12 C MM_FW_S4_D3 MM_FW_S4-8_D3 MM_FW_S12_D3 MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-8_D6 MM_MAP_S12_D6

30% CO2 70% O2 4 C 30% CO2 70% O2 4-8 C 30% CO2 70% O2 12 C

18 Microbiological Analysis Label TOTAL AEROBIC LACTIC ACID BACTERIA ENTEROBACTERIACEA E PSEUDOMONADACEAE WP_D0 3,13 <3 <3 <3 WP_FW_D6 6,83 <3 <3 <3 WP_MAP30_D21 8,54 7,07 <3 <3 WP_MAP50_D21 8,64 6,61 <3 <3 MM_D0 3,92 <3 <3 <3 MM_FW_S4_D3 6,48 <3 <3 4,70 MM_FW_S4-8_D3 7,94 <3 <3 5,37 MM_FW_S12_D3 8 5,30 4,63 5,33 MM_MAP_S4_D6 7,56 4,34 <3 <3 MM_MAP_S4-8_D 6 7,39 4,67 <3 <3 MM_MAP_S12_D6 9,38 7,02 <3 <3 Data in Log UFCg - 1

MM_D0 3,92 <3 <3 <3 MM_FW_S4_D3 6,48 <3 <3 4,70 MM_FW_S4-8_D3 7,94 <3 <3 5,37 MM_FW_S12_D3 8 5,30 4,63

19 % % 100% Moraxellaceae_Psychrobacter Ruminococcaceae_Faecalibacterium Populations bactériennes boudin blanc Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalterom % % % % % WP_D0 relative bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% WP_FW_D6 WP_MAP30_D21 WP_D0 WP_FW_D6 WP_MAP50_D21 WP_MAP30_D21 WP_MAP50_D Enterobacteriaceae_Enterobacter Neisseriaceae_unclassified Vibrionaceae_Vibrio Enterococcaceae_Enterococcus Lactobacillaceae_Lactobacillus Streptococcaceae_Streptococcus Listeriaceae_Brochothrix Leuconostocaceae_Leuconostoc

WP_MAP30_D21 WP_D0 WP_FW_D6 WP_MAP50_D21 WP_MAP30_D21 WP_MAP50_D21 107 89 63 69 Enterobacteriaceae_Enterobacter Neisseriaceae_unclassified

20 PeH08_unclassified Viande hachée MAP Xanthomonadaceae_unclassified BD2-2_unclassified 100% 90% Bacteroidaceae_Bacteroides Streptococcaceae_Lactococcus Corynebacteriaceae_Corynebacterium relative bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% Lactobacillaceae_Lactobacillus_2 Carnobacteriaceae_Carnobacterium Enterobacteriaceae_Serratia Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas Vibrionaceae_Vibrio Microbacteriaceae_Microbacterium Neisseriaceae_unclassified Pseudomonadaceae_Pseudomonas Streptococcaceae_Streptococcus 10% FW_D0 MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-8_D6 MM_MAP_S12_D6 0% MM_FW_D0 MM_MAP_S12_D6 T MM_MAP_S4-8_D6 MM_MAP_S4_D6 Listeriaceae_Brochothrix Lactobacillaceae_Lactobacillus_1 Leuconostocaceae_Leuconostoc

Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas Vibrionaceae_Vibrio Microbacteriaceae_Microbacterium Neisseriaceae_unclassified Pseudomonadaceae_Pseudomonas Streptococcaceae_Streptococcus 10% FW_D0

21 Ruminococcaceae_unclassified Viande hachée AIR PeH08_unclassified Xanthomonadaceae_unclassified BD2-2_unclassified rela8ve#bacterial#count#of#the#otu/total#rela8ve#bacterial#count#(%)! 100%# 90%# 80%# 70%# 60%# 50%# 40%# 30%# 20%# MM_FW_D0 MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-8_D6 MM_MAP_S12_D6 10%# T 0%# MM_FW_D0# MM_FW_S12_D3# MM_FW_S438_D3# MM_FW_S4_D3# Bacteroidaceae_Bacteroides Streptococcaceae_Lactococcus Corynebacteriaceae_Corynebacterium Lactobacillaceae_Lactobacillus_2 Carnobacteriaceae_Carnobacterium Enterobacteriaceae_Serratia Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas Vibrionaceae_Vibrio Microbacteriaceae_Microbacterium Neisseriaceae_unclassified Pseudomonadaceae_Pseudomonas Streptococcaceae_Streptococcus Listeriaceae_Brochothrix Lactobacillaceae_Lactobacillus_1 Leuconostocaceae_Leuconostoc

