MINISTÈRE DE l'enseignement supérieur ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES. Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE

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1 MINISTÈRE DE l'enseignement supérieur ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présentée par Zeyni MANSUROGLU pour l obtention du diplôme de l École Pratique des Hautes Études Etude de la distribution subnucléaire de la protéine HP1a vis-à-vis de l hétérochromatine péricentromérique lors du passage de prolifération à quiescence. Soutenu le 10 décembre 2010 devant le jury suivant : Mme Thi My Anh Neildez Mme Claire Vourc h Mr Stéphane Ronsseray Présidente Rapporteur Examinateur Mémoire préparé sous la direction de : Mme ELIETTE BONNEFOY eliette.bonnefoy@parisdescartes.fr Laboratoire de : FRE 3235/CNRS Directeur : PHILIPPE DJIAN. Régulation de la transcription et maladies génétiques 45 rue des Sts Pères Paris et de Mme FLORE RENAUD flore.renaud@uvsq.fr Laboratoire de Génétique et Biologie Cellulaire FRE 3216 CNRS/UVSQ/EPHE Directeur : BERNARD MIGNOTTE EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Bâtiment Fermat - Maison 4 (2éme étage) Université de Versailles St Quentin 45, Avenue des Etats-Unis Versailles cedex ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 ETUDE DE LA DISTRIBUTION SUBNUCLÉAIRE DE LA PROTEINE HP1a VIS-À- VIS DE L HETEROCHROMATINE PERICENTROMÉRIQUE LORS DU PASSAGE DE PROLIFÉRATION À QUIESCENCE. MANSUROGLU ZEYNI Soutenu le 10 décembre 2010 Les cellules eucaryotes doivent compacter une quantité importante d ADN au sein de leur noyau sous forme de chromatine. La chromatine n est pas une structure figée mais au contraire une structure dynamique qui intervient dans la régulation de différentes activités du génome (transcription, réplication, réparation). Dans ce travail, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à la structure de l hétérochromatine péricentromérique constituée de séquences répétées g-satellite (g-sat), de la protéine HP1a ( Heterochromatin protein 1a) et d ARNs non codants. L hétérochromatine péricentromérique joue un rôle fondamental pour la bonne ségrégation des chromosomes. La présence de HP1a dans cette structure est nécessaire pour leurs fonctions. Dans ce projet nous avons analysé les changements de distribution de la protéine HP1a lors du passage de prolifération à quiescence. Lors d un travail précédent, nous avions mis en évidence au laboratoire une dispersion de la protéine HP1a, par rapport aux amas d hétérochromatine péricentromérique, corrélée à la mise en quiescence des cellules murines NIH 3T3 (Shestakova et al. 2004). L objectif de ce travail a été d identifier les mécanismes responsables de la dispersion de la protéine HP1a associée à l établissement de la quiescence et d étudier la réversibilité du phénomène. Au cours de ce projet nous avons pu démontrer par immunofluorescence couplée à l hybridation in situ ainsi que par immunoprécipitation de la chromatine que la dispersion réversible de la protéine HP1a, observée dans les cellules quiescentes, n était pas corrélée à des variations des modifications post-traductionnelles des extrémités N-terminales des histones susceptibles d affecter l affinité d HP1a aux séquences g-satellite. Le rôle d un ARN dans l organisation d HP1a en amas avait été suggéré par Maison et al. (2002). Au cours de cette étude, nous avons pu montrer par PCR quantitative qu il existait une étroite corrélation non seulement entre la diminution de la transcription des séquences g-sat et la dispersion d HP1a lors de l établissement de la quiescence mais aussi entre la réorganisation de HP1a en amas et la ré-augmentation du taux des ARNs g-sat lorsque les cellules sortaient de quiescence. En nous appuyant sur les résultats obtenus nous avons proposé un modèle qui décrit l organisation d HP1a dans les cellules en prolifération et en quiescence en faisant intervenir les transcrits des séquences g-sat. A partir des résultats que nous avons obtenus et des données de la littérature nous émettons l hypothèse que la redistribution de la protéine HP1a, en dehors des amas d'hétérochromatine péricentromérique, pourrait être nécessaire pour réprimer des gènes essentiels pour la progression du cycle cellulaire. MOTS-CLÉS : hétérochromatine péricentromérique, HP1a, ARNs g-satellite, quiescence, prolifération. Remerciements Je tiens à remercier tout d abord Mme Claire Vourc h et Mr Stéphane Ronsseray d avoir accepté d être rapporteur et examinateur de ce travail. Je remercie également Mme Thi My Anh Neildez qui me fait l honneur de présider ce jury. Un grand merci à mes tuteurs pédagogique Mr Bernard Mignotte ainsi qu à Mme Flore Renaud EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 pour leurs conseils et leurs aides pendant tout mon cursus à l EPHE. Je tiens ensuite à remercier Mr Philippe Djian, directeur du laboratoire dans lequel j ai passé ces huit dernières années, de m avoir soutenu dans la réalisation de ce projet qui me tenait à cœur tout en étant technicienne dans le laboratoire. Je tiens à remercier plus particulièrement mon tuteur scientifique le Dr Eliette Bonnefoy. Eliette, je suis arrivée il y a huit ans dans ton équipe en tant que jeune technicienne, tu m as beaucoup appris tant au niveau scientifique qu au niveau humain. Aujourd hui grâce à tes enseignements, tes encouragements et ton soutien j ai pu finaliser ce projet. Tu as également été présente dans les moments importants de ma vie et tu as toujours cru en moi et pour tout cela je t adresse mes profonds remerciements. Un grand merci à Elena avec qui tout ce travail à commencé, c est toi qui m a initié à la microscopie à fluorescence et confocale. Malgré l éloignement tu n as cessé de suivre ce travail et de nous conseiller. Merci Thibaut pour ton aide, tes conseils et les corrections que tu as su me donner. Merci aussi pour toutes les discussions et les bons moments passés en ta compagnie. Merci Houda d avoir partagé le box pendant toutes ces années avec moi et pour tous les moments qui se sont déroulés dans la bonne humeur. A ce jour personne n a pris ta place dans le box!! Merci également à Sylvie pour tous tes conseils scientifiques et corrections et ton aide dans tous les domaines et à tout moment. Merci à Robert pour son aide avec la technique de ChIp. Je remercie tous les membres ou ex-membres du laboratoire avec qui je collabore directement pour leur confiance, leur aide technique scientifique et humaine : Amandine, Fabrice, Guylaine, Pierre, Isabelle, Bernard, Selvy, Brigitte, Françoise, Charbel et Sophie. Merci à tous les «djeunes», Cyril, William, Anna, Diala, Alexandra, Amalia, Julien, Martin, Joëlle et GG pour tous les moments de convivialité et merci plus particulièrement à