de l'enzyme qui sont impliqués dans la fixation du substrat. La très faible activité (NAG)

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1 MÉCANISMES ENZYMATIQUES - LYSOZYME Le lysozyme est une enzyme qui digère la paroi cellulaire des bactéries, en coupant le lien glycosidique β(1 4) entre une molécule d'acide N-acétylemuramique (NAM) et une molécule d'acide N-acétyle-glucosamine (NAG), d'une chaîne de polysaccharides NAM-NAG Structure du polysaccharide NAG-NAM alternant constituant de la paroi de la cellule bactérienne, montrant le site de clivage du lysozyme. La coupure se fait entre le carbone 1 de NAM et le carbone 4 de NAG. Le lysozyme peut aussi couper un polysaccharide naturel (chitine) ou synthétique (poly NAG). Le lysozyme est une protéine de 14.6 kda, constituée de 129 acides aminés. La structure du lysozyme a été déterminée par cristallographie, en absence et en présence d'un inhibiteur compétitif. Ceci a permis de confirmer l identité des résidus Composé kcat (s -1 ) de l'enzyme qui sont impliqués dans la fixation du substrat. La très faible activité (NAG) envers les premiers trois substrats du 2 2.5x10-8 lysozyme permet à NAG 3 d agir comme un (NAG) 3 8.3X10-6 inhibiteur compétitif et donc de confirmer l endroit du site actif voir la liaison de (NAG) 4 6.6x10-5 NAG3 au lysozyme et la disposition du site actif sur la page suivante. (NAG) (NAG) *(NAG-NAM) * k cat change très peu à partir d une longueur de six cycles NAG 3 occupe la moitié du site actif et interagit avec les acides aminés Asp101, Trp62, Trp63, Ala107 et Asn59 par des liens hydrogènes et par des contacts hydrophobes voir la figure page suivante droite. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 1/9

2 Glu35 Asp52 Crevasse du site actif Cycle D en conformation demi-chaise Coupure par le lysozyme PDB 1HEW Le site de clivage, situé entre les sucres D (NAM) et E (NAG) du substrat (NAG- NAM) 3, a été déterminé par l étiquetage radioactif. En présence d'eau radioactive (H 2 18 O), le lysozyme coupe le lien D-E en laissant l'oxygène radioactif ( 18 O) sur le carbone C 1 du sucre D, indiquant que le clivage se produit entre le carbone 1 du sucre D et l'oxygène du lien glycosidique. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 2/9

3 Une étude cristallographique en incubant des cristaux de lysozyme avec le chitohexose, NAG 6 (voir tableau page 1), a corroboré les résultats de l étude structurale avec NAG 3 et a démontré que le lysozyme est actif dans l état cristallin en clivant le substrat entre cycle D et E. Les produits restent attachés à l enzyme, les sucres E et F interagissent avec les acides aminés Gln57, Asn44, Phe34, Asn37 et Arg114. Glu35 Chitohexose clivé Asp52 PDB 1LZS L étude cristallographique montre également la présence de deux acides aminés, Asp 52 et Glu 35, à proximité du C 1 hydroxyle naissant du sucre D candidats potentiels pour agir comme donneur de proton (catalyse acide). Cependant, Glu35 est dans un environnement non-polaire et se retrouve probablement sous forme protonée alors qu Asp52 se retrouve dans un environnement polaire et est probablement ionisé. Donc, Glu35 est le plus probable d agir comme le donneur de proton. Dans une étude de modelage moléculaire où on a positionné les sucres dans le site actif avant clivage, le sucre D doit être déformé sous forme demi-chaise pour entrer dans le site actif voir la figure gauche montre les interactions du site actif avec le substrat. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 3/9

4 MÉCANISME CATALYTIQUE L hydrolyse non enzymatique La réaction catalysée par le lysozyme, l hydrolyse d un glycoside, correspond à la conversion d un acétal en un hémiacétal. L hydrolyse non enzymatique d acétal est une réaction catalysée par un acide qui fait intervenir la protonation d un atome d oxygène du substrat suivie par la rupture de sa liaison C-O voir schéma réactionnel. Il s ensuit la formation d un carbocation stabilisé par résonance, appelé ion oxonium. Afin d atteindre un recouvrement d orbitale maximum, et ainsi la stabilisation par résonance, les groupes R et R de l ion oxonium doivent être coplanaires avec les atomes C, O, et H (assistance stéréo-électronique). L ion oxonium est ensuite hydraté pour donner l hémiacétal et régénérer le donneur de proton. Les groupes catalytiques d une enzyme qui catalyse l hydrolyse d un acétal devraient donc être un catalyseur acide potentiel et possiblement un groupe qui en plus, stabilise un intermédiaire de type ion oxonium. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 4/9

5 Le modèle de catalyse enzymatique suggéré par Phillips Le substrat se fixe au site actif en déformant le sucre D. Glu35 transfère son proton à l'oxygène du lien glycosidique. Ceci provoque la coupure du lien et la formation d'un intermédiaire chargé positivement, le carbocation (ou l'ion oxonium) sur C 1. L état de transition de l ion oxonium du cycle D dans la réaction par le lysozyme et stabilisé par résonance. Cela implique que les atomes C 1, C 2, C 5, et O 5 soient coplanaires (ombré) et que le cycle hexose prenne la conformation demi-chaise. Vu que le carbocation est stabilisé par résonance afin de maximiser le recouvrement des orbitales, il adopte par conséquent une conformation demi-chaise dans son état de transition voir figure. La distorsion en demi-chaise du sucre D par l'enzyme facilite le clivage puisque cette conformation ressemble l'état de transition du substrat, l'ion oxonium (Catalyse par stabilisation de l'état de transition). Asp52, ionisé, permet la stabilisation de l'ion oxonium par les interactions électrostatiques. les sucres E-F sont relâchés. Il y a rétention de configuration par le fait qu un côté de l'ion oxonium est bloqué d'accès au solvant par le site actif. La réaction inverse se produit en présence d'eau, pour libérer les sucres A-B-C-D et régénérer Glu35 protoné. - voir la figure sur page suivante résumant le mécanisme proposé par Phillips. Les éléments critiques du modèle sont: La catalyse en milieu acide, ce qui garde Glu35 sous forme protonée La formation d'un intermédiaire carbocation (oxonium) est suggérée par deux facteurs. 1) la présence de Asp52 stabilisant l'ion oxonium (facteur électrostatique) 2) la distorsion du sucre D (facteur géométrique). BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 5/9

