Marc DELPECH. CORATA La Rochelle le 21 mai 2008

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1 Marc DELPECH CORATA La Rochelle le 21 mai 2008

2 En 24 ans les progrès ont été considérables Premières utilisation des techniques de génétique moléculaire en diagnostic : 1984 Une palette de techniques très limitée Southern et northern blot Slot-blot, Dot-blot Une Connaissance d un très petit nombre de gènes Une capacité de détection des mutations très limitée

3 Les progrès ont été constants et rapides mise au point et diffusion de la technique PCR Années Développement de techniques de recherche des mutations (SSCP, DGGE, puis de leur automatisation : DHPLC). Accès possible au séquençage en diagnostic avec utilisation de constamment plus en plus large Années 2010-? Développement des puces à ADN Séquençage à haut débit

4 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore Années * Diagnostic les plus souvent probabiliste donc manquant de fiabilité * La mutation est rarement mise en évidence (délétions, insertions, mutations non-sens)

5 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore Progressivement, au cours des années 90 le séquençage a permis de caractériser les mutations faux sens Le problème majeur est alors de savoir si une variation de séquence est une mutation ou un polymorphisme neutre aujourd hui nous ne possédons pas les outils pour trancher

6 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore Il est clair maintenant que pour la très grande majorité des gènes l hétérogénéité allélique est considérable L exemple de la mucoviscidose : en dehors de la délétion d une phénylalanine en position 508 retrouvée dans environ 70% des chromosomes mutés il existe plus de 1000 mutations possible Dans la plupart des maladies il n y a même pas de mutation prédominante. Merci Internet et ses bases de données en libre accès

7 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore L hétérogénéité génétique est plus fréquente que l on croyait au début L exemple caricatural : les rétinites pigmentaires où plus de 100 gènes peuvent être impliqués Les cancers héréditaires du sein : BRCA1, 2,

8 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore Le déroulement du scenario est toujours le même : Presque toutes les mutations sont trouvées dans les premières familles Avec le temps le nombre de familles où la mutation n est pas trouvée ne cesse de croître Par exemple pour les fièvres héréditaires, au début 4 gènes devaient tout expliquer. Ce fut presque le cas au début, mais les familles avaient été sélectionnées pour trouver les 4 gènes. Depuis le nombre de cas où on trouve la mutation ne cesse de baisser (actuellement moins de 50%)

9 Que fait-on en pratique aujourd hui Dans le cas général on recherche les mutations dans le gène principal Parfois on les recherche dans quelques autres gènes (rarement) Résultat de très nombreuses familles restent sans diagnostic

10 Mais l accroissement de la complexité des diagnostic a été plus important encore Et pourtant ce qui a été décrit reste très simple

11 Les maladies strictement monogéniques n existent pas L exemple de la drépanocytose : Une très grande variabilité phénotypique

12 L explication? Les gènes modificateurs L exemple caricatural de la mucoviscidose Et nous ne connaissons aujourd hui pratiquement aucun gène modificateur Ils sont pourtant nombreux et jouent un rôle important Résultat Il est parfois difficile de prévoir ce que sera le phénotype d un enfant à naître, même en connaissant la mutation

13 Alors que faire? Les progrès technologiques sont indispensables, Ils arrivent.

14 Sur le plan technique les outils permettant de répondre à beaucoup de ces questions arrivent Le séquençage à très haut débit ou NGS (Next Generation Sequencing) Bientôt couplé à des puces de capture

15 Les systèmes actuels GS20 - FLX 454 Roche Solexa 1G Illumina SOLiD ABI Technologie Synthèse Synthèse Ligation Longueur lue en pb 250 pb pb pb Longueur totale lue par run 2006 : 20 Mb Mb 2009 : 1 Gb 2006 : 1-1,6 Gb 2010 : 9 Gb 2007 : : 9 Gb Bientôt (fin 2008) Héliscope (Helicos), 1Gb séquençage simple brin

