NOVA Gel TM Sm/RNP S Uniquement pour le Diagnostic In Vitro

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1 NOVA Gel TM Sm/RNP S Uniquement pour le Diagnostic In Vitro Application NOVA Gel TM Sm/RNP est un système de test d immunodiffusion sur plaque pour le dépistage et la détermination semi-quantitative d anticorps anti-sm/rnp, un antigène nucléaire soluble (ENA), dans le sérum humain. La présence d anticorps anti-sm/rnp peut être utilisée conjointement avec d autres tests sérologiques et résultats cliniques afin de faciliter le diagnostic du lupus érythémateux disséminé (SLE) et d autres maladies des tissus conjonctifs associées. Informations concernant le test Le terme «anticorps antinucléaires» (ANA) décrit divers autoanticorps qui réagissent avec les composants des noyaux cellulaires dont l ADN, l ARN et plusieurs protéines et ribonucléoprotéines. 1 Ces autoanticorps sont souvent présents chez des patients atteints de maladies rhumatismales ou des tissus conjonctifs ; en particulier, le SLE. Pratiquement tous les patients atteints de SLE ont une réaction positive aux ANA. Cette sensibilité du diagnostic a donné suite à l incorporation des tests de détection des ANA dans les Critères pour la Classification du lupus érythémateux disséminé lors de la modification de ceux-ci en 1982 par un sous-comité de l association de l arthrite et du rhumatisme (Arthritis and Rheumatism Association). 2 Bien que le test de détection des ANA soit un excellent test de dépistage du SLE (un résultat négatif exclut pratiquement le SLE 3 en évolution), il est loin d être un test spécifique. La tendance actuelle dans le domaine du diagnostic et de la gestion des maladies des tissus conjonctifs est de combiner un test de dépistage des ANA sensible avec des tests de suivi plus spécifiques tels que les tests anti-adn double brin et/ou ENA. Les tests ENA en particulier sont essentiels parce qu ils fournissent des données diagnostiques et pronostiques. Les autoanticorps anti-sm sont extrêmement spécifiques au SLE et, tout comme les anticorps anti-adn double brin, sont assimilés aux anticorps marqueurs. Les anticorps anti-sm ont été ajoutés aux critères du sous-comité de l ARA pour la classification du SLE. 2 Les autoanticorps anti-rnp sont présents chez les patients atteints de SLE ainsi que dans certaines autres maladies des tissus conjonctifs. 1,2,4 La présence d autoanticorps anti-rnp est associée à l évolution relativement bénigne des maladies avec moins de cas de néphropathie alors que chez les patients chez qui l anticorps anti-sm est présent, les cas de néphropathie sont plus courants et affectent le système nerveux central. 5-7 Principe du test L immunodiffusion sur plaque, décrite par Ouchterlony, 8 permet à une solution antigène de migrer passivement à travers une matrice de gel vers l échantillon d un patient et/ou un anticorps contenant des Contrôles. Des puits de forme spéciale creusés dans la matrice de gel servent de réservoirs à partir desquels les solutions d antigène et d anticorps migrent l une vers l autre. Au point d équivalence antigèneanticorps, un arc de précipitation visible se forme dans le gel. L état immunologique d un patient peut alors être défini en observant les motifs créés par les arcs de précipitation adjacents formés dans le gel par un échantillon Contrôle dont la spécificité est connue et un sérum de patient inconnu. La technique de double diffusion peut être utilisée avec une préparation purifiée de Sm/RNP, un échantillon Contrôle d autoanticorps anti-sm ou anti-rnp connu et un sérum de patient censé contenir des autoanticorps anti-sm et/ou anti-rnp afin d obtenir une identité immunologique, une non-identité immunologique ou une identité immunologique partielle. L activité des autoanticorps anti-sm et/ou anti-rnp dans le sérum du patient peut être confirmée si l arc de précipitation rejoint l arc formé par un échantillon Contrôle connu. Une procédure d immunodiffusion sur plaques correcte nécessite l analyse de plusieurs rapports de concentration antigène-anticorps afin d éviter un excès d antigènes ou d anticorps. Un arc de précipitation incorrect ou trompeur peut se former s il y a un excès d antigènes ou d anticorps. Afin d éviter une telle situation, des analyses de dilutions du sérum du patient doivent être comparées à cette préparation d antigènes. Les plaques NOVA Gel «S» ont été conçues de façon à pouvoir accomplir facilement cette 1

