Approche pratique d un développement de Waters Corporation 1
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- Bertrand Chaput
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1 Approche pratique d un développement de méthode éh en LC-MS 2015 Waters Corporation 1
2 Développement de méthode Méthodes clef en main LC-MS Création de méthodes MRM : bibliothèque, infusion de standards Méthode LC : Transfert de méthode HPLC > UPLC Méthode MRM : nombre de points/pic et fenêtre de temps Evaluation de la robustesse de la méthode; effet matrice; efficacité de la préparation d échantillons Vérification des résultats Carte de contrôle / suivi Contrôle des performances du système 2015 Waters Corporation 2
3 Développement de méthode LC/MS : 1- Méthode clef en main QUANPEDIA Méthodes clef-en-main incluant : méthode Inlet méthode MRM méthode de quantification (TargetLynx) Base de données avec plusieurs dizaines de méthodes disponibles 2015 Waters Corporation 3
4 Développement de méthode LC/MS : 1- Méthode clef en main Définir dans quel projet seront créées les méthodes et Sample lists Définir sous quel nom seront sauvegardées les méthodes et Sample lists 2015 Waters Corporation 4
5 Développement de méthode LC/MS: 1- Méthode clef en main - QUANPEDIA Création de la sample list avec les méthodes d acquisitions Waters Corporation 5
6 Développement de méthode MRM : 2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque Bibliothèques contenant plusieurs centaines de composés. Plusieurs MRM par composés avec les tensions de cône et énergies de collision optimales Waters Corporation 6
7 Développement de méthode MRM : 2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque Composés peuvent être triés par groupe Donner un nom à la méthode MRM, la localisation et la durée d acquisition 2015 Waters Corporation 7
8 Développement de méthode MRM : 2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque Fonctions MRM sur toute la durée du run, pas de temps temps de rétention pour les composés, pas de méthodes Inlet associées 2015 Waters Corporation 8
9 Développement de méthode MRM : 3- Intellistart : sample tune and develop method Possibilité d optimiser jusqu à 4 molécules en simultané. Possibilité d optimiser en ESI+ et ESI- Jusqu à 5 transitions par composé Waters Corporation 9
10 Développement de méthode MRM : 3- Intellistart : sample tune and develop method Résultats obtenus avec l optimisation Intellistart (Exemple pour la rifampicine) Tableau de résultats pour chaque composé Edition automatique de la méthode MRM d acquisition Représentation graphique de l optimisation en MS et MS/MS pour chaque composé (graphiques + spectres MS et MS/MS 2015 Waters Corporation 10
11 Développement de méthode LC : 4- Acquity column calculator Nouveau Columns Calculator De l HPLC à UPLC et inversement Accessible Possibilité de copier coller Pré-injection volume et Gradient Smart Start Pour tenir compte de la différence de volume mort des systèmes Nouveaux Method Transfer Chemistry Kits 2015 Waters Corporation 11
12 Transfert HPLC > UPLC 2015 Waters Corporation 12
13 Développement de méthode : Autodwell 5- Méthode éh Personnalisée par paliers de temps Sélection des composés, définition de leur temps de rétention, création d un méthode par palier de temps Auto Dwell : Temps d acquisition pour chaque transition (Dwell Time) calculé automatiquement en fonction de la largeur des pics en secondes et du nombre de points désirés Waters Corporation 13
14 Développement de méthode: colonne/gradient 6- Modification des Temps de rétention Sélection d une analyse Correction manuelle des temps de rétention (après injection dans les nouvelles conditions d analyses) Correction automatique des temps de rétention à partir d une donnée brute acquise dans les nouvelles conditions d analyses danalyses 2015 Waters Corporation 14
15 Développement de méthode: QUANPEDIA 6- Modification des Temps de rétention rentrer seulement 2 nouveaux Tr, les autres sont calculés par extrapolation linéaire Modification automatique de la méthode MRM Modification automatique de la méthode de quanti 2015 Waters Corporation 15
16 Développement de méthode: 7- Evaluation de l effet matrice : Mode RADAR Electronique rapide : instrument switch entre e MRM et full scan < 0.003s; 003s durée du Full scan env 0.05s Pas de perte de la qualité du signal MRM (même intensité) Informations additionnelles accessibles o o o o Monitore la matrice Possibilité de visualiser les interactions de la matrice Information pour l optimisation de la préparation d échantillon Recherche h de composés significatifs f non-ciblés en MRM MRM Full scan 2015 Waters Corporation 16