16 L exemple du FLX 454-Roche

17 Préparation de la banque d ADN simple brin (sstdna) Ligation Nébulisation de l ADN génomique shotgun A B Selection Ligation d adaptateurs partant les amorces de PCR et de séquençage Sélection des fragments A/B en utilisant une purification avidine_biotine Isolation des ADN simple brin portant les adaptateur A et B gdna sstdna library Banque d ADN simple brin avec adaptateurs

18 empcr Amplification clonale Amplification clonale en émulsion ssdna Emulsion des billes et des réactifs PCR en micro réacteur Eau Huile Amplification clonale Enrichissemen t des billes ADN positives Banque ssdna Amplification clonale des ssdna attachés aux billes (million de copies par bille) Préparation et titration de la banque empcr Séquençage 4.5 h et 10.5 h 8 h 5.5h

19 La réaction de séquençage Dépot des billes dans la PicoTiterPlate portant la banque d ADN simple brin Dépot dans chaque puits d une seule bille portant l ADN amplifié clonalement Diamètre des puits: 44 µm La plaque contient 1.6 x 10 6 puits

20 En l état l appareil manque d intérêt en génétique moléculaire Tout va changer avec l hybridation capture préalable sur puce

21 L hybridation capture sur puce NimbleGen Roche

22 La fabrication des puces NimbleGen

23 Nous sommes encore loin du compte Plusieurs sujets analysés grâce à Des amorces colorées (12 couleurs possibles actuellement Des amorces avec étiquettes

24 Ce qui devrait être possible dans les mois qui viennent Séquençage de 200 exons chez 96 patients par run

25 Les étiquettes Amorce Etiquette GGGAATT ADN du patient 1 GGGAACC ADN du patient 2 CCCAATT ADN du patient 3

26 Il sera alors possible d analyser chez un même patient d un seul coup Tous les gènes possibles (hétérogénéité génétique Les gènes modificateurs (quand ils seront connus

27 Une conséquence majeure Le biologiste devra aussi être un bioinformaticien Le biologiste sera inondé d information Le biologiste devra de plus en plus se spécialliser car la moindre interprétation nécessitera une connaissance de toute la pathologie moléculaire des gènes explorés

28 Et toute le problème de la complexité ne sera toujours pas réglé De nouveaux mécanismes génétiques et de mutation sont constamment découverts Les ARN interférant, mircoarn Les CNV

29 Du côté de l éthique

30 Un premier problème, celui de l égalité de l accès aux soins Des mutations dans plus de 6000 gènes sont responsables de maladies héréditaires monogéniques Près de 2000 d entre eux sont maintenant connus Un diagnostic est proposé pour moins de 1000 d entre eux, et encore au niveau de l Europe

31 Un premier problème, celui de l égalité de l accès aux soins Les maladies les plus rares n intéressent que quelques laboratoires en France Nombreux sont ceux qui ont besoin d un diagnostic moléculaire, mais celui-ci n est pas proposé Les laboratoires ont des approches différentes, souvent limitées aux mutations les plus fréquentes

32 Un premier problème, celui de l égalité de l accès aux soins Le problème de l hétérogénéité de la qualité du diagnostic va s amplifier Car les technologies sont de plus en plus coûteuses et seuls quelques rares laboratoires disposeront de l équipement nécessaire. Il est vraisemblable qu il faudra de nombreuses années pour que les coûts deviennent accessibles à tous les laboratoires Les compétences nécessaires seront rares Le contexte économique est défavorable et les réformes de l hôpital vont aggraver les choses (T2A)

33 Un second problème est celui du risque de discrimination Les connaissances sur les mutations causales et sur les différentes variantes vont croître considérablement. La prédiction sera de plus en plus précise Cela entraîne un risque d une utilisation par : Les assureurs Les employeurs

34 Une tentative de réponse Les lois dites de Bioéthique

35 Conséquences pour les laboratoires Un encadrement très strict

36 La loi d août 2008 Le décret est enfin paru le 6 avril 2008

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