22 Analyse est reproductible!!

23 Corrélation l analyse microbiologique et métagénomique Sensibilité élevée Très utile pour la validation de la qualité des denrées alimentaires

24 Qualité de la viande de bœuf emballée sous vide «Prêt à trancher» reconditionné en unités de vente Facilité logistique pour les distributeurs Deux catégories de viandes : viande produite en Belgique Blanc bleu belge viande importée arrivant sous- vide par bateau : viande irlandaise ou australienne ou sud- américaine

25 Belgian Blue beef Meat Australian beef Meat Day 0 Day 60 DLC +30 Day 80 Day 140 2/3 DLC DLC analyse microbiologique BBB (TEMPO) analyse microbiologique viande australienne (TEMPO) Day 0 - BBB Day 60 - BBB Total mesophil flora Lactic acid bacteria enterobacteria ceae AU1 day 80 AU1 day 140 AU2 day 80 AU2 day 140 Total mesophil flora Lactic acid bacteria enterobacteria ceae

26 Belgian Blue beef Meat Day 0 Day 60 Australian beef Meat Day 80 Day % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Proportions des populations >1% - blanc bleu belge BBB j0 BBB j60 Lactobacillus concavus Pantoea ananatis Brochothrix thermosphacta Pseudomonas uncultured Serratia Dyella sp. Carnobacterium uncultured Cedecea neteri Pseudomonas sp. Lactobacillus sakei Carnobacterium divergens Leuconostoc Yokenella regensburgei Lactococcus piscium Serratia sp. Lactobacillus algidus Obesumbacterium Leuconostoc uncultured Enterobacter cloacae Obesumbacterium proteus Populations >1% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% AU1 DLC 2/3 AU1 DLC Population >1% - contre-filet australien AU2 DLC 2/3 AU2 DLC Beijerinckiaceae_uncultured Enterobacteriaceae_Halfnia sp. Leuconostocaceae_Leuconostoc uncultured Carnobacteriaceae_carnobacterium uncultured Enterobacteriaceae_Serratia sp. Lactobacillaceae_Lactobacillus algidus Carnobacteriaceae_Carnobacterium maltaromaticum Carnobacterium maltaromaticum

27 Utile pour des problématiques diverses Contourne les limitations des milieux de culture

28 Un produit de viande crue de bœuf, souvent accompagné d épices et autres végétaux

29 2 échantillons de boucherie 2 échantillons de restaurant 2 échantillons de sandwich Soumis à l analyse métagénomique Soumis à l analyse microbio

30 %$ %$ Propor%ons(des(taxons( (dans(le(steak(tartare( %$ %$ %$ %$ %$ %$ %$ %$ 0.000%$ Resto$_1$ Resto_2$ Sandwich_1$Sandwich_2$Boucherie_1$Boucherie_2$ Lactobacillus algidus Pseudomonas sp. Photobacterium phosphoreum Leuconostoc uncultured Brochothrix thermosphacta Lactococcus piscium Lactobacillus sakei Weissella sp. Acinetobacter sp. Xanthomonas campestris Psychrobacter sp. Acinetobacter uncultured Photobacterium uncultured Pseudomonas uncultured Lactobacillus paraplantarum Uncultured unclassified Acinetobacter baumannii Carnobacterium divergens Enterobacter cloacae Carnobacterium uncultured bacterium uncultured Aeromonas uncultured Psychrobacter uncultured

31 Représentativité des populations suivant le taux de contamination observé sur PCA (CFU/g) 10,000, ,000, , , Lactobacillus_algidus Pseudomonas_sp. Photobacterium_phosphoreum Brochothrix_thermosphacta Leuconostoc_uncultured Lactococcus_piscium Weissella_sp. Lactobacillus_sakei 1, Resto _1 Resto_2 Sandwich_1 Sandwich_2 Boucherie_1 Boucherie_2

32 Diversité élevée dans une même matrice Complémentarité dans les analyses

33 Aspect technique et analytique +++ Interprétation analytique et microbiologique +-

34 L équipe Méta : Carine Nezer Laurent Delhalle Ysabelle Adolphe Pedro Imazaki Amélie Darcis Pr Antoine Clinquart Pr Georges Daube

Documents pareils

Sensibilisation des opérateurs à l hygiène des aliments

Sensibilisation des opérateurs à l hygiène des aliments Le respect des bonnes pratiques d hygiène de fabrication, par chaque opérateur, constitue le préalable à toute démarche de maîtrise de la sécurité