Joëlle pour m avoir appris la qpcr et à Cyril et William mes informaticiens préférés. Je voudrais aussi remercier nos collaborateurs de l unité U837 à Lille, notamment à Mme Marie Galas, pour sa bonne humeur et pour nous avoir fourni les cultures primaires de neurones de souris. Ce projet de diplôme d ingénieur a été mené à bien grâce au soutien de toute ma famille, Merci Maman et Papa d avoir cru en moi de m avoir encouragée et soutenue depuis le début. Mais aussi Merci à mes frères et sœur Meryem, Berkan et Emmanuel de votre écoute et de votre présence et de m avoir supportée durant toutes ces années jour après jour. EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 Enfin et non des moindres un grand merci à mon mari Musa, pour son soutien, sa présence et son aide au quotidien. Je t aime mon amour. A ma petite fille qui a été présente en moi pendant toute la rédaction de mon mémoire, j ai hâte de te voir!!! Liste des abréviations A C _ AcK9H3 : acétylation de la lysine 9 de l histone H3 _ AcK14H3 : acétylation de la lysine 14 de l histone H3 _ ADN : acide désoxyribunucléique _ Ago 1: Argonaute 1 _ ARN: acide ribonucléique _ A/T: adénine/thymine _ ATP: adénosine triphosphate _ C: Carboxy EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 _ CAF1: Chromatin Assembly Factor 1 _ CenH3: Centromeric Histone H3 _ CenPA : Centromeric Protein A _ ChIP : Chromatin immunoprecipitation _ ChIP-seq: chromatin immunoprecipitation - sequencing _ chip: puce à ADN _ Cnp1 : Centromere protein 1 _ Cnt : Central core region _ CT : séquences centromériques I F H I J K L M N _ Imr : Innermost repeat _ FISH : fluorescent in situ hybridization _ H : histone _ HAT : Histone Acetyl Transférase _ HDAC : Histone déacétylase _ HMT : Histone MéthylTransférase _ HP1 : heterochromatin protein 1 _ IF : Immunofluorescence _ ImmunoDNAFISH Immunoofluorescence couplée à la fluorescent in situ hybridization _ JMJD2 Jumonji C Domain containing protéin 2 _ JHDM1 Jumonji C Domain containing Histone Demethylase 1 _ K : Lysine _ LSD1 : Lysine Spécific Demethylase 1 _ Met : Méthyl _ MSK1: Mitogen and stress Activated kinase 1 _ N Amino _ NLS: Nuclear localization signal P _ P: phophorylation _ PBS: phosphate buffered saline _ PEV: position effect variegation _ PCR: polymerase chain reaction _ PCT: séquences péricentromériques EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 Q R S T _ Q-PCR : quantitative polymerase chain reaction _ RNase: ribonucléase _ RISC: RNA induced Silencing Complexe _ RITS: RNA induced Transcriptional gene Silencing _ RT-PCR : reverse transcription polymerase chain reaction _ Ser10phH3 Sérine 10 phosphorylée de l histone H3 _ S. pombe : Schizosaccharomyces pombe _ Tas3 : Targeting complexe subunit 3 _ Thr : Threonine _ TIF : Transcription Initiation Factor _ 3MetK9H3 : triméthylation de la lysine 9 de l histone H3 _ 2MetK9H3 : diméthylation de la lysine 9 de l histone H3 Table des Matières INTRODUCTION I... Organisation structurale de la chromatine. 1. Nucléosome : unité de base de la chromatine. 2. Les modifications post-traductionnelles des histones. L acétylation La méthylation La phosphorylation 3. Le code des Histones. II... Organisation fonctionnelle de la chromatine : l hétérochromatine. L euchromatine L hétérochromatine 1. Principaux constituants de l hétérochromatine. EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 a. Hétérochromatine Protéine 1 (HP1). b. Les séquences d ADN répétées dans l hétérochromatine. c. Les séquences centromériques et péricentromériques chez S.pombe d. Les séquences centromériques et péricentromériques chez l Homme. e. Les séquences centromériques et péricentromériques de Souris. III... La transcription des séquences centromériques et péricentromériques. 1. Chez la levure S.pombe. 2. Chez l Homme. 3. Chez la Souris 4. Rôle des transcrits péricentromériques chez les mammifères. EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 INTRODUCTION I. Organisation structurale de la chromatine. Chaque cellule eucaryote doit compacter dans le noyau une quantité importante d ADN. La compaction de l ADN nécessite une structure complexe appelée chromatine constituée d ADN, de protéines histones et de protéines non-histones (Grewal and Jia 2007). Cette structure est une structure dynamique qui permet non seulement la compaction et l organisation du matériel génétique dans le noyau de cellules eucaryotes mais intervient aussi dans la régulation de différentes activités du génome (transcription, réplication, réparation). Dans le noyau des cellules en interphase l ADN est organisé en zones de chromatine dense appelée hétérochromatine, et une zone de chromatine plus lâche appelée euchromatine. 1. Nucléosome : unité de base de la chromatine. Le nucléosome est la structure de base de la chromatine. Le cœur du nucléosome est constitué d un octamère d histones autour duquel s enroule la molécule d ADN avec environ 146 EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 pb par nucléosome. L octamère d histones est formé par l assemblage d un tétramère d histones (H3-H4)2 entouré de part et d autre par un hétérodimère (H2A-H2B). Les nucléosomes sont reliés entre eux par l ADN de liaison (linker). Lors de la formation du nucléosome, l ADN s enroule autour de l octamère d histones, les contacts entre l ADN et l octamère d histones se font via le petit sillon. La chromatine est ainsi structurée en une fibre de 10nm de diamètre qui consiste en un enchaînement de nucléosomes, pour former une structure dite en «collier de perle». L histone H1, appelée histone de liaison («linker»), se positionne entre les nucléosomes établissant des contacts aussi bien avec les nucléosomes qu avec l ADN linker permettant un niveau de compaction supplémentaire en passant d une fibre de 10 nm à une fibre de 30 nm. L organisation de l ADN autour des nucléosomes donne lieu à une structure dynamique. Les nucléosomes ne sont pas figés et peuvent dans la plupart des cas se déplacer le long de l ADN en respectant le pas de l hélice. Néanmoins, dans certains cas les nucléosomes peuvent perdre leurs mobilités et donner lieu à des structures plus «fermées» souvent associées aux formes denses de la chromatine. Le passage d une forme fermée à une forme ouverte de la chromatine et vice et versa peut influencer plusieurs processus moléculaires faisant intervenir la molécule d ADN, en particulier la transcription. Dans le cas du passage d une forme fermée de la chromatine à une forme ouverte, un processus de remodelage de la chromatine est nécessaire pour permettre le déplacement du nucléosome. Il s agit en général d un processus fortement régulé faisant intervenir plusieurs acteurs dont un complexe multiprotéique ATP-dépendant directement responsable du déplacement du