17 Développement de méthode: 7- Evaluation ation de l effet matrice : Mode RADAR Full Scan MS Standard MS ESI+ Eau rivière MRM Full Scan MS Eau milliq MS ESI+ Eau rivière L acquisition simultanée en Full Scan MS permet de visualiser la présence d autres produits non dosés, de pics de matrice interférents, de pollution et d extraire les spectres MS correspondants. Il peut également permettre de détecter la formation éventuelle d adduits. Ici, on voit que l essential de la matrice s ionise de 0.3 à 1minute : l effet matrice sera plus important pour les composés élués à ce moment-là Waters Corporation 17
18 Développement de méthode: i d RADAR 7- Comparaisont PPT vs SPE: Mode Protein precipitation Background ms scan 2.44e8 Protein precipitation Monitor Alprazolam MRM 309-> e Waters Corporation SPE Background ms scan 2.61e7 SPE Monitor Alprazolam MRM 309-> e6 18
19 Développement de méthode: 7- Evaluation ation de l effet matrice : Mode RADAR MS V(reprise)=200µL Extrait serum V(reprise)=600µL MRM Beaucoup de composés présents dans la matrice s ionisent en ESI+ et peuvent induire un effet matrice. La dilution de la matrice (augmentation du volume de reprise), permet de minimiser ce phénomène éventuel, si la sensibilité du spectromètre le permet. Extrait salive Les profils matriciels peuvent être comparés avec les acquisitions en Full scan. Beaucoup plus de composés s ionisent en ESI+ dans l extrait sérique. Ces informations aident au développement de méthode et interprétations des résultats Waters Corporation 19
20 Vérification et suivi des résultats 1- TargetLynx TargetLynx (inclus dans MassLynx) est un logiciel de quantification automatique avec critères de contrôle qualité et qui permet de surligner automatiquement les évènements ci-dessous : Rapport d ions de confirmation (jusqu à 4) hors tolérance, avec possibilité de compensation des variations expérimentales. Rapport S/N inférieur au seuil minimum. Temps de rétention (absolus ou relatifs) hors tolérance. Réponse des QC hors tolérance. Produit au dessus de la limite maximum (MRL). Coefficient de détermination inférieur au seuil minimum. Réponse du blanc supérieure au seuil maximum Pourcentage de recouvrement hors tolérance Waters Corporation 20
21 Vérification et suivi des résultats 1- TargetLynx La Browser de TargetLynx peut être personnalisé. Sommaire TargetLynx Sommaire relatif aux critéres de ciblage et de confirmation Les points n étant pas conformes aux critéres définis dans TargetLynx apparaissent en Rouge avec une explication. Courbes de Calibration Chromatogrammes intégrés 2015 Waters Corporation 21
22 Vérification et suivi des résultats 1- Trenplot : Courbes de tendance et statistiques 2015 Waters Corporation 22
23 Vérification et suivi des résultats 1- Trenplot : Courbes de tendance et statistiques Fichier évolutif; updaté avec les derniers résultats obtenus Calcul statistique : moyenne, 2SD, 3SD, CV, RSD. Possibilité de sauvegarde, impression, copy/paste Affichage possible de tous les différents paramètres calculés dans le fichier Targetlynx, 2015 Waters Corporation 23
24 Contrôle et vérification des performances 1- Intellistart L utilitaire IntelliStart TM, inclu dans le logiciel, permet l automatisation totale : Des diagnostiques. De l étalonnage en masse. De la détermination des paramètres de Tune. Du développement de méthodes. Du contrôle des performances (injection de QC) Waters Corporation 24
25 Contrôle et vérification des performances 2- Intellistart : System Check Injection d un dun standard référent pour contrôler les performances du système LC/MS Contrôle des paramètres de séparation LC et de détectionti MS Lancement manuel du LC/MS System Check ou programmation automatique Sauvegarde des rapports de tests 2015 Waters Corporation 25
26 Contrôle et vérification des performances 2- System Check Spécifications et Tolérances requises pour que le test soit validé Définir la fréquence du test Rapport Automatique Vérifie le bon fonctionnement de l instrument (par injection d une molécule l référence): Sensibilité, Répétabilité ét des aires, des hauteurs, des temps de rétention Waters Corporation 26
27 Développement de méthode Méthodes clef en main LC-MS.QUANPEDIA Création de méthodes MRM : bibliothèque, infusion i de standards d.quanpedia, INTELLISTART Méthode LC : Transfert de méthode HPLC > UPLC.CONVERTISSEUR Méthode MRM : nombre de points/pic et fenêtre de temps QUANPEDIA Evaluation de la robustesse de la méthode; effet matrice; efficacité de la préparation d échantillons.radar Vérification des résultats.targetlynx Carte de contrôle / suivi TRENPLOT Contrôle des performances du système.intellistart 2015 Waters Corporation 27
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