2 tâche. Les grands puits hexagonaux sont dimensionnés afin de pouvoir contenir la concentration pure ou 1:1 du sérum du patient ou des Contrôles. Les petits puits rectangulaires, de par leur conception, donnent automatiquement une dilution 1:4 de l échantillon pur du patient. Contenu du coffret 1. Plaques de gel de dépistage Nova Gel «S» à 7 puits, contenant des stabilisateurs et de l azide de sodium 0,09 % 2. 0,4 ml d antigène Sm/RNP (du thymus de veau), lyophilisé dans une solution tampon contenant des stabilisateurs et de l azide de sodium 0,09 % 3. 0,7 ml de Contrôle Sm, sérum humain contenant des autoanticorps anti-sm dans une solution tampon contenant de l azide de sodium 0,09 % 4. 0,7 ml de Contrôle RNP, sérum humain contenant des autoanticorps anti-rnp dans une solution tampon contenant de l azide de sodium 0,09 % Avertissements 1. Tout le matériel d'origine humaine utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé négatif lors de la recherche d'anticorps anti-vih, anti-antigène de surface de l'hépatite B et anti-virus de l Hépatite C à l'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner une garantie complète quant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. Par conséquence, tous les sérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes précautions que celles utilisées pour un matériel potentiellement infectieux L azide de sodium (NaN 3 ) est utilisé comme conservateur. Le NaN 3 est un poison et il est toxique en cas d ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l exposer aux bases, métaux ou autres composants réagissant avec les acides. Après l évacuation des réactifs, laver à grande eau afin d éviter des dépôts dans les canalisations. 3. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle appropriés. 4. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en vigueur concernant l élimination des déchets. Précautions 1. Ce test est destiné au diagnostic in vitro. 2. Toute substitution par d autres réactifs que ceux fournis dans le coffret entraîne des variations de résultats. 3. Il est recommandé d utiliser de l eau distillée stérilisée ou déionisée pour réhydrater l antigène. 4. Divers facteurs influencent la performance de l analyse. Ils comprennent la température de départ des réactifs, le fait d empêcher les réactifs ou échantillons des patients de déborder des puits et la qualité de l eau utilisée pour réhydrater l antigène. Une attention particulière à l uniformité des choix est nécessaire pour obtenir des résultats exacts et reproductibles. 5. Il est recommandé de suivre exactement le protocole. Conditions de conservation Conserver toutes les trousses de réactifs à une température entre 2 et 8 C. Ne pas congeler. Les réactifs conservés et manipulés suivant les instructions resteront stables jusqu à la date de péremption. Après sa réhydratation, l antigène restera stable pendant une période de 2 semaines à une température entre 2 et 8 C. Au besoin, des aliquots d antigène de 100 μl peuvent être préparés et conservés à < -70 C. Les antigènes conservés dans ces conditions restent stables pendant une période d au moins 1 an. Echantillons Ce test doit être réalisé avec du sérum. L addition d azide ou autres conservateurs aux échantillons peut affecter le bon déroulement de la procédure. Les sérums contaminés par des agents microbiens, prétraités par la chaleur ou contenant des particules visibles ne doivent pas être utilisés. Les échantillons hémolysés ou lipémiques sont à éviter. 2