nucléosome. Les histones H2A, H2B, H3 et H4, appelées histones cœur sont des petites protéines ayant un poids moléculaire compris entre 12 et 16 kda, basiques car riches en résidus lysines «K» et arginine «R», très conservées au cours de l évolution. Elles sont formées d une partie globulaire de nature hydrophobe qui est la région la plus conservée appelée motif histone ou «histone fold». Ce domaine qui comprend trois hélices alpha est impliqué dans la dimérisation des histones. Contrairement au domaine globulaire, les extrémités amino (N) et carboxy(c)- terminales de ces histones sont moins conservées et non-structurées. Ces extrémités sont exposées à la surface des nucléosomes et sont le site de modifications post-traductionnelles que je décrirai par la suite. La synthèse des histones cœur se déroule pendant la phase S du cycle cellulaire juste avant la réplication de l ADN. Lors de la réplication, il est nécessaire de doubler la quantité d histones pour permettre la compaction de l ADN néo-synthétisé. Au moment de la réplication il y a donc deux types d histones, les histones préexistantes et des histones néo-synthétisées. La plupart des histones nouvellement synthétisées sont incorporées à l ADN de manière étroitement coordonnée avec la réplication pendant la phase S en faisant intervenir des facteurs tel que CAF1 (Chromatin Assembly Factor 1) et PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Il existe aussi des histones de remplacement également appelées variantes d histones (Ray-Gallet et al. 2005),(Henikoff and Ahmad 2005). Les variantes d histones sont minoritairement représentées et certaines peuvent être incorporées dans la chromatine indépendamment de la synthèse d ADN. Les variantes les mieux caractérisées sont celles des histones H2A et H3. Il existe 6 variantes d histones H2A. Parmi ces variantes, H2A.Z joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire précoce chez les mammifères (Faast et al. 2001). Il existe 4 variantes de l histone H3 : H3.1, H3.2, H3.3 et CenH3. Les variantes H3.1 et H3.2 sont exprimées durant la phase S par EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 contre la variante H3.3 est exprimée pendant toutes les phases du cycle cellulaire. Chez la Drosophile et l Homme, la variante H3.3 a été observée associée aux zones actives transcriptionnellement (Ahmad and Henikoff 2002), (Loyola and Almouzni 2007). L incorporation dans le nucléosome d un dimère portant H3.3-H4 à la place de H3-H4 se fait via un mécanisme indépendant de la réplication, couplé à une forte activité transcriptionnelle faisant intervenir une protéine chaperonne appelée HIRA (Ray-Gallet et al. 2002), (Henikoff and Ahmad 2005). Il semblerait que chaque histone de remplacement possède un mécanisme d incorporation particulier faisant intervenir un complexe protéique spécifique. Il a été observé que l incorporation de H3.3 permettait de remplacer une histone H3 méthylée sur la lysine 9 (MetK9H3) correspondant à un signal d inactivation de la transcription. Contrairement à H3, H3.3 ne peut pas être méthylée sur la lysine 9. Ainsi il à été suggéré que le remplacement de H3 par H3.3 pouvait permettre de passer d un état de répression de la transcription associé à la présence de metk9h3 vers un état d activation de la transcription. La CENtromérique Protéin A (CENP-A) ou CenH3 est également une variante de l histone H3. Chez les cellules eucaryotes elle est localisée spécifiquement dans les régions centromériques, où elle semble essentielle à la structure et à la fonction des centromères en participant directement à la formation d un kinetochore actif durant la mitose (Sullivan 2001). 2. Les modifications post-traductionnelles des histones. Comme mentionné antérieurement, l organisation de la chromatine n est pas une structure figée. Il a été démontré que les cellules eucaryotes possèdent un système de remodelage de la chromatine faisant intervenir entre autres des enzymes capables de modifier posttraductionnellement les extrémités N-terminale des histones. En fonction de la modification présente, le degré de compaction de l ADN, l accessibilité d un segment de chromatine à certaines protéines ainsi que la mobilité des nucléosomes peut être altérée. Les modifications les plus étudiées à ce jour sont l acétylation, la méthylation, la phosphorylation, mais d autres modifications ont également été décrites comme l ubiquitination, la sumoylation, la glycosylation ou la biotynilation. Il s agit de modifications covalentes, ciblées sur des résidus spécifiques de chaque histone catalysées par des enzymes spécifiques et généralement réversible. Ces modifications jouent un rôle très important dans le remodelage de la structure de la chromatine et peuvent influencer la régulation des fonctions cellulaires comme la transcription, la réplication et la réparation de l ADN. Je vais décrire dans cette partie les principales modifications post-traductionnelles des extrémités N-terminales des histones du cœur de nucléosome : L acétylation Les histones sont acétylées exclusivement sur les lysines (K) à l aide d Histone d AcetylTransférases (HATs). Les HATs sont peu spécifiques. Une même HAT peut cibler aussi bien l histone H3 que H4 mais aussi différents résidus lysines. Ainsi par exemple, PCAF acétyle les résidus lysines K9 et K14 des histones H3 ainsi que la lysine K8 de l histone H4 (Sterner and Berger 2000). Les HATs font souvent partie de complexes multiprotéiques impliqués dans l activation de la transcription. L acétylation des lysines résulte de la formation d une liaison covalente entre un groupement acétate et une lysine conduisant ainsi à neutraliser la charge positive du résidu lysine. In vivo, cette acétylation diminue l interaction des nucléosomes entre eux EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 et permet ainsi de décompacter la chromatine (Sterner and Berger 2000), (Shahbazian and Grunstein 2007). De plus, en neutralisant la charge positive des lysines, l acétylation favorise la liaison des protéines à l ADN qui sont pour la plupart chargées positivement et dont l affinité peut être diminuée si les extrémités N-terminales sont aussi chargées positivement. L acétylation des lysines peut être rapidement reversée par des Histones DesACétylases (HDACs). Il existe plusieurs classes de HDACs (classe I,II,III). Chez les mammifères, les HDACs de classe I et II fonctionnent au sein de gros complexes protéiques impliqués dans la répression transcriptionnelle. L Acétylation des extrémités N-terminales est généralement associée à une chromatine noncondensée, «ouverte», alors que la désacétylation est associée à un état condensé de la chromatine, «fermé». Dans la plupart des cas, les HATs et HDACs ne se fixent pas directement à l ADN mais sont