Lymphocytes B et. DIU Immunologie et biothérapie 18 novembre 2010 Patricia Amé-Thomas

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1 Lymphocytes B et anticorps Unité U917 MIcroenvironnement et CAncer MICA DIU Immunologie et biothérapie 18 novembre 2010 Patricia Amé-Thomas patricia.ame@univ-rennes1.fr

2 Différenciation B dépendante des LT B mémoires (switchés) CD34 pos Zone paracorticale IgG,A,E CD27 pos DC FDC Pro IgM hi /IgD hi CD27 neg ABCB1 neg IgM lo /IgD hi CD27 neg ABCB1 pos T4 CB CD44 lo CD10 pos CD38 pos CC T FH Pre B transitionnels B naïfs Centre germinatif CD138 neg/lo CD20 neg CD38 hi Plasmablastes LB immatures FRC Médulla CD138 pos CD20 neg CD38 hi CD138 pos CD20 neg CD38 hi Plasmocytes long survivants (switchés) Moelle osseuse Plasmocytes Court survivants (non switchés) Ganglions Moelle osseuse Stroma

3 La différenciation B Kurosaki Annu Rev Immunol Tonic + ligand-dependent signal Tonic signal

4 La différenciation B médullaire DC NK Id2, Id3 PLC Pro-B Pré-B B immature CSH Ikaros PU.1 low E2A EBF PAX5 BTK LEF1 IRF4 IRF8 BLNK Notch-1 T PU.1 high GATA-1 PMC

5 La différenciation B Kurosaki Annu Rev Immunol Tonic + ligand-dependent signal Tonic signal

6 L H VH Le BCR VL CL CH1 SS SS Région charnière Région variable Reconnaissance spécifique de l Ag Diversité idiotypique +++ CH2 CH3 CH4 (IgM et IgE) SS SS SS SS S SS SS Zone d ancrage Pas de transduction Ig-α Ig-β SS SS SS Région constante Diversité isotypique (5 classes H, 2 classes L) + Ig-α (CD79a) Ig-β (CD79b) Transduction du signal d activation (domaines ITAM)

7 Gènes codant pour Chaines lourdes chr 14 Domaine variable est le produit de 3 gènes V H D H J H choisis parmi un grand nombre (diversité combinatoire) Région constante codée par un gène Cα1 ou Cα2 IgA Cγ1 à Cγ4 IgG Cδ IgD Cµ IgM Cε IgE Chaines légères κ chr 2 Chaines légères λ chr 22 Domaine variable est le produit de 2 gènes V L J L choisis parmi un grand nombre (diversité combinatoire) Région constante codée par un gène Cκ Cλ1 à Cλ5

8 Chaines lourdes V1 V3 V50 D1 D30 J1 J6 Cµ Cδ Cγ3 5 3 Cα2 ADN germinal V1 V3 V50 D1 J6 Cµ Cδ Cγ3 Cα2 Réarrangement DJ V3 D1 J6 Cµ Cδ Cγ3 Cα2 V3 D1 J6 Cµ Cδ Transcription Réarrangement VDJ Transcrit primaire (ARN) ou V3 D1 J6 Cµ V3 D1 J6 Cδ Epissage alternatif AAA AAA ARNm ARNm Chaîne µ et δ de même spécificité

9 Mécanisme du réarrangement Activation régulée de recombinases RAG 1 et RAG 2 Reconnaissance de séquences spécifiques conservées (RSS) de part et d autre des segments V D et J Imprécision dans la jonction RSS RSS élimination D J RAG Variabilité jonctionnelle D J D J D J Ajout de séquences de façon aléatoire (TdT)

10 La différenciation B médullaire HSC CXCL12 pro-b pre-bi IL7 Gal-1 pre-bii HSC Adapté de Nagasawa, Nat. Rev. Immunol., 2006

11 La synapse pré-b/stroma Stromal cell pre-bii cell pre-bcr Gal-1 integrins ADAM-15 fibronectin Espeli et al., Seminar Immunol, 2006

12 La synapse pré-b/stroma Stromal cell Synapse formation Pre-BCR clustering and signaling pre-bii cell pre-bcr Gal-1 integrins ADAM-15 fibronectin Espeli et al., Seminar Immunol, 2006

13 Différenciation B dépendante des LT B mémoires (switchés) CD34 pos Zone paracorticale IgG,A,E CD27 pos DC FDC Pro IgM hi /IgD hi CD27 neg ABCB1 neg IgM lo /IgD hi CD27 neg ABCB1 pos T4 CB CD44 lo CD10 pos CD38 pos CC T FH Pre B transitionnels B naïfs Centre germinatif CD138 neg/lo CD20 neg CD38 hi Plasmablastes LB immatures FRC Médulla CD138 pos CD20 neg CD38 hi CD138 pos CD20 neg CD38 hi Plasmocytes long survivants (switchés) Moelle osseuse Plasmocytes Court survivants (non switchés) Ganglions Moelle osseuse Stroma