3 Après prélèvement, le sérum doit être séparé du culot. Le document H18-A2 du NCCLS recommande les conditions suivantes de conservation: 1) Conserver les échantillons à température ambiante pas plus de 8 heures. 2) Si le test ne peut pas être effectué dans les 8 heures, conserver les échantillons à 2-8 C. 3) Si le test ne s effectue pas dans les 48 heures ou si on doit envoyer les échantillons, les congeler à 20 C ou à plus basse température. Bien agiter les échantillons décongelés. Procédure Matériel fourni 8 plaques de dépistage Nova Gel «S» préperforées 2 0,4 ml d antigène Sm/RNP, lyophilisé 1 0,7 ml de Contrôle Sm 1 0,7 ml de Contrôle RNP Autre matériel nécessaire non fourni Micropipettes distribuant un volume de 15 à 100 μl Embouts de micropipettes jetables Sérum physiologique 0,85 % Eau distillée ou déionisée (de préférence stérile) Source de lumière ou boîte de visualisation pour gel Méthode 1. Réhydrater l antigène Sm/RNP Ouvrir avec précaution une ampoule d antigène et ajouter 0,4 ml d eau distillée ou déionisée à l antigène lyophilisé. Il est fortement recommandé d utiliser de l eau distillée ou déionisée stérile afin d assurer une performance maximale du produit. Attendre 5 minutes afin de permettre à l antigène de se réhydrater, puis bien homogénéiser avant utilisation. 2. Remplissage de la plaque de gel Remplir la plaque de gel avec l antigène et les Contrôles (environ 80 μl dans chaque grand puits) tel qu illustré ci-dessous. Chaque échantillon de patient devrait être placé dans un grand puits hexagonal (environ 80 μl) et un petit puits rectangulaire (environ 20 μl) tel qu illustré. Il n est pas absolument nécessaire de respecter des volumes de remplissage exacts ; toutefois, ÉVITER DE FAIRE DÉBORDER LES PUITS. Les puits Contrôles peuvent être remplis à l aide de pipettes en plastique ou de micropipettes. Si des pipettes en plastique sont utilisées, placer l embout distributeur dans le puits et le remplir délicatement jusqu à ce que le niveau du fluide atteigne le haut du puits. Couvrir la plaque immédiatement après l avoir remplie. Remarque: le volume inférieur du puits rectangulaire réduit la concentration locale de l anticorps du patient SANS QU UNE ÉTAPE DE DILUTION DE L ÉCHANTILLON SOIT NÉCESSAIRE. La dilution effective du petit puits est d environ 1:4. Ceci réduit les possibilités de résultats faussement négatifs dus à un excès d anticorps. 3. Incubation Laisser incuber les plaques couvertes à température ambiante sur une surface plate et stable pendant 24 heures. Examiner les plaques et noter tout arc de précipitation qui se forme entre l échantillon du patient et l antigène. Examiner le rapport entre cet arc et l arc de précipitation de l un ou l autre Contrôle. Réexaminer à nouveau les plaques après 48 heures pour vérifier si de nouveaux arcs se sont formés avant d effectuer l interprétation définitive des résultats. 3

4 Contrôle de qualité Les tests des Contrôles Sm et RNP devraient être effectués sur chaque plaque pour s assurer que la procédure ait été exécutée correctement. Des Contrôles supplémentaires peuvent être préparés à partir d un pool d échantillons de sérum humain. Les aliquots devant être conservés à < -70 C. Pour que les résultats des tests soient considérés valides, un arc de précipitation doit être visible entre les puits des Contrôles Sm et RNP et celui de l antigène Sm/RNP. Interprétation des résultats Pour une observation optimale des arcs de précipitation, il est recommandé de suivre la procédure cidessous : 1. Retirer le couvercle de la plaque. 2. Tenir la plaque dans une position qui minimise tout reflet sur la surface du gel. 3. Illuminer la plaque de gel d un côté (à savoir parallèlement à la surface du gel). Remarque : vérifier que la source de lumière n est pas directement visible. 4. Les arcs de précipitation sont plus visibles lorsqu ils sont en contraste sur un fond foncé et visualisés sous un certain angle. 