recrutées sur celui-ci via des facteurs soit activateurs de la transcription dans le cas des HATs soit répresseurs de la transcription dans le cas des HDACs. Ainsi, il a été démontré que les HATs et HDACs jouent un rôle important dans la régulation de l expression des gènes et sont considérées respectivement comme des co-activateurs ou co-represseurs de la transcription (Wolffe and Hayes 1999). La méthylation La méthylation des histones se fait sur les résidus lysines (K) et arginines (R) à l aide des Histones MethylTransférases (HMTs). Ces résidus peuvent être mono, di ou triméthylés. Les HMTs sont très spécifiques en comparaison des HATs, i) vis-à-vis de l histone, ii) vis-à-vis des résidus à méthyler ainsi que iii) vis-à-vis du nombre de groupements méthyles à fixer. Par exemple, chez l Homme, l HMT Suv39H1 permet de triméthyler spécifiquement la lysine 9 de l histone H3 à partir de la forme diméthylée de H3 et l HMT SUV4-20H1 triméthyle spécifiquement la lysine 20 de l histone H4 (Lachner and Jenuwein 2002). Certaines méthylations sont associées à la répression de la transcription (triméthyle K9H3, K27H3, K20H4) et certaines méthylations sont associées à l activation de la transcription (mono, di et triméthyle K4 H3). Les méthylations sont très stables et elles ont longtemps été considérées comme irréversibles. Néanmoins, des études récentes (Whetstine et al. 2006) ont montré qu il existait également des déméthylases pour la plupart spécifiques de chaque méthylation. La démethylase LSD1 a été la première déméthylase découverte (Shi et al. 2004), (Chen et al. 2006). Elle permet de deméthyler les formes mono ou diméthylées de la lysine 4 de l histone H3 et participe à la répression de la transcription. Depuis, d autres déméthylases ont été identifiées. Pour la plupart elles sont très spécifiques de telle sorte que pour un même résidu, le passage d un état triméthylé à un état diméthylé n implique pas la même histone déméthylase que le passage d un état diméthylé à un état monométhylé (Whetstine et al. 2006), (Shi 2007). La famille de déméthylase JMJD2 a pour substrat les lysines triméthylées de l histone H3 alors que la famille JHDM1 à pour substrat les formes mono et dimethylées des histones H3 (Whetstine et al. 2006). La phosphorylation La phosphorylation des histones a lieu sur les résidus serines (Ser) et thréonines (Thr) à l aide de kinases. Les histones sont phosphorylées sur plusieurs résidus, comme Ser10H3, Ser28H3 et Thr11H3 ainsi que Ser1H2A, Ser1H4 et Ser14H2B. Différentes kinases peuvent phosphoryler les mêmes résidus. Ainsi, Ser10H3 est phosphorylée par MSK1 (Mitogen and Stress-activated Kinase) lors de l activation de la transcription et par la kinase Aurora B lors de la EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 condensation de la chromatine pendant la mitose (Crosio et al. 2002). La phosphorylation d un même résidu peut donc avoir deux rôles différents. Elle peut être combinée à d autres modifications comme la méthylation ou l acétylation et jouer un rôle important dans des phénomènes impliqués dans le cycle cellulaire ou dans l activation de la transcription (Pérez- Cadahía, Drobic and Davie 2009). La phosphorylation des histones peut être également reversée par des phosphatases. 3. Le code des Histones. Au sein d un même nucléosome différentes modifications post-traductionnelles peuvent être présentes simultanément aussi bien sur l extrémité N-terminale d une même histone que sur des extrémités N-terminales de différentes histones appartenant au même nucléosome. Les combinaisons de plusieurs modifications post traductionnelles des histones créent un état particulier de la chromatine. Les formes 3MetK9H3 et K27H3 sont souvent associées à un état desacétylé des histones par contre les formes mono-di et triméthylée de K4H3 sont associées à un état acétylé des histones. Lors de la mitose, la forme phosphorylée Ser10H3 est combinée avec la forme acétylée de K14H3 (Mateescu et al. 2004). Certaines combinaisons de modification «antagonistes» ont été observées comme par exemple chez les mammifères la forme méthylée de K4H3 (associée à l activation de la transcription) et la forme méthylée de K27H3 (associée à la répression de la transcription) (Bernstein et al. 2006). Cette combinaison «antagoniste» a été associée à un état de «pause» transcriptionnelle dans le cas de gènes régulés pendant la différenciation. Dans certains cas, un même résidu lysine peut être non seulement acétylé mais aussi méthylé. Mais dans ce cas ces deux modifications sont exclusives et ne peuvent pas avoir lieu en même temps sur le même résidu. Le résidu K9H3 par exemple peut être soit acétylé (état associé à l activation de la transcription) soit méthylé (état associé à la répression de la transcription). Le passage d un état acétylé à un état méthylé nécessite l action préalable d une HDAC. Différentes modifications post traductionnelles peuvent donc coexister et formeraient un code capable de modifier l expression de certains gènes dans un type cellulaire donné, à un moment donné du cycle cellulaire, à un stade précis du développement ainsi qu en réponse à un stimulus externe (hormone, stress, dommage à l ADN) et réguler ainsi différentes activités du génome. Ce code a été appelé «code des histones» qui viendrait s ajouter au code génétique (Jenuwein and Allis 2001). Ces modifications post-traductionnelles des histones sont également appelées modifications épigénétiques car elles sont susceptibles d entraîner des changements dans l expression de certains gènes sans altérer la séquence d ADN des gènes en question et ceci de façon héréditaire sur plusieurs générations pour un type cellulaire donné (Jenuwein and Allis 2001). Pour permettre la lecture du code des histones il existe des domaines protéiques qui sont capables de reconnaître de manière spécifiques les modifications post-traductionnelles des histones. Le bromodomaine reconnaît spécifiquement les acétylations. En ce qui concerne les méthylations des histones, chaque marque mono-di ou triméthylée de la lysine est reconnu spécifiquement par un domaine protéique particuliers comme par exemple le chromodomaine de HP1 reconnaît spécifiquement la triméthylation de K9H3 et la protéine contenant des répétitions EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 WD, comme WDR5, reconnait spécifiquement les formes di et triméthylé de K4H3 (Wysocka et al. 2005). Récemment les techniques d études à grande échelle (CHIP, CHIP on chip, CHIP seq) ont permis d analyser la répartition des modifications épigénétiques sur l ensemble de génome. Ainsi il à été mis en évidence que les acétylations des lysines K9 et K14H3 sont présentes au niveau des promoteurs et des enhanceurs des gènes actifs transcriptionnellement. La