14 Migration des B au sein des OLS Afferent lymphatic vessels Subcapsular sinus FRC MRC FDC Centre germinatif 1. Entrée au niveau des HEV CCL19 CCL21 HEV Zone paracorticale

15 HEV: l entrée des lymphocytes B Interaction T/B-FRC Bajenoff et al. Immunity 2006;25:989

16 Migration des B au sein des OLS Afferent lymphatic vessels Subcapsular sinus FRC MRC FDC Centre germinatif CCL19 CCL21 Zone paracorticale HEV 1. Entrée au niveau des HEV 2. Migration à la recherche de l antigène (FRC, DC, MΦ, MRC)

17 Les FRC: rampe de guidage Interaction T/B-FRC Bajenoff et al. Immunity 2006

18 Capture de l antigène: DC-B Présentation aux lymphocytes T/CMH Présentation aux lymphocytes B

19 Capture de l antigène: DC-B DC pulsées avec HEL + B Tgiques pour BCR spécifique de HEL (MD4) = signal calcique Qi et al. Science 2006;312:1672

20 Le signal BCR migm Ag CD79a-CD79b rafts Lyn Lyn P Lyn P P Syk Cascades multiples Internalisation de l Ag, processing, uprégulation des molécules de costimulation

21 Le signal BCR CD21 (CR2) Ag C3d CD19 CD81 P Lyn P Lyn P P Syk + Cascades multiples Internalisation de l Ag, processing, uprégulation des molécules de costimulation

22 Migration des B au sein des OLS Afferent lymphatic vessels Subcapsular sinus FRC MRC FDC Centre germinatif CCL19 CCL21 Zone paracorticale HEV 1. Entrée au niveau des HEV 2. Migration à la recherche de l antigène (FRC, DC, MΦ, MRC) 3. Interaction avec le T 4. Differenciation extrafolliculaire ou entrée dans le GC (FDC)

23 Migration B après la capture de l'ag Okada et al. PLoS Biol 2005 Zone T-B CD40 CD40L CCR7 EBI2 hi CXCR5 hi EBI2 lo CXCR5 hi Zone extrafolliculaire CXCL13 Centre germinatif

24 La différenciation B dans le GC Maturation de l Ig SHM (nouvelle spécificité) CSR (même spécificité, nouvel isotype) Nécessité TFH FDC Mise en jeu de 5 grands facteurs de transcription Bcl6/Pax5 IRF-4/XBP1/PRDI

25 La sélection B Plexin-B1 FDC CD21/CD32 CD54 Dll1/Jg1 LFA-1 CD106 activated α4β1 CD40 Notch1/2 CD72 B 8D6 CD44 IL-21 IL-4 CXCL13 CD40L T FH HA ICOSL ICOS IL-6, IL-15 (+ sil-15r) HGF (+ HGFA),(BAFF) CXCL13 Clusterin CXCR5

26 Transcriptional regulation B IRF4 NFκB CD40L T FH IL-21 BCL-6 PRDI pstat3 PAX5 BCR signaling: CD19, CD79a, Blk... AID... SHM and CSR: AID XBP1 PC

27 Transcriptional regulation B IRF4 NFκB CD40L T FH IL-21 BCL-6 PRDI pstat3 PAX5 PC XBP1s IL-6 Secretory pathway: increasing in organelle mass (ER, mitochondria, lysosomes) and vesicular trafficking, protein synthesis and folding...

28 Devenir des plasmocytes Homing Dans la moelle osseuse (CXCR4) Dans les muqueuses (CCR10, CCR9) Dans les sites inflammatoires (CXCR3) Survie prolongée IL-6 BAFF/APRIL CD44 CXCL12 d après Tokoyoda et al. Eur J Immunol 2009

29 Mémoire Humorale Plasmocytes long survivants: 0,1 à 1% des cellules de la moelle osseuse ( 10 9 PC et 1000 spécificités) avec une adaptation au répertoire antigénique B mémoires Réponse + rapide, + forte à une nouvelle stimulation Différenciation préférentielle en plasmocytes

30 Réponse T-indépendante IL-6 Zone marginale de la rate DC2 IFN-α - CD27 pos IgM hi IgD lo CD21 hi CD1c pos, mutés - Présents chez les patients CD40/CD40L déficients (T-indépendant, GC-indépendant) TLR9 CpG B de la Zone marginale DC1 BAFF PC Ag encapsulés