6 Les supports expérimentaux au modèle sont de plusieurs types. a) Le patron de clivage (NAG 6 NAG 4 + NAG 2 ), b) l'affinité d'association du substrat au site actif, c) les analogues de l'état de transition, d) la dépendance au ph et e) les modifications sélectives des acides aminés de l'enzyme sont autant d'expériences qui tendent à prouver le modèle. Critiques du modèle : Mécanisme de Phillips 1) L hydrolyse de la liaison glycosidique entre les cycles D et E du substrat se fait après protonation de l atome d oxygène du pont par Glu 35. 2) L ion oxonium du cycle D résultant est stabilisé par la proximité du groupe carboxylate de l Asp 52 et par la déformation induite du cycle D par l enzyme. 3) Une fois que les cycles E-F sont libérés, l eau du milieu fournit à la fois un ion OH - qui se combine avec l ion oxonium et un H + qui reprotonne le Glu 35. NAc symbolise le substituant N- acétylamino au carbone C 2 de chaque glucose. Les évidences expérimentales indiquent l existence d un intermédiaire covalent qui n est pas prévu dans le mécanisme de Phillips mais qui est conforme à un mécanisme proposé par Koshland. Les preuves expérimentales sont : 1) Données cinétiques, obtenues à partir des expériences utilisant des substrats isotopiques, indiquent un changement de l état d hybridation du carbone C 1 du sucre clivé suite au clivage. Ce carbone fait une transition entre un état d hybridation sp 3 indiquant un intermédiaire covalent sur l enzyme et un état sp 2. De plus, le carbocation (oxonium), hybridé sp 2 sur le C 1, n a pas une demi-vie de longue durée, typiquement elle est très courte ~ secs légèrement plus long que le temps de vibration pour une liaison, ce qui est cohérent puisque étant l état de transition. Dans le mécanisme de Phillips, l ion oxonium représente un intermédiaire de longue durée. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 6/9

7 2) Démonstration par spectrométrie de masse de la formation d un intermédiaire portant un masse moléculaire supérieure au lysozyme à partir des études : a) avec l enzyme portant la mutation de Glu 35 Gln (E35Q) afin de ralentir la réaction b) avec des analogues de substrats, NAG2F et NAG2FGlcF effet de déstabilisation inductive du carbocation par le fluor. Spectre de masse du lysozyme de poulet (HEWL) et ses complexes. a. HEWL native b. HEWL mutée (E35Q) incubée avec NAGF c. HEWL incubée avec NAG2FGlcF d. HEWL (E35Q) incubée avec NAG2FGlcF. La figure montre la structure de chaque espèce correspondante aux pics observés ainsi que leur poids moléculaires attendus. 3) La structure cristallographique montrant la formation d un complexe Lysozyme incubé en présence de NAG2FGlcF PDB 1H6M BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 7/9

8 covalent entre Asp 52 de l enzyme et l analogue NAG2FGlcF. Les faits essentiels du modèle révisé sont : 1. Le sucre D du substrat subit une distorsion en conformation demi-chaise, 2. La protonation de l oxygène du carbone C 1 du sucre D par Glu 35 et la rupture de la liaison entre le sucre D-E 3. La migration électrophile du carbone C 1 dans la liaison vers le nucléophile catalytique, Asp 52, ainsi formant un intermédiaire covalent, 4. Décomposition de l intermédiaire covalent vers un état de transition de type carbocation (oxonium), 5. Activation par Glu 35 d une molécule d eau et l attaque nucléophile de cette dernière au carbone C 1 libérant ainsi les sucres A-B-C-D du site actif. Le mécanisme révisé, trajet réactionnel indiqué par les flèches en rouge, donne en effet raison au deux mécanismes catalytiques proposés. Les deux voies se relient par l équilibre entre l intermédiaire covalent et celle de l état de transition d ion oxonium. BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 8/9

9 α-amylase mécanisme catalytique La digestion de l amidon, source principale de glucides pour l homme, commence dans la bouche. La salive contient l α-amylase, qui hydrolyse au hasard tous les liens glycosidiques α(1 4) sauf les plus extrêmes et ceux proches de points de branchement. Le mécanisme de dégradation par l α-amylase est similaire à celui du lysozyme. Le mécanisme implique un glutamate qui est le catalyseur acide général dans l hydrolyse acide de l amidon et un résidu aspartate qui joue le rôle d un nucléophile catalytique afin de former l intermédiaire covalent «post-clivage». Contrairement au lysozyme, l α-amylase dépend d une activation par un atome de Cl -. Le site de liaison d un inhibiteur compétitif, acarbose, se situe dans une fente comme le lysozyme. À noter la position du Cl -, son rôle est d augmenter le pka du catalyseur acide qui autrement serait trop bas à cause de la proximité d une arginine. Acarbose Cl - PDB 1CPU BCM 1502 Mécanismes catalytiques Lysozyme Page 9/9