localisation des méthylations des histones dans l ensemble du génome est plus complexe que celles des acétylations. En effet certaines méthylations (mono-di et triméthyle K4H3) peuvent être présentes au niveau des promoteurs et des enhanceurs des gènes actifs transcriptionnellement alors que d autres formes triméthylées (de K9H3 et K20H4) sont localisées au niveau des gènes réprimés, des centromères et des télomères. II. Organisation fonctionnelle de la chromatine : l hétérochromatine. La chromatine existe sous deux formes : l euchromatine et l hétérochromatine. Ces formes diffèrent par leur structure, leur teneur en gène, les modifications post-traductionnelles de leurs histones, leur activité transcriptionnelle et leur localisation subnucléaire. L euchromatine L euchromatine est la forme globalement décondensée de la chromatine. Elle contient de nombreux gènes, très peu de séquences répétées et est associée à un état potentiellement actif transcriptionnellement. En effet, l euchromatine de part son état décondensé de la chromatine est plus accessible à la machinerie transcriptionnelle. Les nucléosomes sont plus mobiles d où un espacement irrégulier dans l euchromatine. Les modifications post-traductionnelles des histones associées à l euchromatine sont entre autres, l acétylation des lysines mais aussi la méthylation de la lysine 4 de l histone H3 (K4H3). Néanmoins, localement au niveau de certains gènes des modifications post traductionnelles des histones associées à la répression de la transcription (3MetK9H3) peuvent être présentes. La réplication de l euchromatine précède la réplication de l hétérochromatine. L hétérochromatine L hétérochromatine quant à elle est la forme condensée de la chromatine et est localisée principalement en périphérie nucléaire et autour du nucléole. Contrairement à l euchromatine, elle contient très peu de gènes et beaucoup de séquences répétées. Elle possède des modifications post-traductionnelles caractéristiques telles que la forme triméthylée de la lysine 9 de l histone H3 (3MetK9H3) et une hypoacétylation des résidus lysines. Il existe deux formes d hétérochromatine, la forme constitutive et la forme facultative. L hétérochromatine facultative est une zone de répression transitoire et réversible où des séquences codantes peuvent être maintenues dans un état transcriptionnellement inactif en étant compactées en hétérochromatine. Ceci pouvant varier selon le stade de développement ou le type cellulaire considéré (Henikoff and Ahmad 2005). Au contraire, l hétérochromatine constitutive est une forme stable et irréversible. Elle contient de nombreuses séquences répétées telles que les séquences centromériques, EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 péricentromériques et télomèriques. Elle joue un rôle structural (mitose) mais elle est aussi impliquée dans la répression transcriptionnelle des gènes. La capacité de l hétérochromatine à réprimer l expression de certains gènes positionnés en proximité a d abord été mise en évidence chez la Drosophile. En effet, chez la Drosophile, il a été observé un phénomène d extinction de l expression des gènes de l euchromatine lorsque ceux-ci sont placés à proximité de l hétérochromatine constitutive suite à des remaniements chromosomiques ou des translocations. Ce phénomène, appelé le phénomène de «Position Effect Variegation» (PEV) est décrit : Le gène white (w+), responsable de la couleur rouge des yeux de la Drosophile, est normalement localisé et exprimé dans l euchromatine. Lorsque suite à un réarrangement chromosomique, le gène white (w+) est placé à proximité de l hétérochromatine la coloration rouge des yeux est partiellement perdue ceci est due à une inhibition de l expression du gène w+. C : centromère, T : Telomère 1. Principaux constituants de l hétérochromatine. a. Hétérochromatine Protéine 1 (HP1). L Hétérochromatine Protéine 1 (HP1) est une protéine non histone de 25KDa qui participe à la formation et au maintien de l hétérochromatine constitutive. Lors de recherches menées chez la Drosophile, il a été montré que le gène codant pour la protéine HP1 agissait comme un suppresseur de PEV. Par la suite, HP1 a été caractérisée comme l un des constituants majeur de l hétérochromatine constitutive. La protéine HP1 est très conservée au cours de l évolution, de S.pombe jusqu à l Homme. La famille des protéines HP1 est codée par une classe de gènes appelée «chromobox genes» (CBX) chez les mammifères et Su(var) (Supressor of Variegation) chez la Drosophile. Il existe 3 isoformes de la protéine HP1 (HP1a,b,g) chez l Homme et la Souris, ainsi que HP1a, b et c chez la Drosophile. Chaque forme est codée par un gène différent : CBX5, CBX1, CBX3 respectivement chez l Homme, Cbx5, Cbx1, Cbx3 respectivement chez la souris (Lomberk, Wallrath and Urrutia 2006b) ainsi que Su(var)2-5 chez la Drosophile (Vermaak and Malik 2009). Chez la levure S.pombe, il existe une seule isoforme d HP1 appelée Swi6. La distribution de la protéine HP1 dans le noyau varie selon l isoforme: HP1a est localisé au niveau de l hétérochromatine constitutive (centromérique et telomérique), HP1b est localisée aussi bien au niveau de l hétérochromatine centromérique que de l euchromatine et HP1g est observée principalement au niveau de l euchromatine (Minc, Courvalin and Buendia 2000). La famille des protéines HP1 possède un domaine appelé «chromodomain» au niveau de l extrémité N-terminale et un «chromoshadow domaine» au niveau de l extrémité C-terminale. L étude de la structure tridimensionnelle par résonnance magnétique et cristallographie aux rayons X des protéines HP1 (Ball et al. 1997),(Brasher et al. 2000) a permis de mettre en évidence que le «chromodomaine» et le «chromoshadow domaine» sont des domaines globulaires reliés entre eux par une région charnière dite «hinge domain». Le «chromodomain» possède trois feuillets béta et une hélice alpha organisés de telle sorte que cette structure forme une poche hydrophobe. Le chromodomaine est responsable de la liaison d HP1 aux formes di et triméthylées de la lysine 9 de l histone H3 qui sont des marques épigénétiques liées à la répression transcriptionnelle, très concentrées au niveau des séquences EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 péricentromériques et télomériques (Nielsen et al. 2002, Lomberk et al. 2006b). Le «chromo-shadow domain» possède trois feuillets béta et deux hélices alpha. Il est impliqué dans les interactions protéine-protéine via la reconnaissance de la séquence consensus PxVxL (P : Proline, V : Valine, L : Leucine et x : n importe quel acide aminé), présente dans la séquence du «chromo-shadow domain» de la famille de protéines HP1 (possibilité de formation d homo ou d hétérodiméres de HP1) mais aussi de