31 Généralités sur les Ig Protéines glycosylées synthétisées par les cellules de la lignée B 2 formes Membranaire = BCR et pré-bcr. Rôle dans la différenciation et l activation B Secrétée = Ac. Présents ds le sang et les secrétions. Rôle central dans l immunité humorale. Ac = nouvelle classe thérapeutique (Ag exprimés de façon stable, homogène et spécifique à la surface de l ensemble des cellules tumorales)

32 Structure des Ig Domaines de 110 aa reliés par un pont disulfure

33 IgA dimérique Produite par le plasmocyte Clivage du pigr produit par cellules épithéliales IgA secrétoire IgM pentamérique

34 Domaine variable et diversité Variabilité distribuée de façon hétérogène: 3 domaines hypervariables de 5 à 10aa (CDR) sur chaines lourdes et légères constituent le site d interaction avec l Ag (poche) = paratope CDR1 à 3 Contribution importante de CDR3 à la fixation de l antigène Domaine V généré par les réarrangements des gènes d Ig au cours de la différenciation B (VDJ) puis les mutations au sein du centre germinatif

35 Domaine constant et fonctions effectrices Propriétés IgG IgA IgM IgD IgE Principales caractéristiques Activation du complément voie classique Principale Ig sérique +++ (surtout IgG1 et IgG3) Principale Ig sécrétoire - (voie alterne) Première ligne de défense Rôle mal connu Neutralisation Activation NK Opsonisation /phagocytose Fixation aux PNB et mastocytes Transport épithélial Passage placentaire +++ (surtout IgG1 et IgG3) (sauf IgG2) Rôle dans les infections parasitaires et l'hs type I

36 I Activation du complément Fixation de la fraction C1q entraine l activation de la voie classique Nécéssite une seule IgM ou ps IgG Fixation fractions C3 du complément favorisent la phagocytose par les récepteurs au complément II- Neutralisation IgA et IgG Virus, toxines, bactéries IgA dimériques (stt) et IgM: neutralisation à la surface des muqueuses + passage dans le lait et les secrétions par transcytose (pigr) IgG: passage de la barrière foeto-maternelle par transcytose (FcRn)

37 Ag Lumen IgA secrétoire Protéolyse partielle polyig recepteur IgA dimérique

38 Rôle du récepteur Fc des IgG néonatal (FcRn) Protection du foetus

39 III- Opsonisation/Phagocytose Fixation des Ac sur les pathogènes puis sur les RFc pour internalisation, dégradation +/- présentation aux lymphocytes T Surtout IgG + un peu IgA Peut être augmentée par l activation du complément Reconnaissance accrue via CRs cible phagocyte Reconnaissance moyenne cible phagocyte cible phagocyte Reconnaissance accrue via les R-Fc cible phagocyte - En facilitant la reconnaissance de l Ag par les futures APC, le complément fait le lien immunité innée / adaptative cellulaire Reconnaissance «maximale» via R-Fc + CR

40 IV- ADCC Un des mécanismes de la lyse NK V- Dégranulation des mastocytes et des PNB Mastocytes: dans les tissus / Basophiles: dans le sang Expriment constitutivement le RFcεI: récepteur de forte affinité aux IgE Ont au repos des IgE fixées. Quand réintroduction de l Ag, pontage des Ig membranaires et dégranulation avec libération d histamine et autres médiateurs de l inflammation préformés ou néosynthétisés.

41 RFcγ Spécificité Affinité Signalling Distribution FcγRI (CD64) IgG1=IgG3> IgG4 Pas IgG2 FcγRIIA (CD32a) IgG1=IgG3>> IgG2 Pas IgG4 Forte Faible γ-chain ITAM α-chain ITAM MO, MΦ Inductible sur PNE, PNN MO, MΦ PNN, plaq, LC FcγRIIB (CD32b) IgG1=IgG3>> Faible α-chain MO, MΦ IgG2> IgG4 ITIM B FcγRIII (CD16) IgG1=IgG3>> IgG= IgG4 Moyenne/ Faible γ-chain ITAM MΦ, NK, Tγδ PNE, PNN

42 Anticorps monoclonaux thérapeutiques - cancérologie Recherche de la cible antigénique «idéale» Expression intra et inter-individus par cell tumorales : Importante Membranaire Ubiquitaire par cellules tumorales Spécifique (non exprimée par cellules normales) Propriétés de ces Ac Diffusion dans l organisme Non immunogène Demi-vie importante Fonction : stimulation de l immunité Immunogénicité Demi-vie