5. Une loupe peut s avérer utile pour l observation des arcs à peine visibles ou la distinction des échantillons de non-identité. Réaction négative. Un échantillon sera considéré négatif si, au bout de 48 heures, aucun arc de précipitation visible ne s est formé entre les puits du patient et le puits de l antigène. Interprétation de la spécificité. Lors d une immunodiffusion sur plaque, la spécificité est définie en notant le rapport entre les arcs de précipitation des échantillons et les arcs Contrôles connus. Les possibilités suivantes existent avec le test NOVA Gel TM Sm/RNP : Figure 1 : Non-identité Fig. 2 : Identité Sm Fig. 3 : Identités Sm et RNP L arc de précipitation du patient 1 croise ou indique une non-identité avec les Contrôles Sm et RNP. Ceci indique que le patient a réagi à un antigène ENA autre que Sm ou RNP. L arc de précipitation du patient 1 rejoint ou indique une identité avec l arc du Contrôle Sm. Dans ce cas, des autoanticorps anti-sm sont présents chez le patient. Voir le numéro 5 de la section intitulée «Restrictions de la procédure». Le patient 1 a deux arcs de précipitation. L un des arcs indique une identité avec le Contrôle Sm et l autre, une avec le Contrôle RNP. Des autoanticorps anti-sm et anti- RNP sont présents chez ce patient. Limites du test 1. L interprétation des résultats peut être difficile si plusieurs arcs de précipitation se sont formés. Dans de tels cas, il est recommandé de répéter le test de l échantillon à une dilution de 1:2 ou 1:4 dans du sérum physiologique, en plaçant chacune des dilutions dans un puits hexagonal et un puits rectangulaire plus petit. Ceci résulte dans une dilution de 1:8 ou 1:16 respectivement dans le puits rectangulaire plus petit. La dilution de l échantillon peut éliminer les arcs à peine visibles ou écarter les arcs les uns des autres, rendant ainsi l interprétation plus facile. 4

5 2. Bien qu il soit peu probable dans ce test vu la géométrie unique du puits, l effet de prozone peut se produire. L effet de prozone se produit lorsqu une quantité massive d autoanticorps du patient est présente, comparée à l antigène (excès d anticorps), entraînant la formation de l arc de précipitation sur la face du puits de l antigène. Dans de tels cas, il est recommandé de répéter le test des échantillons positifs à une dilution de 1:2 ou 1:4 dans du sérum physiologique afin d éviter une interprétation faussement négative du test. 3. Si de l eau non-stérile ou contaminée est utilisée pour réhydrater l antigène, ce dernier risque de se dégénérer immédiatement ou progressivement. Ceci pourrait résulter dans un arc de précipitation à peine visible ou l absence d un arc. 4. Le Contrôle Sm n est pas monospécifique et peut contenir une certaine quantité de RNP. Le Contrôle Sm aura une identité partielle chez un patient ou un Contrôle RNP. 5. Un éperon dirigé vers le puits du Contrôle RNP peut-être observé dans le cas d un sérum qui affiche une identité avec le Contrôle Sm. Ceci pourrait indiquer la présence d anticorps anti-rnp dans le sérum anti-sm du patient. 6. Les résultats obtenus à l aide de ce test devront être corrélés avec les signes cliniques et d autres tests sérologiques. 7. Les performances du coffret pour les échantillons autres que les sérums n ont pas été établies. Performances Le test NOVA Gel TM Sm/RNP d immunodiffusion sur plaque a été utilisé afin d évaluer plusieurs patients atteints de maladies des tissus conjonctifs ainsi que 200 donneurs de sang choisis au hasard. Les résultats sont fournis ci-dessous : Groupe de patients Nombre Nombre de tests NOVA Gel ENA positifs Sm Positif RNP Positif SLE Lupus d origine médicamenteuse Arthrite rhumatoïde Sclérodermie Dermatomyosite Syndrome de Sjogren Normaux Références 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Reichlin M, Maddison PJ. Soluble tissue autoantigens which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In Immunopathology of the Skin, 2nd ed. (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds) John Wiley and Sons, NY, pp , Reichlin M, Mattioli M. Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 286: , Barada FA, Andrews BS, Davis JS, Taylor RP. Antibodies to Sm in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 24: , Winn DM, Wolfe JF, Lindberg DA, Fristoe FH, Kingsland L, Sharp GC. Identification of a clinical subset of systemic lupus erythematosus by antibodies to the Sm antigen. Arthritis and Rheumatism 22: ,

6 8. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) ). Fabricant: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Représentant Autorisé: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service December 2007 Revision FRA13 6