plusieurs autres protéines interagissant avec HP1 (Smothers and Henikoff 2000);(Lomberk et al. 2006b). Ainsi, HP1 interagit directement ou indirectement avec de nombreuses protéines non histones ce qui lui permet de participer à la formation de nombreux complexes multiprotéiques (Eissenberg and Elgin 2000). Les protéines identifiées comme interagissant avec HP1 ont des fonctions cellulaires différentes, telle que la régulation de l expression de gènes (facteurs de transcription : TIF1a et b), la réplication de l ADN (CAF1), la participation à l architecture nucléaire (INCENP INner CENtromere Protéine, protéine associée avec le centromère des chromosomes) et le remodelage de la chromatine (HMT, Suv39h1). Le «hinge» domaine ou domaine charnière qui sépare le «chromodomain» du «chromoshadow domain» possède entre autre une séquence de localisation nucléaire (NLS) et pour HP1a un site d interaction avec l ARN (Muchardt et al. 2002) et l ADN (Zhao et al. 2000). Cette région est beaucoup moins conservée que les précédentes et varie entre les différents membres de la famille. Cette région est le siège de modifications post-traductionnelles qui peuvent affecter la localisation, les interactions ainsi que la fonction des différents HP1s (Lomberk et al. 2006a). Le rôle le plus connu d HP1a est sa participation à la formation de l hétérochromatine constitutive non seulement par son interaction avec la forme triméthylée de K9H3 (Bannister et al. 2001a), (Nielsen et al. 2002) mais aussi par le recrutement de l histone méthyltranférase (Suv39H1 chez l Homme, Suv39h1 chez la Souris et CLr4 chez S.pombe) responsable de la triméthylation spécifique de K9H3 au niveau des séquences péricentromériques. Il a été montré que Suv39h1 interagit directement avec le chromoshadow domain de la protéine HP1a (Yamamoto and Sonoda 2003) de telle sorte que HP1a, via son interaction avec Suv39h1, permet la propagation de la méthylation des K9H3 et donc de l hétérochomatinisation. Chez la Drosophile, HP1a a été montrée comme ayant aussi un rôle au niveau des télomères, en particulier concernant le «capping» des telomères et ceci via le «hinge domain» d HP1a qui se lie aux séquences terminales des chromosomes (Perrini et al. 2004). Suite à cette fixation d HP1a aux séquences télomériques, SU(VAR)3-9 (HMT) serait recrutée pour permettre la méthylation de K9H3. L interaction de HP1a avec la forme méthylée de K9H3 via le chromodomain d HP1a permet d amplifier le phénomène et induire l hétérochomatinisation au niveau des télomères. Plus récemment des études ont montré un rôle de la famille des protéines HP1 dans la réparation de l ADN (Dinant and Luijsterburg 2009). HP1 faciliterait la réparation de l ADN en réorganisant la chromatine, ceci pourrait impliquer l interaction de HP1 phosphorylée avec d autres protéines, contenant le peptide PxVxL, impliquées dans la réparation de l ADN. b. Les séquences d ADN répétées dans l hétérochromatine. Nous avons vu que l hétérochromatine est pauvre en gènes et riche en séquences répétées : EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 centromériques, péricentromériques et télomériques. Dans ce chapitre nous allons nous intéresser aux séquences centromériques et péricentromériques qui constituent la majeure partie de l hétérochromatine constitutive. Les centromères sont visibles comme une constriction sur chaque chromosome et servent de site d attachement au fuseau mitotique (séquences centromériques) et de site de liaison des cohésines (séquences péricentromériques). Etant directement impliqué dans la mitose pour la bonne ségrégation des chromosomes, le centromère joue un rôle fondamental lors de la division des cellules eucaryotes. Les centromères sont constitués d une partie centrale qui contient les séquences centromériques (CT) qui sont elles entourées de part et d autre de séquences péricentromériques (PCT). Au niveau des séquences centromériques, l hétérochromatine est associée à une structure protéique particulière, le kinétochore, par laquelle les chromosomes se fixent aux fuseaux mitotiques et méiotiques pour permettre le positionnement des chromosomes sur le plan équatorial et leur migration aux pôles de la cellule. La variante de l histone H3, spécifique de la région centromérique, appelé CenH3 de manière générale, CENP-A chez les mammifères, Cnp1 chez S.pombe (Palmer et al. 1991) est essentielle à la formation du kinétochore (Choo 2001). La présence de CenH3 au niveau des séquences CT entraîne le recrutement au niveau du centromère de plus de 40 protéines, dont le complexe multiprotéique qui forme le kinétochore. La perte de la protéine CenH3 au niveau des séquences CT empêche la formation d un centromère fonctionnel et provoque l arrêt du processus de mitose ainsi qu une létalité au stade embryonnaire précoce (Howman et al. 2000). Pendant l interphase, les séquences péricentromériques sont condensées et possèdent des marques épigénétiques qui leur sont spécifiques : un faible taux d acétylation des histones, triméthylation de K9H3 et de K20H4 et monométhylation de K27H3. Ces caractéristiques épigénétiques sont indispensables pour établir et maintenir l identité d un centromère fonctionnel. L organisation des séquences péricentromériques en hétérochromatine péricentromérique serait nécessaire pour permettre le recrutement d un complexe multiprotéique, la cohésine (constitué de 4 sous-unités), au niveau des régions péricentromériques. Après la réplication de l ADN, les cohésines permettent la cohésion des chromatides sœurs jusqu'à la séparation coordonnée de celles-ci pendant la transition de la métaphase à l anaphase. Les séquences centromériques et péricentromériques sont organisées sous forme d hétérochromatine constitutive et restent condensées tout au long du cycle cellulaire. Ces régions jouent un rôle très important dans la stabilité du génome des cellules eucaryotes. En interphase les centromères de plusieurs chromosomes se regroupent pour former les «chromocentres». (Henikoff and Dalal 2005), (Dalal 2009). Le centromère possède une fonction commune à toutes les cellules eucaryotes. Les séquences CT et PCT chez toutes les espèces sont constituées de séquences répétées également appelées séquences satellites. Néanmoins, les séquences d ADN constituants les CT et PCT varient d une espèce à une autre. De plus, chez l Homme des variations sont observées d un chromosome à un autre. Il n existe pas de séquence ADN CT et PCT unique qui serait commune et qui définirait les centromères de toutes les cellules eucaryotes. c. Les séquences centromériques et péricentromériques chez S.pombe. Chez la levure S.pombe, les séquences centromériques sont constituées d une zone centrale, EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 la «central core region» ou «cnt» qui est une séquence de 4kb d ADN non répétée, riche en AT entourée par les «innermost repeats» ou «imr». Les «imr» sont des séquences d environ 6kb répétées inversées uniques à chaque chromosome (Takahashi et al. 1992). La variante d histone CenH3 se lie au cnt et aux imr. Les séquences centromériques sont entourées par les séquences péricentromériques également appelées «outer repeats» composées de séquences répétées inversées dh (4.4kb) et dg (4.8kb). Ces séquences sont disposées tête bêche de façon symétrique par rapport au centromère (Wood et al. 2002). d. Les séquences centromériques et péricentromériques chez l Homme. Les séquences centromériques de cellules humaines sont composées de séquences répétées appelées alpha-satellites dont le l unité de répétition est constitué de 171 pb. C est sur les séquences alpha-satellites que se fixe la variante d histone CenH3. Les séquences péricentromériques de cellules humaines sont constituées de 3 types majeurs de séquences répétées : appelées satellites I, II et III. Les séquences satellites de type I sont composées d une alternance d unités de 17 à 25 pb et sont peu abondantes par rapport aux satellites II et III. Les satellites II et III sont constitués de répétitions du pentamère GGAAT, ces répétitions sont espacées par des séquences spécifiques CATCATCGA(A/G)T pour les satellites II et CAACCCGA(A/G)T pour les satellites III. La composition en séquences centromériques et péricentromériques est variable d un chromosome à un autre. e. Les séquences centromériques et péricentromériques de Souris. Les séquences centromériques de souris sont formées de répétitions en tandem de séquences «satellites mineurs» ou a-satellite de 120 pb, entourées de séquences «satellites majeures» ou g-satellites (g-sat) de 234 pb également répétées des milliers de fois. Les séquences péricentromériques sont riches en AT, s étalent sur 6Mb (par rapport à 600 Kb pour les séquences centromériques) et elles représentent 3% du génome murin. Les séquences CT et PCT sont les mêmes sur tous les chromosomes de la souris. III. La transcription des séquences centromériques et péricentromériques. Malgré leur localisation dans l hétérochromatine constitutive, les séquences centromériques et péricentromériques sont transcrites. La transcription ARN pol II dépendante de ces séquences en ARNs non codants a été décrite chez S.pombe, l Homme et chez la Souris. 1. Chez la levure S.pombe. Chez la levure S.pombe les régions péricentromériques («outers repeats») sont transcrites sous forme de petits ARNs non-codants (ARNnc) nécessaires à l établissement et au maintien de l hétérochromatine via un mécanisme semblable au mécanisme d ARN interférence (ARNi). Le mécanisme d ARN interférence fait intervenir un complexe ribonucléoprotéique composé d ARNs double brin de 20 à 25 nucléotides (siarn) capables d inhiber post-transcriptionnellement et spécifiquement l expression d un gène ayant une séquence homologue à celle des siarns (Fire et al. 1998). De nombreuses protéines sont impliquées dans le mécanisme d ARN interférence, EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 comme la ribonuclease III (Dicer), qui dégrade les ARNs double brins pour produire des ARNs guides de 22 nucléotides. Ces ARNs guide (siarn) sont pris en charge par un complexe multiprotéique appelé «RNA Induced Silencing Complexe (RISC)» qui cible et dégrade la séquence de l ARN messager ayant une séquence homologue de l ARN guide correspondant. Ce système de régulation à été appelé l interférence par l ARN. C est un mécanisme qui a été caractérisé chez la levure, les plantes, la Drosophile et plus récemment chez les mammifères. Chez S.pombe, un mécanisme similaire au mécanisme d ARN interférence a été décrit faisant intervenir un complexe ribonucléoprotéique appelé «RNA Induced initiation of Transcriptional gene Silencing» ou RITS (Verdel et al. 2004). Ce mécanisme joue un rôle dans l hétérochromatinisation. Le complexe ribonucléoprotéique RITS est composé de trois protéines Ago1, Tas3 et Chp1 et un siarn. La protéine Argonaute Ago1 permet la liaison du complexe au siarn, Chp1 possède un chromodomaine ce qui lui permet de se lier à la forme 3MetK9H3 et à la protéine Tas3 (targeting complexe subunit 3) qui jouerait un rôle important dans la localisation du complexe RITS au niveau des séquences PCT. Les siarn associés au complexe RITS sont issus de la transcription de l hétérochromatine en particulier des séquences dh et dg de S.pombe qui sont les séquences péricentromériques (Volpe et al. 2002) ; (Verdel et al. 2004). Les séquences péricentromériques transcrites par l ARN Polymérase II forment des transcrits double brin (ARNdb) car ces séquences sont inversée. Ces ARNdb sont pris en charge, comme dans le cas de l ARN interférence, par la ribonucléase Dicer qui va les cliver en siarn de 20 à 25 nucléotides et les incorporer au complexe RITS. Le complexe RITS, à l aide des ARNs guide, va interagir avec les séquences péricentromériques complémentaires et induire la formation de l hétérochromatine via le recrutement de l HMT (Clr4) et Swi6 (Hp1). De plus, chez la levure, le complexe RITS recrute aussi une ARN polymérase ARN dépendante qui permet d amplifier de manière post transcriptionnelle les siarns. Ceci permet de crée une boucle qui renforce l hétérochomatinisation et sa propagation. 2. Chez l Homme. Très peu ou pas de transcrits des séquences CT et PCT sont détectés en condition normales dans les cellules humaines différenciées (Eymery et al. 2009b). Néanmoins, la transcription sens et anti-sens de ces séquences a été observée dans certaines cellules humaines. Des transcrits sens et anti-sens de séquences centromériques humaines ont été détectés dans le foie embryonnaire et le placenta. Chez l adulte, en conditions normales, une transcription des séquences CT sens et anti-sens a été détectée dans les ovaires et seule une transcription antisens des séquences PCT a été détectée dans les testicules. Dans les cellules tumorales, une accumulation des transcrits CT et PCT sens et anti-sens a été observée dans tous les tissus tumoraux testés sauf dans le cas du cancer du testicule où, au contraire, une perte des transcrits PCT a été observée (Eymery et al. 2009b). Des transcrits de séquences péricentromériques humaines, en particulier Sat III, ont été détectés après un stress cellulaire comme un stress thermique, un stress osmotique, une exposition aux UV-C ou encore une exposition aux métaux lourds (Valgardsdottir et al. 2008). Il a été observé que le taux de ces transcrits change selon le type de stress (UV, choc osmotique ou choc thermique (Eymery, Callanan and Vourc'h 2009a). La taille des transcrits de séquences PCT varie entre 2 et 5 kb (Rizzi et al. 2004). La transcription se fait majoritairement selon une orientation sens (G- riche) néanmoins une faible transcription selon une orientation anti-sens (C- EPHE Banque de Monographies SVT 18

