Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus d ouverture stomatique (TP2)

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1 TRAVAUX PRATIQUES de PNV LSV2 1

2 Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus d ouverture stomatique (TP2) Exécution et montage des coupes anatomiques 1. Exécution Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l agar à 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion. Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux colorations de ces coupes. 2. Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Les transferts d un milieu vers un autre se font à l aide d un tamis après chaque temps de traitement. 1) eau de javel: 15 min 5) Coloration au Carmin: 10 min 2) rinçage abondant à l eau 6) Rinçage sommaire 3) lavage rapide à l acide acétique : 1-2 min 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 4) rinçage sommaire à l eau 8) Rinçage soigneux et montage sur lame. Résultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes). 3. Montage Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures). Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable. 2

3 Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l aide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier. II. CONSEILS POUR LE DESSIN 1. Généralités Dessiner grand (2/3 d une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple). Respecter les proportions relatives des différentes parties. Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB). Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas. Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le grossissement, etc Dessin général Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe. Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc. Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème, caractéristiques des Monocotylées (voir planche I). Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante). A RENDRE pour le TP2, partie n 1 : 1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d une structure racinaire et d une structure caulinaire. 2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d un organe végétal. 3

4 SYMBOLES UTILISES POUR UN SCHEMA ANATOMIQUE (TP 2) Épiderme cutinisé Phloème (points non alignés) Suber (quadrillage à 90 - ici 3 couches) Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Exoderme, péricycle, hypoderme, périderme, phelloderme (ici une assise) Xylème primaire ou protoxylème (A noircir) Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants) Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées) Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones) Bois hétéroxylé (Eudicotylédones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Cambium et phellogène (assise génératrice) Parenchymes (préciser le type) Collenchyme Sclérenchyme (quadrillage fin à 45 ) Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45 ) 4

5 ETUDE DES PROCESSUS REGULANT L OUVERTURE STOMATIQUE (TP2 SUITE) Epidermes isolés Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prélevées avant l éclairement du phytotron (les stomates sont fermés). A l aide d une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre avec de l adhésif silicone de type Hollister N 7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe). Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mm, KOH 30 mm, MES 10 mm, ph ajusté à 6,5 avec de l acide iminodiacétique. Puis les boîtes sont placées à l obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes, avant l ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de normaliser les valeurs d ouverture stomatique entre les différentes expériences. Ouverture stomatique Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement : Traitement lumineux d une heure sous lampe à lumière froide. Traitement obscurité d une heure supplémentaire (Absence de lumière). Traitement lumineux en présence d acide abscissique à 1µM de concentration finale. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µm de concentration finale. Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope. 5

6 Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure. Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme. Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation. Utiliser l oculaire équipé d une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour l occulaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l occulaire avec l équation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales. La largeur de l ostiole, représentative de l ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60). Pour chaque traitement, l ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. A RENDRE pour le TP2 partie n 2 : 3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du TP, l Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion. 4- Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques. 6

7 Exemple de calcul de l'écart-type : Voici quatre séries de 5 valeurs: Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 8 Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12 Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12 Condition D : 7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous? Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions? Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type (σ) Exemple de calcul : σ A = 7

8 TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I - Principe L ammoniac (NH 3 ) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l azote atmosphérique est immédiatement incorporé sous forme d aminoacides ou d amides. L une de ces dernières, la glutamine, amide de l acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme (tryptophane, histidine, CTP, AMP,...). La glutamine est formée à partir de l acide glutamique par action de la glutamine synthétase: NH 4 + acide glutamique + ATP Mg 2+ glutamine + ADP + Pi La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe de poids moléculaire variant selon les espèces de 500 à 600 KDa. Elle peut également catalyser la formation de γ - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH 2 OH Mg 2+ γ - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi C est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs. La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l assimilation de l azote ammoniacal ; elle permet le transfert d un groupement NH 2 de la fonction amide de la glutamine vers l acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H + 2 glutamate + NAD + Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante. 8

9 II - Préparation de l extrait enzymatique Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26 C en présence de (NH 4 ) 2 SO 4 10 mm) et de KNO 3 (10 mm). Les racines (5g) sont broyées dans un mortier en présence de 7.5 ml de tampon Tris- HC1 (50 mm) ph 7,4 contenant de 1 EDTA (10 mm), du MgC1 2 (10 mm) et du DTT (10 mm). Après filtration sur étamine, la suspension obtenue est centrifugée à rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant obtenu servira à déterminer l activité enzymatique étudiée. III - Activité de la glutamine synthétase 1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate, les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques. - Introduire dans 7 tubes à essais: 0-0,1-0,15-0,2-0,25-0,3 et 0,4 ml d une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mm. - Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mm) ph 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 ml du réactif composé de : - FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.) - Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) (en préparer 6 ml) -HCl 6N (l vol.) Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes. 2 / Détermination de l activité enzymatique Dans un tube à hémolyse, mélanger: - 0,7 ml de tampon Tris-HCl (25 mm) ph 7,4-0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M) - 0,2 ml d ATP (30 mm) -0,1 ml de MgSO 4 (0,5 M) 9

10 - 0,3 ml d extrait enzymatique - Incuber 5 minutes à 25 C. Ajouter alors 0,1 ml de NH 2 OH (1 vol. de NH 2 OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N). - Incuber 15 minutes à 25 C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A. - Réaliser un essai témoin en remplaçant l extrait enzymatique par du tampon (soit 1ml de Tampon). - Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm. - Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine. IV - Etude de la glutamate synthase La détermination de l activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O. à 340 nm correspondant à l oxydation du NADH. 1 / Réalisation de la courbe étalon A partir de la solution de NADH 1 mm, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 µm (Vf= 1,5 ml). Lire directement les D.O. à 340 nm. 2 / Détermination de l activité enzymatique La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante : Tampon HEPES-KOH 200mM, ph8,6 renfermant 10 mm de DTT 1 ml 0,85 ml 1,15 ml 2-oxoglutarate 10 mm 0,2 ml 0,2 ml 0 ml Glutamine 100 mm 0,1 ml 0,1 ml 0 ml Extrait enzymatique 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml NADH 1 mm 0 ml 0,15 ml 0,15 ml 10

11 La réaction démarre par l addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1. Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3. Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine. Conclusions. V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm. Un dosage au réactif de Bradford a été réalisé sur des solutions de BSA à 0-0,25-0, ,5 et 2 mg. ml -1. Les D.O. à 595 nm obtenues après réaction sont présentées dans le tableau suivant : - Gamme étalon BSA (joindre le graphique) Concentration BSA Unité : mg/ml DO mesurée (595 nm) Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.ml -1 ). 2 / Dosage de l extrait enzymatique Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l avoir dilué 10, 20 et 50 fois. Mélanger 10 µl de chacune des dilutions de votre extrait dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H2O (Vf= 1 ml). Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant un tube contenant de l eau comme 0 d absorbance. Déterminer graphiquement la concentration en protéines de votre extrait enzymatique. 11