19 riche) a également été détectée dans les cellules ayant subi un stress thermique. 3. Chez la Souris ARNs centromériques : Chez la souris, des transcrits de séquences centromériques de taille variable, comprise entre moins de 1kb jusqu à plusieurs kb, ont été observés dans les cellules non-différenciées. Par contre, dans les cellules différenciées seul une accumulation de transcrits de 120 nucléotides a été observée (Bouzinba-Segard, Guais and Francastel 2006), (Terranova et al. 2005). L accumulation forcée de ces transcrits de 120 nucléotides induit des défauts de ségrégation des chromosomes et de cohésion des chromatides sœurs. Elle induit aussi des modifications des marqueurs épigénétiques au niveau des centromères ainsi qu une mauvaise localisation des protéines essentielles pour la fonction du centromère. Ceci suggère que ces transcrits pourraient jouer un rôle dans l assemblage de l hétérochromatine au niveau des centromères de cellules de mammifères (Bouzinba-Segard et al. 2006). ARNs péricentromériques La transcription des séquences péricentromériques est régulée pendant le développement embryonnaire de la souris ainsi que dans certains tissus de la souris adulte (Rudert et al. 1995). Lu et Gilbert (Lu and Gilbert 2007) ont décrit la transcription des séquences péricentromériques par l ARN polymérase II au cours du cycle cellulaire, dans des cellules de souris de morphologie épithélial. Le plus fort taux de transcription est détecté pendant le début de la phase S ainsi que pendant la mitose. Les transcrits obtenus ont des tailles variables. De petits transcrits de taille inferieure à 200 bases sont observés pendant la mitose. Ils sont rapidement dégradés à la sortie de la mitose car ils ne sont plus détectables 1h après la mitose. Des transcrits de taille hétérogène, de 500 bases jusqu à 2 kb, sont détectés durant la phase G1 tardive. Leur transcription décroit pour devenir nul en fin de la phase S, qui coïncide avec la réplication de l hétérochromatine constitutive. Les ARNs PCT de petites et de grande taille se caractérisent par une demi vie très courte car, 1h après traitement avec un inhibiteur de l ARN polymérase II, les auteurs ont observé une diminution des deux populations de transcrits. Il a été postulé que la transcription des séquences centromériques et péricentromériques, dans une orientation sens et anti sens, pourrait induire la formation d ARN double brin qui comme chez la levure S.Pombe pourrait être reconnu par Dicer. Cependant des transcrits centromériques ou péricentromériques de 20 à 25 nucléotides qui auraient pu être impliqués dans un complexe RITS similaire au système décrit chez S.pombe, n ont, à ce jour, toujours pas été détectés chez les mammifères. 4. Rôle des transcrits péricentromériques chez les mammifères. Bien que la transcription des séquences centromériques et péricentromériques a été mise en évidence depuis quelques années, le rôle de ces transcrits reste mal connu. Le rôle le plus connu est celui décrit chez S.pombe, concernant l hétérochomatinisation (cf chapitre III, 1). A ce jour le rôle des transcrits péricentromériques chez l Homme et la Souris sont de l ordre de l hypothèse. Chez l Homme, la première hypothèse est que les longs transcrits péricentromériques seraient clivés en ARNs de plus petite taille. L accumulation des transcrits de plus petite taille EPHE Banque de Monographies SVT 19

20 pourrait provoquer l inhibition ou la saturation de la machinerie de l ARN interférence (Eymery, Callanan and Vourc h, 2009). La seconde hypothèse est, qu une fois transcrits, ces longs ARN péricentromériques resteraient dans le noyau à proximité des séquences ADN péricentromériques soit pour protéger le locus soit pour régénérer la structure de la chromatine après un stress cellulaire (Eymery, Callanan and Vourc h, 2009). Enfin, une dernière hypothèse concernant les transcrits péricentromériques SAT III qui co-localisent transitoirement avec des facteurs de transcriptions (Jolly et al, 2004) et des facteurs d épissages (Metz et al, 2004) permettraient la séquestration de ces facteurs durant un stress cellulaire (Jolly and Lakhotia, 2006). De manière plus générale, il est suggéré que la transcription des séquences péricentromériques serait un moyen de modifier transitoirement l organisation structurale et fonctionnelle de la chromatine. Chez la Souris, il a été mis en évidence la transcription des séquences péricentromériques sous forme d une population d ARN hétérogène en taille. Des transcrits péricentromériques de grande taille serait présent à partir de la fin de la phase G1 jusqu en début de phase S par contre ceux de petite taille ( 200pb) s accumuleraient pendant la mitose. Ces derniers serviraient à renforcer la structure de l hétérochromatine durant les dernières étapes de la mitose (Lu et Gilbert, 2007). Dans ce cas, quelles seraient les fonctions des ARNs péricentromériques de plus grande taille qui ont été observés associés aux chromocentres pendant tout le cycle cellulaire en dehors de la mitose? A la fin de mon manuscrit je proposerai un rôle structural pour ces transcrits de grande taille vis-à-vis de la distribution de la protéine HP1a mais aussi un rôle possible de ces transcrits dans la régulation du cycle cellulaire. Objectif du travail Dans les cellules proliférantes de souris, la protéine HP1a a une distribution caractéristique dans le noyau sous forme d amas localisés au niveau de l hétérochromatine péricentromérique. Lors d un travail précédent, nous avions mis en évidence au laboratoire une dispersion de la protéine HP1a corrélée à la mise en quiescence des cellules murines NIH 3T3 (Shestakova et al. 2004). L objectif de mon travail était d identifier les mécanismes responsables de la dispersion de la protéine HP1a associée à la quiescence et d étudier la réversibilité du phénomène. HP1a reconnait de manière spécifique, via son «chromodomaine», la forme triméthylée de la lysine 9 de l histone H3 (Bannister et al. 2001a) ; (Lachner and Jenuwein 2002) ; (Nielsen et al. 2002). Dans un premier temps j ai analysé la dispersion de la protéine HP1a vis-à-vis des séquences péricentromériques dans les cellules quiescentes et si cette dispersion était corrélée à des modifications du taux et/ou de la distribution des différentes modifications post traductionnelles. Ceci a été effectué par immunofluorescence couplée à l hybridation in situ ainsi que par immunoprécipitation de la chromatine. Le rôle d un ARN dans l organisation d HP1a en amas avait été suggéré par Maison et al, EPHE Banque de Monographies SVT 20